Caractérisation phytochimique et activité antioxydante de ... · Ministère de l’enseignement...

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université d’Oran Es-SéniaFaculté des Sciences

Département de Biologie

Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magistère en BiologieOption: Biochimie végétale appliquée

Thème

Caractérisation phytochimique et activité antioxydante

de quelques cultivars de Phoenix dactylifera L.

Présenté par :

Mr. BENGAG Amine

Soutenu le: 2009, devant la commission du jury :

Année 2008-2009

Mr BELKHODJA Moulay Prof. Université d’Oran Es-Sénia Président

Mr CHERITI Abdelkrim Prof. Centre Univ de Béchar Examinateur

Mr MAROUF Abderrazak Prof. Université d’Oran Es-Sénia Examinateur

Mme OUAFI-HARCHAOUI Saida M.C. USTHB Examinatrice

Mme BENNACEUR Malika M.C. Université d’Oran Es- Sénia Rapporteur

A l’Université d’Oran Es-Senia : pour la qualité de la formation reçue, le

soutien matériel et financier.

A Mme BENNACEUR Malika (Maître de conférences à l’Université

d’Oran, Es-Sénia) : J’ai eu le privilège de bénéficier de votre aide tout au long de ce

travail. Je garderai de vous le souvenir d’un maître disponible, toujours à l’écoute.

Merci pour la confiance que vous m’avez accordé ce qui m’a permis de mener à bien

ce travail. Veillez recevoir en retour mes sentiments de profonde reconnaissance.

A Mr MAROUF Abderrezak (Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia) :

Votre souci majeur a été l’aboutissement de ce travail qui a nécessité votre concours

sous toutes les formes. Grâce à vous, nous avons appris la rigueur scientifique et

l’amour du travail bien fait. Puisse le Tout Puissant vous aider à réaliser vos projets

les plus chers et vous accorder longue vie. Respectueusement.

A Mr Belkhodja Moulay (Professeur à l’Université d’Oran, Es-Sénia) : Pour

avoir assuré la présidence du jury de ce mémoire.

A Mr CHERITI Abdelkrim (Professeur au Centre Universitaire de

Béchar) : Pour avoir accepté d’examiner ce travail. Pour son soutien et ses précieux

conseils.

A Mme HARCHAOUI Saida (Maître de conférences à l’USTHB) : Pour

avoir accepté d’examiner ce travail.

A tout le personnel du laboratoire: Pour leur disponibilité et le soutien

moral. Pour l’esprit de collaboration et de courtoisie.

Que tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué directement ou indirectement à laréalisation de ce modeste travail, trouvent ici mes sentiments de profonde gratitude

et de reconnaissance infinie.

Très cordialement.

Au nom de , Le Clément, Le Miséricordieux

« Gloire à Toi ! Nous n’avons de savoir que ce que tu nous as appris. Certes c’est Toi

l’Omniscient, le Sage » : Sourate 2, Verset 32 (Saint Corant).

Prière et bénédictions d’Allah sur le prophète Mohamed,

Paix et Salut sur lui, ainsi que ses compagnons, pour nous avoir apporté une religion

comme l’Islam

A mon père Djelloul: Les mots me manquent pour t’exprimer toute ma

reconnaissance. J’ai toujours trouvé auprès de toi, compréhension et soutien. Tes

prières et tes conseils ne m’ont jamais fait défaut tout au long de mes études. Trouve

à travers ce modeste travail, la récompense de ton affection, de tes sacrifices et de ta

patience.

A ma mère Fatima: Omi, que tes sacrifices, des peines et tes privations

trouvent leur récompense dans l’aboutissement de ce modeste travail qui est aussi le

fruit de ta persévérance, de ton courage et surtout de ta patience. Je voudrais à

travers ce modeste travail, te rendre un hommage mérité et te dire combien je suis

fier de l’éducation que tu m’as donnée. Puisse le Tout Puissant nous accorder de

t’avoir encore longtemps auprès de nous pour que tu puisses bénéficier de l’ombre de

l’arbre que tu as si jalousement protégé et entretenu.

A ma femme, mon fils qui n’est pas encore né et sa famille : Nedjari

Benhadj Ali : A force de courage et de persévérance, j’achève aujourd’hui un travail

qui est aussi le vôtre. Ce travail est le fruit de ton amour, ton soutien moral et tes

encouragements. Que Dieu nous aide à atteindre nos objectifs dans la vie.

A mes frères: Mohamed et Abdelatif : Puisse l’affection, la confiance et la

solidarité qui nous animent rester inébranlables. Fraternellement !

A ma s ur : Hakima, et son marie Mohamed : Vous m’avez beaucoup

soutenu à travers vos conseils, vos encouragements. Trouvez à travers ce modeste

travail, l’expression de ma profonde reconnaissance et le témoignage de mon profond

respect.

iii

Lexique des abréviations et symboles chimiques

AcOHAcOEtADNAlCl3BHACCMCHCl3cmDODPAPDPPHDROE.SFAOFeCl3GPXGSHH2O2HClHCOOHHIVIC50INRAMeOH mlmnNADPHNaOHNaNO2NONOSnmO2-

O2ONOO-

R2

RfSODT °CUVv/v%µgµl

: Acide Acétique: Acétate d’éthyle: Acide Désoxyribonucléique: Chlorure d’aluminium: butylhydroxyanisole: Chromatographie sur Couche Mince: Chloroforme: centimètre: Densité Optique: acide diphénylaminophosphorique: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl: Dérivées réactives de l’oxygène: erreur standard: Food agriculture organisation: Chlorure ferrique: glutathion péroxydase: glutathion: Péroxyde d’hydrogène: Acide chlorhydrique: Acide formique: Virus de l’Immunodéficience Humaine: Concentration inhibitrice à 50%: Institut National de Recherche Agronomique: Méthanol: millilitre: minute: nicotinamide adénosine dinucléotide phosphate (sous sa forme réduite): Hydroxyde de sodium: Nitrate de sodiumOxyde nitrique ou monoxyde d’azote: Synthase de l’oxyde nitrique: nanomètre: Anion supéroxyde: Oxygène moléculaire: Peroxynitrite: Coefficient de corrélation: Facteur de rétention: Superoxide dismutase: température en degré Celsius: Ultra-violets: Volume par volume: pour cent: Microgramme: Microlitre

iv

Liste des figures

Figure 1 : Vue d’ensemble du Ph nix dactylifera L…………………………………… 4

Figure 2 : Vue d’ensemble du Ph nix canariensis L…………………………………… 4

Figure 3 : Vue d’ensemble du Chamaerops humilis L………………………………….. 4

Figure 4 : Les différentes parties aériennes et souterraines du palmier dattier………….. 5

Figure 5 : Distribution du palmier dattier en Algérie…………………………………… 6

Figure 6 : Structure de quelques composés phénoliques………………………………... 17

Figure 7 : Synthèse de différentes classes terpéniques chez les plantes………………… 18

Figure 8 : Déséquilibre de la balance entre antioxydants et pro–oxydants……………... 23

Figure 9 : Mécanismes de détoxification cellulaire……………………………………... 25

Figure 10 : Principaux composés naturels possédant des propriétés antioxydantes……… 26

Figure 11 : Piégeage des radicaux libres (R°) par les flavonoides………………………. 27

Figure 12 : Prélèvement de pennes de palme de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.).. 31

Figure 13 : Nettoyage des folioles pennes de palmier dattier (Phoenix dactylifera L…… 32

Figure 14a : Broyage des pennes de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.)…………….. 32

Figure 14b : broyeur à billes................................................................................................... 32

Figure 15 : Extracteur sous reflux………………………………………………………... 33

Figure 16 : lyophilisateur Virtis…………………………………………………………... 33

Figure 17 : Extracteur de type Soxhlet…………………………………………………… 34

Figure 18 : Spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-BEAM spectrophotometer). 39

Figure 19 : Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux (A-

H)………………………………………………………………………………. 41

Figure 20a,

20b

: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation des extraits

aqueux des Arecaceae étudiées……………………………………….. 47

Figure 21a,

21b

: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu des extraits

aqueux des trois Arecaceae étudiées…………………………………………. 48

Figure 22 : Flavonoides observés à 365nm sous UV des extraits aqueux des trois

Arecaceae étudiées…………………………………………………………….. 49

Figure 23 : Chromatogramme des aglycones des flavonoides observés à 365nm sous UV

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées………………………... 51

Figure 24 : Sucres observés après révélation au DPAP des extraits aqueux des trois


Figure 25 : Mise en évidence des Tanins par réaction en tube des extraits aqueux des

v

trois Arecaceae étudiées……………………………………………………….. 52

Figure 26 : Courbe d’étalonnage des polyphénols totaux réalisés à l’aide de l’acide

gallique…………………………………………………………………………. 53

Figure 27 : Histogramme représentant la quantité des polyphénols totaux par ordre

décroissant, exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des


Figure 28 : Courbe d’étalonnage des flavonoïdes réalisée à l’aide de la catéchine………. 55

Figure 29 : Histogramme représentant la quantité des flavonoides par ordre décroissant,

exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des Arecaceae

étudiées…………………………………………………………………………. 57

Figure 30a : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie des extraits aqueux

des trois Arecaceae étudiées…………………………………………………... 58

Figure 30b : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie des extraits aqueux

des trois Arecaceae étudiées…………………………………………………... 59

Figure 31 : Histogramme représentant les IC50 des extraits aqueux des trois Arecaceae

étudiées…………………………………………………………………………. 61

Liste des tableaux

Tableau 1 : Les principales classes des composés polyphénoliques rencontrés chez les plantes……… 15

Tableau 2 : Structure chimique des alcaloïdes…………………………………………………………. 20

Tableau 3 : Lieux et date de Prélèvement des cultivars de palmiers dattiers…………………………... 30

Tableau 4 : Caractéristiques géographiques et bioclimatiques des sites de prélèvement……………… 31

Tableau 5 : Systèmes d’élution pour la CCM…………………………………………………………. 36

Tableau 6 : Résultats des observations des plaques de CCM avant et après révélation par des

colorations spécifiques pour chaque phytoconstituant……………………………………… 37

Tableau 7 : Caractéristiques des cultivars de palmier dattier d’Adrar…………………………………. 45

Tableau 8 : Tableau récapitulatif de l’analyse qualitative de différents extraits aqueux des trois

Arecaceae étudiées………………………………………………………………………….. 52

Tableau 9 : Analyse quantitative des polyphénols de l’extrait aqueux des cultivars des trois

Arecaceae étudiées………………………………………………………………………….. 54

Tableau 10 : Analyse quantitative des flavonoïdes de l’extrait aqueux des cultivars des trois

Arecaceae étudiées…………………………………………………………………………. 56

Tableau 11 : Dosage des polyphénols et des flavonoïdes des l’extraits obtenus par partage solide

liquide de cultivars de palmiers dattiers……………………………………………………... 57

Tableau 12 : Valeurs des IC50 de l’extrait aqueux des trois Arecaceae étudiées………………………... 60

Tableau 13 : Réactifs chimiques pour la révélation des CCM…………………………………………... 76

TABLE DES MATIERES

vii

Partie bibliographique

Introduction……………………………………………………………………………… 1

Chapitre -I- : Généralités sur les palmiers dattiers

1.Etymologie…………………………………………………………………………….. 42. Position systématique………………...…………………………………........……… 43. La morphologie du palmier dattier……………………………………...……………. 44. Origine et répartition géographique…………………………………………………... 5

4.1. Origine…………………………………...…………………………………......... 5 4.2. Répartition dans le monde……………………………………………………….. 5

4.3. Répartition en Algérie………………………………………………...………... 65. Intérêt et importance des palmiers dattiers…………………………………………… 7

5.1. Ecologique……………………………...………………………………………... 75.2. Economique……………..…………..…………………………………………… 7

5.3. Thérapeutiques et cosmétiques……………………………….………………….. 86. Les marqueurs morphologiques…….…………………………….…………………... 87. Les marqueurs biochimiques et moléculaires…………………….…………………... 10

7.1. Les marqueurs biochimiques……………………………………………….......... 117.1.1. Les isoenzymes…………………………………………………..………… 117.1.2. Les composés flavoniques………………………………..……………..…. 11

7.2. Les marqueurs moléculaires…………………………………………………..…. 12

Chapitre -II- : Les métabolites secondaires

1. Introduction………………………….…………………………………………..……. 142. Familles de métabolites secondaires………………………………………………….. 14

2.1. Polyphénols…………………………………………………………………......... 15 2.1.1. Définition………………..………………………………………………..... 15

2.1.2. Acides phénoliques…..……………………………………………….……. 16 2.1.3. Tannins………………..………………………………………………….... 16

2.1.4. Flavonoïdes………...………………………………………………...….….. 162.2. Terpènes……………………………………………………………………….…. 17

2.2.1. Définition……………………………………..……………………………. 172.2.2. Biosynthèse des terpènoïdes……..…………………………….…………. 18

2.3. Alcaloïdes………………………………………………………………....……... 19 2.3.1. Définition………………………………………………..………….…….... 19

2.3.2. Classification selon la structure chimique………………….……………. 19

Chapitre -III- : Les antioxydants

1. Notion de balance pro/anti-oxydante…………………………………………………. 232. Antioxydants………………………………………………………………………….. 23

2.1. Définition ………………………………………………………………………... 232.2. Neutralisation d'un oxydant……………………………………..……….………. 24

2.2.1. Antioxydants endogènes…………………………………………..………. 242.2.1.1. Système de défense primaire…………………………………..……… 24

2.2.1.2. Système de défense secondaire……………………………..……….. 24

TABLE DES MATIERES

viii

2.2.2. Antioxydants naturels……………………………………………..……...... 252.2.2.1. Vitamine E………………………………………………..………….. 262.2.2.2. Vitamine C………………………………………………..…………… 262.2.2.3. Caroténoïdes………………………………………………..………… 272.2.2.4. Acide alpha-lipoïque………………………………………..………… 272.2.2.5. Flavonoïdes………………………………………………..………….. 272.2.2.6. Tanins ……………………………………………………..………….. 272.2.2.7. Coumarines………………………………………………..………….. 282.2.2.8. Phénols…………………………………………………..……………. 28

Partie pratique

Chapitre -IV-: Matériel et méthodes

1. Matériel végétal et extraction…………………………………………………….…… 30 1.1. Prélèvement du matériel végétal…………………………………………………. 30

1.1.1. Palmiers dattiers……………………………………………………..……... 301.1.2. Autres Arecaceae ……………………………..…………………….…..…. 31

1.2. Séchage et broyage………………………………………………………………. 311.3. Extraction………………………………………………………………………… 32

1.3.1. Extraction sous reflux………………………………………………...…….. 32 1.3.2. Extraction solide-liquide……………………………………………...…….. 342. Analyses phytochimiques…………………………………………………….……….. 34 2.1. Screening phytochimique par CCM……………………………………...……… 34

2.1.1. Principe de la CCM………………………………………...………...…….. 342.1.2. Protocole expérimental………………………………………………..……. 352.1.3. Réactifs de révélation chimique sur CCM………………………………….. 35

2.1.4. Hydrolyse acide……………………………………………..……...….…… 382.1.4.1. Identification des aglycones…………………………..………………. 382.1.4.2. Identification des glucides……………………………..……………… 38

2.1.5. Mise en évidence des tanins……………………..……………………........ 382.2. Dosage des polyphénols totaux…………………………………...……………... 39

2.2.1. Principe…………………………………………………………...…..……. 39 2.2.2. Protocole du dosage…………………………………………..……………. 39

2.3. Dosage des flavonoïdes………………………………………………………….. 403. Activité antioxydante…………………………………………………………….……. 41

3.1. Par bioautographie…………………………………………...…………………... 413.1.1. Principe……………………………………………………………………... 413.1.2. Protocole………………………………………………………………… 42

3.2. Dosage de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH…………………… 424. Analyse statistique……………………………………………………………………. 43

Chapitre -V-: Résultats et Discussion

1. Résultats……………………………………………………………………….. 451.1. Caractéristiques des cultivars prélevés………………………………………..… 451.2. Screening phytochimique des extraits aqueux………………………………..…. 45

1.2.1. Polyphénols……………………………………………………………..….. 461.2.1.1. Les acides phénoliques libres…………………………………….…… 461.2.1.2. Flavonoïdes…………………………………………………………… 46

TABLE DES MATIERES

ix

1.2.1.3. Hydrolyse acide………………………………………………...…... 511.2.1.3.1. Identification des génines……….………………………….….. .. 51

1.2.1.3.2. Identification des glucides…………….………………….……... 51 1.2.1.4. Mise en évidence des tanins…………………………………………... 52 1.2.2. Autres métabolites secondaires…………………………………………….. 53 1.3. Analyse quantitative………………………………………………………...…... 53 1.3.1. Dosage des polyphénols totaux …………………..………………… 53

1.3.2. Dosage des Flavonoïdes…………………………………………………. 55 1.4. Activité anti-radicalaire contre de DPPH par biotaugraphie…………………….. 57 1.5. Dosage de l’activité antioxydante…………..…………………………….……... 58

1.6. Screning phytochimique des extraits aqueux et méthanolique…………………... 592. Discussion……….…………………………………………………………...... 62

Conclusion et perspectives……………………………...……………………………. 66

Références bibliographiques………………….………………………………………. 69

Annexes………………………………………………………………………………….. 76

Résumé :

Le palmier dattier dans les régions arides du monde est la plante la plus importante

tant sur le plan écologique, économique que social. La richesse en cultivars de palmier dattier

existe dans toutes les palmeraies traditionnelles surtout celles du Sud-Ouest algérien mais chacune

possède une composition qui lui est propre. L'identification de ces cultivars repose sur la description

morphologique du fruit et de la graine mais ces descripteurs posent problème.

C’est avec l’objectif de contribuer à l’inventaire des cultivars du Phoenix dactylifera L. par la

recherche des marqueurs biochimiques que nous nous sommes proposés de caractériser les

phytoconstituants des folioles de 20 cultivars de palmier dattier. Un screening phytochimique a été

établi en vue de déterminer la composition en métabolites secondaires de ces cultivars. Les différents

extraits ont été préparés et analysés par la chromatographie sur couche mince qui a permis de mettre

en évidence les substances du métabolisme secondaire tels que les acides phénoliques, les

flavono des et les tanins. Après hydrolyse acide, les aglycones ont été identifiés comme étant la

quercétine et l’isorhamnétine. La partie osidique a été identifiée comme étant le galactose.

Cependant ces métabolites n'ont pas permis d'identifier d'une façon univoque les cultivars testés. Ils

permettent de différencier les deux genres étudiés Phoenix et Chamaerops. Les flavonoïdes et les

polyphénols totaux ont été également dosés. Les résultats montrent aussi une forte activité

antioxydante dans certains extraits aqueux des cultivars de palmier dattier.

Mots clés : Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L. et Chamaerops humilis L., métabolites

secondaires, chimiotaxonomie, Activité antioxydante,

Summary:

The date palm in the arid areas of the world is the most important plant as well on

the ecological, economic level as social. The wealth of cultivars of date palm exists in all

the traditional palm plantations especially those of Algerian South-west but each one has

a composition which is special for him. The identification of these cultivars rests on the

morphological description of the fruit and of seed but these descriptors pose problem.

It is with the objective to contribute to the inventory of the cultivars of the Phoenix

dactylifera L. by the research of the biochemical markers that we proposed to characterize

the leaflets constituents of 20 cultivars of date palm. A screening was established in order

to determine the composition in secondary metabolites of these cultivars. The various

extracts were prepared and analyzed by thin layer chromatography that permits to identify

the phenolic acids, the flavonoids and tannins. After acid hydrolysis, the aglycones were

identified as being quercetin and the isorhamnétine. The osidic part was identified as

being galactose. However these metabolites did not make it possible to identify in a

univocal way the cultivars tested. They make it possible to differentiate the two studied

kinds Phoenix and Chamaerops. The total flavonoids and polyphenols were also

proportioned. The results show also a strong antioxydant activity in certain aqueous

extracts of the cultivars of date palm.

Key words: Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L. and Chamaerops humilis L.,

secondary metabolits, chimiotaxonomy, antioxydant activity.

Introduction

INTRODUCTION

1

Le palmier dattier (Ph nix dactylifera L., famille des Arecaceae) est une

monocotylédone pérenne particulièrement adaptée aux zones arides et semi arides. Il

représente pour les populations des oasis sahariennes une espèce indispensable car il

constitue leur ressource de base, non seulement pour son fruit, la datte mais aussi pour

tous les sous produits dérivés des différentes parties du palmier dattier. En outre, il permet

de bonnes conditions de cultures étagées sous les palmiers comme les arbres fruitiers et

les cultures maraîchères.

L’évaluation et l’identification variétale de ces ressources phoenicicoles

constituent l’une des composantes essentielles d’une gestion rationnelle du patrimoine

ph nicicole.

La caractérisation des cultivars requiert la connaissance d’un grand nombre de

données morphologiques. Ces données décrivent essentiellement les caractères végétatifs

et inflorescentiels du fruit et de la graine qui sont le plus couramment utilisés pour la

détermination variétale.

Ainsi sur l’ensemble des régions phoenicicoles algériennes prospectées, près de

1000 cultivars ont été recensés. La richesse de la diversité existe dans toutes les

palmeraies traditionnelles surtout celles du Sud-Ouest algérien mais chacune possède une

composition “ variétale ” qui lui est propre

Cependant un certain nombre de descripteurs morphologiques utilisés pour la

détermination des cultivars de dattiers ne sont pas stables et dépendent de l’âge des arbres,

du stade de développement phénologique ou des conditions environnementales.

La recherche d’autres marqueurs du type biochimique pour l’identification des

cultivars de palmier dattier a conduit à s’intéresser aux métabolites secondaires, en

particulier aux composés phénoliques très utilisés dans la chimiotaxonomie des végétaux.

Dans ce présent travail, notre objectif majeur porte sur la recherche de marqueurs

biochimiques pour la caractérisation des cultivars algériens de palmier dattier.

On peut se poser alors la question : qu’en est-il de l’identité biochimique des

palmiers, en particulier celle des métabolites secondaires ?

Pour répondre à cette question nous nous sommes proposés de faire une étude sur

les métabolites secondaires sur différents cultivars de palmiers dattiers (Ph nix

dactylifera L.) de la région d’Adrar.

Par ailleurs nous avons travaillé sur deux autres palmacées : Phoenix canariensis

L. et Chamerops humilis L. afin de voir si les marqueurs obtenus sont spécifiques à

l’espèce, au genre ou à la famille.

INTRODUCTION

2

Au-delà de cet objectif, le travail contribuera aussi à mettre en évidence l’activité

antioxydante du palmier dattier comparativement à des substances de référence.

Le travail est constitué de plusieurs chapitres :

- un rappel des travaux sur le palmier dattier.

- une analyse bibliographique portant sur les métabolites secondaires et sur

l’activité antioxydante

- une partie expérimentale décrivant le matériel végétal et les techniques utilisées

- les résultats obtenus et discussions.

Chapitre -I- :

Généralités sur lespalmiers dattiers

Chapitre -I- GENERALITES SUR LES PALMIERS

4

1. Etymologie:

Le palmier dattier est une monocotylédone nommée Ph nix dactylifera par Carl

von Linné en 17531. Ph nix dérive de phoinix, un mot grec pour désigner le dattier.

Dactylifera dérive du grec dactulos qui signifie doigt, en relation avec la forme du fruit.

2. Position systématique:

- Le palmier dattier est une angiosperme monocotylédone de la famille des

Arecaceae (Figure 1), Cette famille est représentée par 200 genres et 2700 espèces

réparties en six familles (Uhl et Dransfield, 1987). Le genre Phoenix est classé dans la

sous famille des Coryphoideae subdivisée en trois tribus. Ph nix reste le seul genre de

la tribu Phoeniceae, il comprend plus d'une douzaine d'espèces qui semblent parfaitement

distinctes selon Barrow (1998).

Des hybrides naturels peuvent être formés par les croisements suivants:

P. dactylifera (Palmier dattier) x P. canariensis (Palmier des Canaries).

P. dactylifera (Palmier dattier) x P. reclinata (Palmier nain).

P. dactylifera (Palmier dattier) x P. sylvestris (Palmier à sucre)

Par ailleurs, nous avons travaillé sur deux autres palmacées (Arecaceae) :

- Ph nix canariensis L. appelé vernaculairement faux dattier. C'est un palmier à

valeur ornementale (Figure 2).

- Chamaerops humilis L. palmier nain ou palmier éventail est aussi une plante

d'ornement (Figure 3).

3. La morphologie du palmier dattier:

C'est un grand palmier avec un stipe de 20 à 30 mètres de haut, portant une

couronne de feuilles ou palmes de 4 à 7 mètres de longueur. Chaque palme est pennée et

les pennes à la base sont transformées en épines (Figure 4). L'espèce est dioïque et porte

des inflorescences mâles ou femelles. La fleur femelle comporte trois carpelles

indépendants dont un seul se développe pour donner la datte (le fruit) (Bouguedoura,

1991).

1 Linné Carl von, 1753. Species plantarum, 2 volumes. Impensis Laurentii Savii

Groupe Spadiciflores

Ordre Palmales

Famille Arecaceae

Sous-famille Coryphoïdaea

Tribu Phoeniceae

Genre Ph nix

Espèce dactylifera L


Ordre Palmales

Famille Arecaceae


Tribu Phoeniceae

Genre Ph nix

Espèce canariensis L


Ordre Palmales

Famille Arecaceae


Tribu Corypheae

Genre Chamærops

Espèce humilis L.

Figure 3: Vue d’ensemble du Chamaerops humilis L.(Photo prise à Misserghine)

Figure 2: Vue d’ensemble du Ph nix canariensis L.(Photo prise à la faculté d’Oran Es-Sénia)

Figure 1: Vue d’ensemble du Ph nix dactylifera L.(Photo prise à Adrar)


5

Figure 4: Les différentes parties aériennes et souterraines

du palmier dattier (Munier, 1973).

4. Origine et répartition géographique :

4.1. Origine :

Le palmier dattier semble avoir été cultivé pour la première fois dans les zones

arides et semi arides chaudes de l’ancien monde situé entre l’Euphrate et le Nil vers 4500

avant J.C (Munier, 1973). Il connut ensuite une extension vers les autres régions du

monde (Wrigley, 1995).

4.2 Répartition dans le monde :

Le palmier dattier est localisé dans les régions, là où les conditions climatiques le

permettent, entre les latitudes 35° Nord et 15° Nord. Sa culture est localisée sur la rive

méditerranéenne de l’Afrique jusqu’au proche- orient, depuis le sud de l’Iran jusqu’à la

côte atlantique de l’Afrique du nord et en Asie

Dès le 18ème siècle, il a été introduit en Amérique, en particulier en Californie. Il

ne vit que dans les déserts chauds et s’étale entre les parallèles Nord 9°18’ (Cameroun) à

39°44’ (Elche en Espagne).

stipe


6

Les plantations les plus récentes et à faible échelle se situent en Argentine, Brésil,

Pérou, Australie et au Niger (Jahiel, 1996), Mali, et Sénégal.

4.3. Répartition en Algérie :

Le palmier dattier se rencontre dans plusieurs oasis réparties sur tout le sud du

pays où le climat est chaud et sec. Sa culture s’étend depuis la frontière marocaine (Ouest)

jusqu’à la frontière Tuniso- libyenne (Est), et depuis l’Atlas saharien jusqu’à Reggane à

l’Ouest, Tamanrasset au centre et Djanet à l’Est.

Les principales régions phoenicicoles (Figure 5) sont:

• A l’Est : les Zibans (Biskra), l’Oued Rhir (entre Ouargla et Touggourt), l’Oued

Souf, la cuvette de Ouargla et le M’zab (Ghardaïa). Ces palmeraies sont

constituées principalement de Deglet Nour, cultivar à très haute valeur

commerciale.

• A l’Ouest : la Saoura (Beni Abbes), le Touat (Adrar), le Gourara (Timimoun), le

Tidikelt (Reggane) et El Goléa. Ces palmeraies comportent un verger très

diversifié. Ces cultivars produisent des dattes, de qualité commerciale très faible.

Figure 5: Distribution du palmier dattier en Algérie (Hannachi et al, 1998).


7

5. Intérêt et importance des palmiers dattiers :

Le palmier dattier dans les régions arides du monde est la plante la plus importante

tant sur le plan écologique, économique et social (Bounaga, 1991).

5.1. Écologique :

Le palmier dattier est l’arbre providence des régions chaudes et désertiques où il

croît. Il permet aux populations de ces régions de vivre et de se maintenir dans des

conditions très sévères.

En outre, le dattier crée des conditions climatiques favorables (protection vis à vis

des vents violents, atténuation de l’ensoleillement par tamisage, le maintien d’un certain

degré d’humidité) à l’implantation de cultures maraîchères, arboricoles ou fourragères

(Toutain, 1979).

Un champignon du sol, le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, provoque chez le

dattier une fusariose (le bayoud) qui entraîne sa mort; cette attaque cryptogamique a fait

disparaître les palmiers dattiers de nombreuses oasis. Le phénomène de désertification

s’est ainsi accentué par un déséquilibre profond des écosystèmes de nombreuses

palmeraies.

5.2. Économique :

La datte constitue la base de l’alimentation des populations oasiennes. Elle est

aussi utilisée comme dessert et elle est soit consommée directement, soit transformée en

produits alimentaires (pâtes, confiture, crème, farine, sirop, vinaigre et alcool de datte).

Les noyaux de dattes servent à l’engraissement du cheptel. Les noyaux concassés

sont utilisés comme reconstituant pour les dromadaires amaigris. Cette alimentation est

tonifiante et très riche en glucides. Les graines torréfiées peuvent fournir un succédané de

café.

Le tronc fournit le bois de chauffage et du matériel pour la construction. La sève

qui s’écoule du stipe incisé est utilisée pour la préparation de boisson appelée le vin de

palme ou lagmi qui peut être bu frais ou fermenté.

Les palmes (vertes ou sèches) sont utilisées pour la vannerie (confection des

couffins, chapeaux, éventails et nattes). On les trouve aussi en clôture, sous les toitures.

L’inflorescence est utilisée en balai et la spathe en bois de chauffage.

Le coeur de palmiers fournit le djemmar qui peut être consommé cru.


8

La production mondiale est de l’ordre de 5.960.000 tonnes (année 2004) (données

FAO2) dont plus de 4.227.00 Q tonnes produites par les pays arabes soit 71% de la

production mondiale.

En ce qui concerne l’Algérie, le nombre total de palmiers est estimé à plus de 17

millions (année 2006) (données FAO2) sur une superficie de plus de 147 900 hectares. La

production dattière algérienne est de l’ordre de 550.000 tonnes (année 2006) (données

FAO). Dans ce contexte, l’Algérie serait le 6ème producteur mondial de datte et le 5ème

exportateur au niveau du monde arabe.

5.3. Thérapeutiques et cosmétiques :

Choix des cultivars pour leur usage médical ( Guerradi et al., 2005).

- U’chet, Feggouss : fortifiant pour les femmes après accouchement, sucette pour

bébés

- Dalt (Algérie): sucettes pour nouveaux nés

- Azerza et Ghars (Algérie) : utilisées comme compresses pour le rétablissement des

fractures des os.

- Jihl (Maroc): Régulation de l’hyper tension artérielle

- Des masques de beautés à base de dattes (Maroc, Algérie, Tunisie)

- Utilisation de pollen pour le traitement des problèmes de stérilité chez l’homme et

la femme. (Algérie, Maroc et Tunisie)

- Bourar (Maroc) : utilisés dans les régimes alimentaires pour lutter contre l’obésité.

- Les pennes de Timjouhart utilisés contre la toux et les angines.

6. Les marqueurs morphologiques :

Traditionnellement, de nombreux caractères morphologiques sont utilisés pour

décrire les lignées et les cultivars chez les végétaux. L’observation se fait à tous les stades

de croissance de la plante jusqu’à la récolte.

La notion de cultivar chez le palmier dattier repose sur la description

morphologique du fruit et de la graine et de façon moins évidente sur la description de

l'arbre. Les différentes appellations des dattiers ne sont appliquées que pour les palmiers

femelles car ils sont les seuls à produire des fruits.

2 www.FAO.org. (Consulté le: 23/03/2008)

http://www.FAO.org.


9

Dans le cadre de l’évaluation de la variabilité génétique du palmier dattier, des

études morphologiques ont été réalisées par Brac de la Perrière et Benkhalifa (1989).

Une fiche descriptive a été mise en place à l’échelle des pays du maghreb.

En Algérie, Hannachi et al. (1998) et Belgueddj (2002) ont décrit presque 200

cultivars des oasis algériennes en utilisant les caractères du fruit et de la graine et

quelques mesures et appréciations sur l'arbre.

L’application de cette méthode leur a permis de mettre en évidence les caractères

les plus discriminants. Cependant, ces données morphologiques sont assez incertaines sur

le plan taxonomique pour diverses raisons :

- Leurs interactions avec l’environnement (sol, température etc.) font qu’ils sont

peu informatifs d’un point de vue sélection précoce. La précision de ces analyses

phénotypiques peut être augmentée en introduisant d’autres marqueurs.

- Les cultivars sont des palmiers dattiers femelles multipliés végétativement et

identifiés localement dans une même palmeraie d’après l’aspect morphologique

de leur fruit. On leur donne une même appellation vernaculaire en langue arabo-

berbère. C'est ainsi qu'une variabilité intracultivar importante pour certains

cultivars a été détectée. Ces derniers auraient probablement des origines

multiclonales, alors que pour d’autres cultivars, ils sont plus homogènes, ils

proviendraient d’une seule origine clonale (Brac de la Perrière et Benkhalifa,

1989).

- Plusieurs problèmes se sont aussi posés concernant la nomenclature des cultivars.

Un problème de synonymie, lorsque différents noms vernaculaires peuvent

indiquer un même cultivar, et inversement, un problème d’homonymie, quand il

s’agit de différents cultivars dans différentes palmeraies et qui ont le même nom

vernaculaire (Hannachi et al., 1998) .

Cette appellation vernaculaire repose entre autres sur plusieurs critères. Les

exemples qui suivent sont rapportés par Tirrichine (2007) :

• Les caractéristiques du fruit:

- La couleur du fruit à la véraison, exemples: «Tazougueght», à véraison rougeâtre

«Tdelt», sans véraison (couleur verte) «Taoureght», de couleur jaunâtre ;

«Tazerzeit», mélange de couleur.

- La forme du fruit, exemple: «Akerbush» et «Takerbusht» forme ronde et

sphérique «Jakerneneit» forme ovoide ; «Sehaa bedraa» forme allongée.

- Le goût et la consistance du fruit, exemple: «Sokria», goût sucré.


10

• La personne qui a mis au point ou introduit le cultivar:

«Ali ou rached» ; «Ouggahmide» ; «Deglet Nour» ; «Babati» ; «Baydir».

• L’origine supposé du cultivar (lieu ou tribu):

«Tamezouart n’Tlet», TIet étant une zone de la palmeraie de Beni Isguen ;

«Tamjouhert», de la tribu Mjaher de Tougourt; «Utekbala», celle qui vient d’el

Kibla (sud-est).

• La précocité :

Exemple: «Tamezouart» cultivar présent dans l’oasis de Ghardaia connu pour sa

précocité, ne pas confondre avec le cultivar «Tamezouart n’Tlet» précédemment

cité. (Tirichine, 2007),

Exemple d’un cas de synonymie: au M’zab, les appellations «Litim» et «Ajoujil»

désignent en fait un même cultivar.

Exemple d’un cas d’homonymie: «Tazerzait» du M’zab et «Tazerzait» du Touat

sont deux cultivars tout à fait différents.

L’évaluation du potentiel ph nicicole des différentes palmeraies à partir des

marqueurs morphologiques a fait donc apparaître des problèmes mettant en cause l’effet

du milieu et la nomenclature des cultivars. De plus, la reconnaissance des cultivars en

dehors de la période de fructification est difficile. Pour ces raisons, d’autres marqueurs

ont été entrepris pour évaluer la diversité génétique du palmier dattier par l’utilisation des

marqueurs biochimiques et moléculaires

7. Les marqueurs biochimiques et moléculaires :

Les marqueurs génétiques de types protéiques et enzymatiques (marqueurs

biochimiques) ou nucléiques (marqueurs moléculaires) dont l’expression est indépendante

de l’environnement peuvent être utilisés pour caractériser les populations de palmier

dattier, évaluer leur diversité génétique et pour marquer aussi la conformité génétique des

individus régénérés.

Un bon marqueur doit être polymorphe transmis de façon codominante, facile à

obtenir et reproductible, mais, pratiquement, aucun marqueur ne possède toutes ces

qualités exigées.


11

7.1. Les marqueurs biochimiques:

7.1.1. Les isoenzymes:

Les isoenzymes sont des formes moléculaires multiples d’une enzyme qui

possèdent des activités catalytiques similaires dans un même organisme. Des études

montrent que les iso enzymes peuvent être spécifiques d’un tissu. Elles dépendent de sa

maturité et de son environnement cellulaire (Scandalios, 1974).

Dans le cas du palmier dattier, le contrôle génétique de cinq systèmes

enzymatiques de feuilles adultes a été étudié par Torres et Tisserat (1980) pour

différencier les cultivars.

D’autres auteurs ont travaillé sur les profils estérasiques et péroxydasiques de

plusieurs cultivars marocaines (Baaziz, 1989).

Bennaceur et al. (1991) a travaillé sur 186 individus appartenant à 31 cultivars

provenant de diverses palmeraies algérienns à l’aide de 7 systèmes enzymatiques. Ces

auteurs ont montré que la diversité génétique est grande mais seulement 20 cultivars sont

identifiés à partir de cinq systèmes enzymatiques.

L'utilisation de marqueurs isoenzymatiques polymorphes dans l'analyse de la

diversité génétique des palmeraies marocaines a permis d'estimer la variabilité intra-

population à plus de 90% de la diversité totale du palmier dattier, alors que la variabilité

entre les populations est limitée à 10 %, environ (Bendiab et al., 1998; Bendiab, 1998).

Les isoenzymes n’ont pu être totalement discriminants pour différencier

l’ensemble des génotypes.

7.1.2. Les composés flavoniques

Les flavonoïdes sont des composés phénoliques souvent localisés dans la vacuole

cellulaire, dotés d’une diversité structurale. Ce sont des outils de la chimiotaxonomie de

plusieurs classes de végétaux et ils sont impliqués dans les mécanismes de résistance aux

maladies. Les études dans un but chimiotaxinomique sont très peu nombreuses. De plus si

les composés phénoliques des feuilles (Ouafi, 1987) et des fruits (Maier et al., 1964) du

palmier dattier n’ont fait l’objet que de très rares travaux, l’étude de ceux des racines n’a

été entreprise qu’à partir de 1992 par Ziouti et aI, (1992).

Des études chimiotaxinomiques ayant montré que les aglycones flavoniques (deux

flavones et trois flavonols) obtenus par hydrolyse acide des palmes sont des marqueurs de

l’espèce (Ouafi et al., 1988).


12

Les hétérosides flavoniques, marqueurs infra-spécifiques ont permis

l’identification de 9 cultivars de palmier dattier issus d’une collection à I’INRA d’Adrar.

Ces marqueurs ont permis aussi de déceler une variabilité intracultivar chez

Taquerboucht, cultivar résistant à la fusariose du palmier dattier (maladie du Bayoud).

Cette variabilité est liée probablement à deux clones génétiquement proches (Ouafi et al.,

1992).

D’autres travaux ont montré une grande richesse polyphénolique dans le feuillage

du palmier dattier. On y trouve quatre grande familles flavoniques : proanthocyanidines,

flavonols, flavones et les acides phénols (Ouafi et Bounaga, 2008).

Toutefois aucune étude n’a aboutit à la mise en évidence d’un marqueur univoque

qui pourrait être utilisé comme un critère d’identification des cultivars et de sélection des

plantes issues de croisements dirigés.

7.2. Les marqueurs moléculaires:

Plusieurs travaux dont nous citerons certains, ont décrit l’utilisation des marqueurs

RFLP (Corniquel et Mercier, 1994), RADP (Bouchireb et Clark, 1997 ; Sedra et al.,

1998) et les microsatellites (Zehdi et al.,2004).

Seuls les microsatellites ont permis de caractériser certains cultivars tunisiens.

Cependant, ces techniques nécessitent un équipement très lourd et très cher donc

difficilement applicables dans nos laboratoires.

Chapitre -II- :

Les métabolitessecondaires

Chapitre -II- METABOLITES SECONDAIRES

14

1. Introduction :

Les métabolites secondaires végétaux peuvent être définis comme des molécules

indirectement essentielles à la vie des plantes, par opposition aux métabolites primaires

qui alimentent les grandes voies du métabolisme basal. Ces métabolites secondaires

exercent cependant une action déterminante sur l’adaptation des plantes à leur

environnement. Ils participent ainsi, de manière très efficace, à la tolérance des végétaux à

des stress variés (attaques de pathogènes, prédations d’insectes, sécheresse, lumière

UV…).

D’un point de vue appliqué, ces molécules constituent la base des principes actifs

que l’on retrouve chez les plantes médicinales. La grande valeur thérapeutique de certains

de ces métabolites, alliée à leur difficulté de production, à partir de végétaux

(généralement moins de 1 % du poids de matière sèche), explique les difficultés

d’approvisionnement liées à ces molécules et, conséquemment, un prix de marché souvent

exorbitant.

Chez l’Homme, ces éléments traces jouent également un rôle important, en

agissant directement sur la qualité nutritionnelle des fruits et légumes et leurs impacts sur

la santé des consommateurs sont maintenant avérés (effet antioxydant, effet protecteur

contre l’apparition de certains cancers, ou au contraire micro toxiques indésirables).

Par ailleurs, certains métabolites secondaires peuvent être considérés comme des

marqueurs chimiotaxonomiques (Verscheure, 2002). La recherche de ces métabolites

fera l'objet de notre travail.

2. Familles de métabolites secondaires :

Les métabolites secondaires des végétaux, dépassant actuellement 100 000

substances identifiées, appartiennent à trois classes principales (Guignard, 2000):

Ø Composés aromatiques: phénoliques, acide shikimique ou dérivé d’acétate ;

Ø Terpènoïdes et Stéroïdes ;

Ø Composés azotés ou alcaloïdes.


15

2.1. Polyphénols :

2..1.1. Définition :

Les polyphénols constituent un des groupe le plus nombreux et largement

distribué des substances du métabolisme secondaire dans les végétaux. Ils sont

présents dans tous les organes de la plante avec plus de 8000 structures

phénoliques connues. Ils résultent biogénétiquement de deux voies synthétiques

principales: la voie des shikimates et la voie des polyacétates. Selon Harborne (1989),

les polyphénols peuvent être divisés en une dizaine de classes chimiques qui

présentent toutes un point commun : la présence dans leur structure d’au moins un cycle

aromatique à 6 carbones, lui-même porteur d’un nombre variable de fonctions

hydroxyles (OH) (Figure 6). Peuvent s'étendre de molécules simples, telles que les

acides phénoliques, aux composés fortement polymérisés, tels que des tanins

(Guignard, 2000 ; Lugasi et al., 2003) (Tableau 1).

Tableau 1 : Principales classes des composés polyphénoliques rencontrés chez les plantes

(Goodwin et Mercer 1983)

Nombre d’atomede carbone

Structure Classe Exemple

6 C6 Phénols simples Catéchol7 C6-C1 Acides phénoliques acide gallique, salicylique

8 C6C2

acétophénones 3-acétyl-6-méthoxybenzaldéhydeTyrosol

9 C6-C3

Acide hydroxycinnamiquePhénylpropènesCoumarinesIsocoumarinesChromones

Caféique, feruliqueEugénol, Myristicineombelliferone,BergenoneEleuthérinolEugenine

10 C6C4 Naphtoquinones Juglone, plumbagine13 C6C1C6 Xanthones Mangiferine14 C6C2C6 Stilbènes

AnthraquinoneResveratrolEmodine

15 C6C3C6 FlavonoidesIsoflavonoides

Quercetine,cyanidineGenisteine

18 (C6C3) Lignanes Podophylotoxine,Pinoresinol

30 (C6C3C6)2 Biflavonoides Amentoflavonen (C6C3) n Ligninesn (C6C3C6) n Tanins condensés


16

Les composés phénoliques (acides phénoliques, flavonoïdes simples et proanthocyanidines)

forment le groupes des composés phytochimiques le plus important des plantes (Beta et al.,

2005).

2.1.2. Acides phénoliques :

Les acides phénoliques sont contenus dans un certain nombre de plantes agricoles

et médicinales (Psotove et al., 2003). On citera l’acide chlorogénique, l’acide

caféique, l’acide protocatéchique, l’acide vanillique, l’acide férulique, l’acide sinapique

et l’acide gallique (Hale, 2003).

Ils sont considérés comme substances phytochimiques avec des effets

prébiotique, antioxydant, de chélation et anti-inflammatoire. Leur toxicité est faible

et considéré non toxique. Pharmacologiquement, le mieux caractérisé est l’acide

caféique (Psotove et al., 2003).

2.1.3. Tanins :

Les tanins sont des polyphénols polaires d’origine végétale (Berthod et al., 1999),

existent dans différentes parties de la plante : écorce, bois, feuilles, fruits et racines. Il est

difficile de les séparer dans un extrait végétal, parce que de nombreux isomères

avec une base moléculaire très semblable coexistent (Berthod et al., 1999).

Ils sont divisés en deux groupes, tanins hydrolysables et condensés, ils

peuvent être constitués par la condensation des dérivés flavane qui ont été transportés

aux tissus du bois des plantes. Alternativement, des tanins peuvent être constitués par

polymérisation des unités de quinone (Cowan, 1999).

2.1.4. Flavonoïdes :

Le terme flavonoïde rassemble une large gamme de composés appartenant à la

famille des polyphénols. Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à quinze atomes

de carbone constitué de deux cycles en C6 (A et B) reliés par une chaîne en C3 (Ribéreau-

Gayon, 1968). Les flavonoïdes sont une classe de composés ubiquitaires dans les plantes

vasculaires et représentent un des plus grands groupes de produits naturels phénoliques

(Figure 6). Ils interviennent dans la pigmentation des fleurs, la protection des plantes contre

les radiations UV de type B et leur défense contre les herbivores et les attaques

microbiennes (Harborne et al., 2000). Certains flavonoïdes ont parallèlement une activité

antioxydante (Pietta, 2000), anti-inflammatoire, vasculaire, oestrogénique et antitumorale,


17

pour ne citer que leurs principales propriétés pharmacologiques (Harborne et Williams,

2000).

Ces composés se divisent en différents types : flavones, isoflavones, flavonols,

flavanones, flavanes, chalcones, anthocyanidines, catechines, ptérocarpanes, aurones.

2.2. Terpènes :

2.2.1. Définition :

Les terpènes sont des hydrocarbures formés par assemblage de deux ou plusieurs

unités isopréniques. Ce sont des polymères de l’isoprène de formule brute (C5H8) n. Ce

sont des polymères de l’isoprène de formule brute (C5H8) n. Selon le nombre d’unités

associées, on distingue : les mono-(C10), les sesqui-(C15), les di-(C20), les tri-(C30), les

tétra-(C40) terpènes et poly terpènes.

Figure 6: Structure de quelques composés phénoliques (Guignard, 2000).


18

La famille des terpénoïdes comprend (Hopkins et Evrard, 2003):

Ø des hormones (gibbérellines, acide abcissique),

Ø des pigments caroténoïdes (carotène et xanthophylle),

Ø des stérols (par exemple : ergostérol, sitostérol, cholestérol)

Ø des dérivés de stérol (par exemple des hétérosides digitaliques),

Ø le latex (qui est à la base du caoutchouc naturel).

Ø une grande partie des huiles essentielles qui confèrent aux plantes leur

parfum ou leur goût.

2.2.2. La biosynthèse des terpènoïdes :

La biosynthèse des terpènoïdes implique l’addition de l’unité isoprène avec

son isomère pour former le géranyl diphosphate (GPP, C10), condensé avec une

autre unité IPP (Isopentenyl di phosphate) forment le diphosphate de farnésyl (FPP,

C15) à l’origine des sesquiterpènes etc. (figure 7).

Les précurseurs parentaux compte tenu de la modification structurale par

l'oxydation, la réduction, l'isomérisation, l'hydratation, la conjugaison et/ou d'autres

transformations donnent une variété de terpènoïdes (Dubey et al., 2003)

Figure 7: Synthèse de différentes classes terpéniques chez les plantes (Dubey et al., 2003)


19

2.3. Alcaloïdes :

2.3.1. Définition :

Les alcaloïdes forment une grande famille de molécules chimiquement

hétérogènes. Leurs caractéristiques communes sont :

Ø leur solubilité dans l’eau ;

Ø la présence d’au moins un atome d’azote qui accepte souvent un proton, ce qui

leur confère un caractère légèrement basique en solution (d’où leur nom

d’alcaloïdes).

A faible dose, ils sont toxiques et possèdent une remarquable activité physiologique

qui a conduit à l’emploi de certains d’entre eux en thérapeutique : morphine, quinine,

atropine, cocaïne, etc. (Hopkins et Evrard, 2003).

2.3.2. Classification selon la structure chimique:

Dans le premier cas, on classe les alcaloïdes en fonction de la nature de l’amine

primaire (mescaline), secondaire (éphédrine), tertiaire (hordéine) ou ammonium

quaternaire (muscarine).

Dans le deuxième cas, les alcaloïdes sont classés selon la grandeur et la complexité

croissante de l’hétérocycle azoté (Guignard, 2000).

L’énumération suivante peut en donner un aperçu (les formules développées

sont données dans le tableau 2).


20

Tableau 2: Structure chimique des alcaloïdes (Buchanan et al., 2000)

Alcaloïdes Dérivés

N

CH3

Pyrrolidine

N

CH3

CH2 CO OCH3

Hygrine

N PyridineN

CH3

Nicotine

N

H Pipéridine

N

H

CH2 CH2 OCH3

Coniine

N

H3C

Tropane

N

H3C

COOCH3

O C

OC6H5

Cocaïne

N

N

H Imidazole

N

N

H

CH2 CH2 NH2

Histamine

N

CH3

COOCH3

OCOC6H5Cocaïne

C

CH3

O

H2C

H3C

N

CO

C6H5

CH3

CH3

Stovaïne


21

Suite du tableau 2 :

N

N N

N

H Purine

N

N N

NH3C

CH3

CH3O

O

Caféïne

N

H Indole

NN

H

H3COOC

OH Yohimbine

N

Isoquinoléine

NH3CO

H3CO

H3CO

OCH3

Papavérine

Chapitre -III- :

Les antioxydants

Chapitre -III- ACTIVITE ANTIOXYDANTE

23

1. Notion de balance pro/anti-oxydante :

Dans la plupart de notre tissu sain, les défenses anti-oxydantes sont capables de

faire face aux besoins et de détruire les radicaux produits en excès. On dit que la balance

pro/anti-oxydante est en équilibre. Mais dans certaines situations, en raison d’une

surproduction radicalaire (tabac, alcool, pollution) et/ou d’une diminution des capacités

anti-oxydantes (insuffisance d’apports en micronutriments anti-oxydants, inactivation

d’enzymes), un déséquilibre s’instaure entre la production des radicaux libres et les

systèmes de défense. On se trouve face à une altération de l’état redox cellulaire, appelée

stress oxydatif (Figure 8)3.

Figure 8: Déséquilibre de la balance entre antioxydants et oxydants3

2. Antioxydants :

2.1. Définition :

Il peut être défini comme toute substance qui est capable, concentration

relativement faible, d’entrer en compétition avec d’autres substrats oxydables et ainsi

retarder ou empêcher l’oxydation de ces substrats (Meister, 1983).

3 www.Probiox.com-Untitled (Consulté le 12 /10/ 2008)

Oxydant

Antioxydants

http://www.Probiox.com-Untitled


24

2.2. Neutralisation d'un oxydant :

2.2.1. Les antioxydants endogènes :

Les défenses antioxydantes de l’organisme (Figure 9) peuvent se diviser en :

- Système de défense primaire ;

- Système de défense secondaire.

2.2.1.1. Système de défense primaire :

Les systèmes de défense primaire sont composés d’enzymes et de substances

antioxydantes:

Ø la superoxyde dismutase (SOD) : diminue la durée de vie de l’anion

superoxyde O2-

Ø La catalase : transforme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en simple molécule

d’eau

Ø Le glutathion péroxydase (GPx) : détruit le péroxyde d’hydrogène et les

péroxydes lipidiques

Ø Les molécules piégeurs : le glutathion (GSH), l’acide urique, les protéines à

groupement thiols, ubiquinone, etc.

2.2.1.2. Système de défense secondaire :

Les système de défense secondaire sont composés d’enzymes protéolytiques,

des phospholipases, des ADN endonucléase et ligase (Pincemail et al., 1998).


25

Figure 9: Mécanismes de détoxification cellulaire (Buchanan et al. , 2000 )

2.2.2. Antioxydants naturels :

Plusieurs substances peuvent agir en tant qu'antioxydants in vivo. Elles incluent

le bêta carotène, l'albumine, l'acide urique, les oestrogènes, les polyamines, les

flavonoïdes, l'acide ascorbique, les composés phénoliques, la vitamine E (Figure 10) etc.

Elles peuvent stabiliser les membranes en diminuant leur perméabilité et elles ont

également une capacité de lier les acides gras libres (Svoboda et Hampson, 1999).


26

Figure 10: Principaux composés naturels possédant

des propriétés antioxydantes (Shahidi, 1997)

2.2.2.1. Vitamine E :

La vitamine E est un antioxydant important qui protège les cellules contre

les dommages associés aux radicaux libres et par conséquent, prolonge la vie

cellulaire tout en ralentissant le processus de vieillissement (Maydani, 2000). Il a

été déterminé que la vitamine E naturelle, semble être deux fois plus biodisponible que la

vitamine E synthétique (Burton et al., 1998). La vitamine E est rencontrée surtout

dans les huiles végétales, les noix et les germes de diverses graines (Vansant, 2004).

2.2.2.2. La vitamine C ou acide ascorbique :

La vitamine C est un puissant réducteur. Il joue un rôle important dans la

régénération de la vitamine E. Il est présent dans les légumes, le chou, le poivron, les

agrumes (Ekoumou, 2003).


27

2.2.2.3. Caroténoïdes :

Les exemples de caroténoïdes incluent l’alpha carotène, bêta carotène,

lycopène, phytofluène, phytoène, lutèine, néoxanthine, violaxanthine, anthéraxanthine,

alpha cryptoxanthine et bêta cryptoxanthine. Leur structure polyène leur permet

d’absorber la lumière et de neutraliser l’oxygène singulet. Cette chaîne polyène, par

mécanisme d’addition, permet l’incorporation des espèces réactives ou radicaux

libres et de ce fait ralentir leur propagation. Les caroténoïdes sont impliqués dans

la prévention de nombreux types de cancer: cancer de la prostate, cancer du poumon

(Hale, 2003).

2.2.2.4. Acide alpha-lipoïque :

L’acide alpha-lipoïque fut isolé il y a cinquante ans et identifié comme vitamine.

Depuis, il a été reclassé comme antioxydant et peut piéger les radicaux libres aux

niveaux intracellulaire et extracellulaire. Du fait, qu’il soit aussi bien liposoluble

qu’hydrosoluble, il peut accéder à toutes les parties de nos cellules (Packer et al.,

1995).

2.2.2.5. Flavonoïdes :

Plusieurs flavonoïdes ont montré des activités antioxydantes (Figure 11), anti-

inflammatoires, inhibitrices d’enzymes et prévention des maladies cardiovasculaires

(Wang et Mazza, 2002).

2.2.2.6. Tanins :

Les tanins sont des donneurs de protons aux radicaux libres lipidiques produits au

cours de la péroxydation. Des radicaux taniques plus stables sont alors formés, ce qui a

Figure 11: Piégeage des radicaux libres (R°) par les flavonoides

(Jovanovic et al. , 1994)


28

pour conséquence de stopper la réaction en chaîne de l’auto oxydation des lipides (Cavin,

1999).

2.2.2.7. Coumarines :

Les coumarines de différents types se trouvent dans de nombreuses espèces

végétales et possèdent des propriétés très diverses. Ils sont capables de prévenir la

péroxydation des lipides membranaires et de capter les radicaux hydroxyles, supéroxydes

et péroxyles. Les conditions structurales requises pour l’activité antipéroxydante des

coumarines sont similaires à celles signalées pour les flavonoides (Igor Passi, 2002).

2.2.2.8. Phénols :

Parmi les dérivés phénoliques, le resvératrol est le composé qui est le plus étudié. En

effet, ce stilbène, isolé du raisin possède de fortes propriétés antioxydantes (Igor Passi,

2002).

Chapitre -IV-:

Matériel et méthodes

Chapitre -IV- MATERIEL ET METHODES

30

1. Matériel végétal et extraction

1.1. Prélèvement du matériel végétal

1.1.1. Palmiers dattiers :

Le prélèvement des pennes de palmier dattier a été effectué sur une vingtaine de

cultivars de palmier dattier dans la wilaya d'Adrar en janvier 2008 (Tableau 3) (Figure

12), dont les caractéristiques géographiques et bioclimatiques d’Adrar sont résumées dans

le tableau 4.

Tableau 3: Lieux et date de prélèvement des cultivars de palmier dattier.

cultivars Lieux de récolte Date de récolte

Baouadhim Benyellou / Bouda 16.01.2008

Timjuhert I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Bamakhlouf I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Warglia I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Tinakour Benyellou / Bouda 16.01.2008

Adoukli Benyellou / Bouda 16.01.2008

Aghamou Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008

Aghamou (Bayoud) Benyellou / Bouda 16.01.2008

Tgaza Konta / Regan 14.01.2008

Baouarif Benyellou / Bouda 16.01.2008

Timliha Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008

Ghars I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Tinasser Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008

Deglet nour I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Takarbuchet I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Aghares I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008

Deglet mahmoud Benyellou / Bouda 16.01.2008

Deglet bouda Benyellou / Bouda 16.01.2008

Aharthan Zt.Manssour / Bouda 13.01.2008

Doukar (pied mâle) I.N.R.A d’Adrar 15.01.2008


31

Tableau 4 : Caractéristiques géographiques et bioclimatiques des sites de prélèvement.

Stations Etage

bioclimatique

Altitude

(m)

Latitude

nord

Longitude

ouest

Pluviométrie

(mm/an)

Adrar Aride 263 27°53’ 0°17’ 13

Misserghin Semi-aride 78 35°36’ 1°15’ 300

Oran Semi-aride 90 35°37’ 0°37’ 300

Figure 12: Prélèvement de pennes de palme de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.)

1.1.2. Autres Arecaceae:

Les folioles de deux autres Arecaceae ont été prélevées dans la wilaya d'Oran en

Décembre 2007. Il s'agit de Ph nix canariensis L. (prélevé à l'université d’Oran – Es

Senia) et de Chamaerops humilis L. (prélevé à Misserghine), dont les caractéristiques

géographiques et bioclimatiques sont résumées dans le tableau 5.

1.2. Séchage et broyage :

Les folioles sont nettoyées avec de l’alcool afin d’éliminer toute trace de

cochenille (Figure 13) et séchées à l’étuve à 45°C pendant 48 heures. Le matériel séché

est coupé finement (Figure 14a) et broyé à l'aide d'un broyeur à billes (Figure 14b).


32

La poudre végétale de chaque échantillon est conservée dans des flacons à

l'obscurité jusqu'à utilisation.

Figure 13: Nettoyage des folioles de Phoenix dactylifera L., Phoenix canariensis L.

et Chamaerops humilis L.

1.3. Extraction:

1.3.1. Extraction sous reflux :

Pour chaque échantillon, on introduit 100 ml d’eau distillée (solvant d'extraction) et

10 g de poudre végétale dans un ballon de 500 ml. L'ensemble est porté à ébullition douce

sous reflux pendant 30 mn par extraction (Figure 15). Chaque échantillon a subi trois

Figure 14a: Broyage des pennes de

dattier (Phoenix dactylifera L.)

Figure 14b: Broyeur à billes


33

extractions successives ce qui permet d'extraire le maximum de composés chimiques les

plus polaires.

Les trois extraits obtenus sont filtrés à l’aide du filtre de papier plissé, réunis,

répartis dans des ballons rodés avant d’être congelés et lyophilisés à l’aide d’un

lyophilisateur (Virtis) (Figure 16) afin de pouvoir garder les extraits à l’état sec et

empêcher une altération des métabolites de la plante.

Figure 15: Extracteur sous reflux

Figure 16 : Lyophilisateur Virtis

Statif

Réfrigérant

Chauffe ballon

Ballon d’extraction

Vanne du vide

Ballon rodé

Echantilloncongelé


34

1.3.2. Extraction solide-liquide :

Cette méthode consiste à extraire les constituants d’un solide par simple contact

avec différents solvants organiques de polarités croissantes à l’aide d’un extracteur du

type Soxhlet (Figure17).

Dix grammes de poudre végétale sont déposés dans la cartouche du Soxhlet. Le

ballon est rempli dans un premier temps de 150 ml d'hexane, solvant apolaire qui élimine

les lipides. Dans un deuxième temps, on ajoute 150 ml de méthanol, solvant très polaire

pour récupérer les métabolites polaires

Les extraits hexanique et méthanolique obtenus sont concentrés séparément à l'aide

évaporateur rotatif.

2.Analyses phytochimiques :

L’identification des phytoconstituants des extraits végétaux se fait par

chromatographie sur couche mince (CCM), technique simple et rapide qui permet de

mettre en évidence les différentes familles de métabolites secondaires recherchées.

2.1. Screening phytochimique par CCM :

2.1.1. Principe de la CCM :

La chromatographie sur couche mince (CCM) met en jeu des phénomènes physico-

chimiques, basés sur le pouvoir d’adsorption. Elle correspond à une phase mobile (éluant),

Figure 17: Extracteur de type Soxhlet


35

formée par un/ou un mélange de solvants et une phase stationnaire étalée sur une couche de

verre ou d’aluminium et sur laquelle est déposée une goutte de la substance à analyser.

La vitesse de progression de chacun des constituants du mélange entraîné par le

solvant (par capillarité le long de la plaque) n’est pas la même. Par conséquent, il se forme

des spots révélés au moyen de l’UV ou de réactifs colorés.

Chaque composé est défini par son Rf (facteur de rétention), qui correspond à sa

migration relative par rapport au solvant : Rf = D1/ D2

D1 : Distance parcourue par le soluté

D2 : Distance parcourue par le front de solvant

2.1.2. Protocole expérimental :

Chaque échantillon est déposé sous forme de tiret à l'aide d'une pipette Pasteur sur

une plaque couverte de gel de silice 60F254 (Merck), l’intervalle entre les dépôts est de

1cm, à partir d’une distance de 1,5 cm du bord inférieur de la plaque. Chaque dépôt est

séché à l’aide d’un sèche cheveux.

La plaque est ensuite immergée dans un système de migration approprié. La

migration est arrêtée quand le front du solvant atteint 0,5 cm du bord supérieur de la

plaque. Celle-ci est alors retirée et séchée au sèche-cheveux, examinée sous UV à 254 et

365 nm puis révélée par un révélateur spécifique. Les systèmes d’élution utilisés sont

représentés dans le tableau 5.

L’identification des acides phénoliques a été réalisée en utilisant des témoins tels

que: acide caféique - acide sinapique - acide férulique - acide cinnamique.

2.1.3. Réactifs de révélation chimique sur CCM:

L’utilisation de réactifs chimiques en solution, vaporisés sur les CCM, permettent

de compléter les observations faites visuellement sous les lampes UV à 254 nm

(Quenching (extinction de la fluorescence)) et 365 nm (fluorescence propre). En effet, un

choix adapté de réactifs permet non seulement de mettre en évidence des constituants ou

classes de constituants présents dans un extrait (criblage général), mais offre en plus une

méthode simple et rapide pour localiser un composé particulier dans un mélange (extrait,

fraction enrichie, etc.) (Tableau 6).

Les différents réactifs chimiques pour CCM utilisés dans ce travail sont présentés

en annexes.


36

Tableau 5 : Systèmes d’élution pour la CCM (Wagner et Bladt, 1996).

Phytoconstituants Système d’élution

Acides phénoliques libres AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 : 11 : 11 : 26).

Séparation sous UV (365 nm )

Coumarines AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 : 11 : 11 : 26)

Dérivés anthracéniques,

anthrones et anthranolsAcOEt- MeOH- H2O (100 :13.5 :10)

Flavonoïdes AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)

Glycosides cardiotoniques AcOEt- MeOH- H2O (100 :13.5 :10)

Quinones AcOEt-MeOH-H2O (100 :17 :13)

Lignanes CHCl3-MeOH-H2O (70 : 30 : 4)

Saponines CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8)

Sesquiterpènes lactones AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)

Triterpènes AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)


37

Tableau 6: Résultats des observations des plaques de CCM avant et après révélation par des colorations spécifiques pour chaque

phytoconstituant d'après Wagner et Bladt (1996).

Avant révélation Après révélationPhytoconstituants Révélateurs

Quenching à 254 nm Fluorescence à 365 nm Couleurs au visible Fluorescence à 365 nm

Acides phénoliques

libres*Folin-Ciocalteu et NH4 + Bleue Bleu-noir Variable selon les composés

Anthrones et anthranols KOH + Jaune ou rouge-brunâtre - Jaune

Coumarines

(gel de silice)KOH +

Bleue intense ou bleue- verdâtre (coumarines

simples), jaune, brune, bleue ou bleue-verdâtre

(furano- et pyranocoumarines)

- Intensification de la fluorescence

Coumarines (gel de

cellulose)- Coloration en UV = hydroxycoumarines - -

Dérivés anthracéniques KOH + Jaune ou rouge-brunâtre Rouge Rouge

Flavonoïdes Neu + + - Rouge, orange, jaune, jaune-orange, jaune- verdâtre, violette

Glycosides

cardiotoniquesSbCl3 + - Vert, violet, brun Blanche, orange, jaune, jaune- verdâtre, verte, bleue, brune

LignanesVanilline-Ac

Phosphorique+ - Bleu-rougeâtre Violette, violette-rougeâtre, bleue-violette

Lignanes Vanilline-H2SO4 + - Violet-rougeâtre Rouge

Lignanes SbCl3 + - - Jaune, bleue

Quinones libres KOH + - Rouge -

Saponines Komarowsky + - Brune-grisâtre -

Sesquiterpènes lactones Zimmermann + - Brun-grisâtre -

Triterpènes Anisaldéhyde + - Violet, bleu-violette -

- : absence ; + : présence.*Fry, 1988


38

2.1.4. Hydrolyse acide :

L’hydrolyse acide est réalisée sur quelques mg de poudre végétal de palmier dattier, à

l’aide de HCl (2N)-MeOH (1 :1) dans des tubes en verre scellés. Ils sont mis dans une

étuve à 100°C pendant 1h. Après refroidissement, la génine est ensuite séparée de la

fraction osidique par une extraction liquide-liquide contre du dichlorométhane (CH2Cl2).

La phase organique résultante est ensuite évaporée à sec puis reprise par quelques

millilitres de méthanol. Les génines libérées, entraînées par le dichlorométhane, sont

ensuite identifiées par CCM. La phase aqueuse contenant les composés polaires, en

l’occurrence, les monosaccharides, neutralisée par évaporations successives (3 fois) en

présence de méthanol, servira à l’analyse des sucres.

2.1.4.1. Identification des aglycones :

Les génines obtenues sont identifiées par CCM (sur silice 60 F254)

comparativement à des témoins de référence dans les solvants : toluène-AcOEt-HCOOH

(50 :40 :10) et révélées par le réactif de NEU (2-aminoéthyl-diphénylborate) suivi d’un

chauffage. Les témoins d’aglycones utilisés sont: la quercétine, l’isorhamnétine, flavone,

flavanol, Kampférol.

2.1.4.2. Identification des glucides :

L’identification des sucres obtenus par l’hydrolyse est réalisée par CCM

comparative sur silice normale dans le système de solvant CHCl3-MeOH-H2O (64 :40 :8)

puis révélé par pulvérisation d’une solution de DPAP (acide

diphénylaminophosphorique) suivi d’un chauffage. La CCM est réalisée en présence de

neuf monosaccharides témoins : mélibiose, acide glucuronique, glucose, galactose,

rhamnose, xylose, arabinose, fucose, acide galacturonique.

2.1.5. Mise en évidence des tanins :

Dans un tube à essai, 5 ml d’extrait aqueux à 2 % est ajouté à 1 ml de solution

aqueuse de FeCl3 à 1 %. L’ajout de FeCl3 1 % permet de détecter la présence ou non de

tanins. La couleur vire au bleu noir en présence de tanins galliques et au brun verdâtre en

présence de tanins catéchiques (Rizk, 1982).


39

2.2. Dosage des polyphénols totaux :

Le dosage des polyphénols totaux se fait selon la méthode de Folin-Ciocalteu.

2.2.1. Principe:

Le réactif est constitué par un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide

phosphomolybdique. Il est réduit lors de l’oxydation des phénols en un mélange d’oxydes

bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau-Gayon, 1968). La coloration produite,

dont l’absorption maximum est à 765 nm est proportionnelle à la quantité de polyphénols

présents dans les extraits végétaux.

2.2.2. Protocole du dosage :

Dans des tubes à hémolyse, on met 100 l d'extrait aqueux (dissous dans du

méthanol à une concentration de 2 mg/ml) et 500 l de Folin-Ciocalteu dilué au 1/10

dans eau distillée) sont mélangés. Après agitation, le mélange est laissé 5 mn à l'obscurité

et à température ambiante. On ajoute 1500 l de carbonate de sodium Na2CO3 (à 2%

dans eau distillée), on agite et on laisse une heure à température ambiante et à l'obscurité.

La couleur jaune du réactif vire au bleu. La lecture de l'absorbance se fait au

spectrophotomètre UV-Visible (Figure 18) (8500 P Double-BEAM spectrophotometer) à

765 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP ITALIANA SPA, Italy, volume

2ml).

Figure 18: Spectrophotomètre UV-Visible

(8500 P Double-BEAM spectrophotometer)


40

La quantification des polyphénols a été faite au moyen d'une courbe d'étalonnage

établie à l'aide de différentes concentrations (4,70- 9,40- 14- 19 et 24 µg /ml d'acide

gallique (Fluka) (solution mère à 1mg/ml). Cette courbe est réalisée dans les mêmes

conditions opératoires que les extraits.

Le blanc est aussi préparé dans les mêmes conditions en remplaçant la quantité de

l’extrait méthanolique par le méthanol.

Chaque mesure est effectuée en trois répétitions en employant des cuves en

plastiques jetables (volume 2ml). La valeur finale de chaque dosage correspond à la

moyenne des trois répétitions.

La courbe de tendance obtenue (déterminée à l’aide de Excel 2003)

La quantité des polyphénols totaux est exprimée en mg d’équivalents d’acide

gallique par gramme d’extrait lyophilisé.

2.3. Dosage des flavonoïdes :

L’analyse quantitative des flavonoïdes est réalisée par le dosage

spectrophotométrique selon la méthode décrite par Kim et al ., (2003).

Dans les tubes à hémolyse, on mélange 500 µl d'extrait aqueux (dissout dans du

méthanol à une concentration de 2 mg/ml) à 1500 µl d'eau distillée. A ce mélange, on

ajoute 150 µl d'une solution de NaNO2 à 5% (dissout dans eau distillée). Après 5mn de

réaction, on rajoute 150 µl d'une solution de AlCl3 à 10% (dissout dans eau distillée) et

à la onzième minute, on ajoute 500 µl de NaOH 1M. L'ensemble de ce mélange est

agité au vortex.

La lecture de la densité optique à 510 nm permet de déterminer la concentration des

flavonoïdes en se référant à une courbe d’étalonnage faite à partir d’une série de

solutions étalons de catéchine (Fluka) ayant les concentrations suivantes 5µg/ml,

10µg/ml, 15µg/ml et 20µg/ml.

Le blanc est préparé en remplaçant la quantité de l’extrait méthanolique par du

méthanol seul et dans les mêmes conditions.

Les densités optiques sont lues au spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-

BEAM spectrophotometer) à 510 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP

ITALIANA SPA, Italy, volume 2ml).

Les résultats sont exprimés en mg d'équivalents de catéchine par gramme d'extrait

lyophilisé.


41

3. Activité antioxydante ;

Le test de l'activité antioxydante peut être effectué par bioautographie sur plaque

CCM (test qualitatif) ou par dosage spectrophotométrique (test quantitatif).

3.1. Bioautographie :

La mise en évidence de l'activité antioxydante par bioautographique peut se faire

par réduction de radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

3.1.1. Principe:

Le DPPH (2 ,2 -diphenyl-1-picrylhydrazil) figure est un radical stable, soluble

dans du méthanol ou éthanol qui présente une absorption caractéristique à 517 nm qui lui

confère une coloration violette. Cette couleur disparaît lorsque le DPPH est réduit en

diphénylpicrylhydrazine par un capteur de radicaux libres (Figure 19).

La réaction peut être résumée sous la forme de l’équation:

DPPH + (AH)nà DPPH-H + (A)n,

Où (AH)n représente un composé capable de céder un hydrogène au radical DPPH

(violet) pour le transformer en molécule DPPH-H.

Forme libre du DPPH

Forme réduite du DPPH

N N.

O2N

NO 2

O2N

A-H

NHN

O2N

NO 2

O2N

+ A.

Figure 19: Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux

(A-H) (Roberto Lo Scalzo, 2008).


42

3.1.2. Protocole:

Les extraits aqueux lyophilisés sont à 2mg /ml dissous dans le méthanol. Ils sont

déposés à la même concentration de 20 ug/ml sur deux plaques Silicagel 60 F254 sur

feuille d’aluminium (Merck). Ces plaques sont développées dans le système d’élution

approprié : Chloroforme-acide acétique-acide formique-eau distillée (100 :11 : 11 :26).

Après développement et séchage, les plaques sont pulvérisées à l’aide d’une solution de

DPPH à 0.2 % dans le méthanol. Les plaques sont examinées après 30 mn à l’oeil nu. Les

activités antiradicalaires apparaissent sous forme de spots de couleur jaune-blanc sur fond

violet (Cavin, 1999).

3.2. Dosage de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH :

Cette technique ne concerne que les extraits ayant montré une activité antioxydante

par bioautographie.

Dans des tubes secs, on introduit 50µl de la solution à tester et 1950 µl de la

solution méthanolique de DPPH à 6.10-5 M. Après agitation par un vortex, les tubes sont

placés à l’obscurité à la température ambiante pendant 30 min. Pour chaque

concentration, le test est répété 3 fois. La lecture est effectuée par la mesure de

l’absorbance à 517 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP ITALIANA SPA,

Italy, volume 2ml) par un spectrophotomètre UV-Visible (8500 P Double-BEAM

spectrophotometer).

Pour réaliser cette mesure, on utilise trois témoins positifs, un témoin négatif et un

blanc de la réaction qui ne contient pas d’extrait méthanolique mais du méthanol pur.

Le contrôle positif est représenté par trois antioxydants de référence:

Butylhydroxyanisole (BHA), Acide ascorbique et Quercétine

Le contrôle négatif est composé de 1950µl de la solution méthanolique au DPPH

(6.10 -5M) et de 50µl de MeOH.

L’activité d’un antioxydant peut être caractérisée par une grandeur appelée la IC50

(Concentration inhibitrice à 50%) : concentration de l’antioxydant qui permet l’inhibition

de 50% du signal de référence.

La IC50 permet de comparer l’activité de différentes composées antioxydants. Plus

la IC50 est petite, plus l’antioxydant a une activité plus importante.

Pour déterminer la IC50, nous avons calculé dans un premier temps le %

d’inhibition pour différentes concentrations. Ensuite, l’équation du tracé qui correspond


43

le mieux aux points expérimentaux est déterminée. C’est à partir de cette équation que la

IC50 est calculée.

4. Analyse statistique:

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard (Means ±

standard errors (S.E.M)) calculée sur la moyenne de trois expériences pour chaque cas (le

calcul est réalisé à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2003).

Les donnés expérimentales sont présentées sous forme d’histogrammes pour les

quantités des flavonoïdes et des polyphénols totaux et pour les IC50 et sous forme de

courbes pour les étalons de l'acide gallique et la catéchine).

Le coefficient de corrélation R2 entre les DO et les concentrations des étalons est

calculé à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2003.

Chapitre -V-:

Résultats&

Discussion

Chapitre -V- RESULTATS ET DISCUSSION

45

1. Résultats :

1.1. Caractéristiques des cultivars prélevés:

Une enquête sur le terrain a permis de donner quelques indications sur les

cultivars prélevés dans la wilaya d’Adrar. Ces caractéristiques sont axées sur la

résistance ou sensibilité au bayoud (fusariose du palmier dattier), sur la période de

maturation des dattes et la fréquence des cultivars dans la wilaya d’Adrar (Tableau 7).

Tableau 7 : Caractéristiques des cultivars de palmier dattier d’Adrar.

1.2. Screening phytochimique des extraits aqueux:

La mise en évidence des différents métabolites secondaires des extraits aqueux des

cultivars de P. dactylifera L. et des extraits aqueux de P. canariensis L. et de

Chamaerops humilis L. a permis d’obtenir les résultats suivants :

Cultivars

Dattes

moles (M)

ou dures (D)

Résistance (R)

Tolérante (T)

Sensible (S)

Précocité (P)

ou Tardif (T)

Endémique

ou introduite

à la région

Fréquente (F)

ou Rare (R)

Baouadhim M S T Juillet E R

Timjuhert M T T Juillet I R

Bamakhlouf M S P juin E R

Warglia M S P juin I R

Tinakour D S T octobre E R

Adoukli M S T Juillet E R

Aghamou D S T septembre E F

Tgaza M S P juin E F

Baouarif M T T juillet E R

Timliha M S T juillet E F

Ghars M S T juillet I R

Tinasser D T T août E F

Deglet nour M S T septembre I R

Takarbuchet M R T octobre E F

Aghares D R T septembre E R

Doukar

(pied mâle)

Aucune

sélection/ Echelonné / /


46

1.2.1. Polyphénols :

1.2.1.1. Les acides phénoliques :

Après pulvérisation des chromatogrammes avec le réactif de Folin-Ciocalteu, une

tache bleue- noire apparaît immédiatement. Le Rf (0,56) de cette tache ne correspond pas

aux Rf des témoins utilisés, acide caféique, acide cinnamique, acide férulique, acide

sinapique. Il s'agit probablement d'un autre acide phénolique (Tableau 8).

1.2.1.2. Flavonoïdes:

- Extraits aqueux:

Après CCM et observation sous UV à 365 nm (Figure 20a, 20b) et révélation par

le réactif de Neu (Figure 21a, 21b)., les différents extraits testés présentent des

constituants de fluorescences diverses, ce qui indique la présence de plusieurs types de

flavonoides

Les substances colorées en jaune sont probablement des flavonoïdes à base de

rutine. Les constituants qui donnent une couleur jaune orange sont des flavonols et ceux

présentant une fluorescence jaune verte, des flavonols à base de Kaemphérol. La

fluorescence orange est due à des flavones à base de lutéoline et ses glycosides (Wagner

et Bladt, 1996). L’intensité de coloration des produits séparés est proportionnelle à leur

concentration.

Les résultats de la séparation des flavonoïdes sont regroupés dans le tableau 8.


47

Figure 20a: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système de migration utilisé: AcoEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26).

Bm : Baouadhim; Tj : Timjuhert; Bk : Bamakhlouf; Wg : Warglia; Tn : Tinakour; Ad : Adoukli; Ag : Aghamou ;

Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.; Ch : Chamaerops humilis L.

Figure 20b: Chromatogramme observée à 365nm sous UV avant la révélation

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé: AcoEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)

Th : Timliha; Gh : Ghars; Tc : Tinaceur; Dn : Deglet nour; Tk : Takarbuchet; Dk : Doukara; As :Aghares ;

Dm: Deglet mahmoud; Db: Deglet bouda; Ah : Aharthan; Pc: Phoenix canariensis L.; Ch: Chamaerops humilis L.

Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc Ch

Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Pc Ch


48

Figure 21b: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)


Dm: Deglet mahmoud; Db: Deglet bouda; Ah: Aharthan; Pc: Phoenix canariensis L.; Ch: Chamaerops humilis L.

Figure 21a: Flavonoides observées à 365nm après révélélation au Neu

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)

Bm: Baouadhim; Tj: Timjuhert; Bk: Bamakhlouf; Wg: Warglia; Tn: Tinakour; Ad: Adoukli; Ag: Aghamou ;

Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.; Ch : Chamaerops humilis L.

Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc Ch

Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Pc Ch


49

- Extraits méthanoliques : Résultats du partage solide-liquide sur les extraits de palmier

dattier.

La comparaison des chromatogrammes des flavonoides sur les extraits aqueux et

des extraits méthanolique et hexanique (Figure 22) montre que:

- les extraits hexaniques ne possèdent pas de flavonoides. En effet, l’hexane solvant

apolaire élimine les lipides.

-les extraits méthanoliques semblent contenir une concentration plus élevée en

flavonoides , une plus forte fluorescence est obtenue pour certaines substances.

-le cultivar Aghamou sain et bayoudé montrent des différences qualitatives. L’extrait

méthanolique du cultivar Aghamou bayoudé ne possède pas la fluorescence jaune

orangée.

- le cultivar Deglet nour (sensible au bayoud) semble posséder plus de substances

fluorescentes jaunes que le cultivar Takerboucht (résistant au bayoud).

L'ensemble des ces remarques sont à prendre avec précaution car l'observation n'a

été faite que sur un individu par cultivar.

Figure 22: Flavonoides observés à 365nm sous UV des extraits aqueux

des Arecaceae étudiées.Système utilisé AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26) et révélés par le Neu

Ag : Aghamou ; Agb : Aghamou bayoudé; Tk : Takarbouchet; Dn : Deglet nour.

Ag Ag Agb Agb Ag Ag Agb Agb Tk Tk Dn DnMeOH Hexane MeOH Hexane MeOH Hexane MeOH Hexane

Extrait aqueux


50

Tableau 8: Tableau récapitulatif de l’analyse qualitative des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.

Q : Quenching ; FB : Fluorescence Bleu ; FJV : Fluorescence Jaune Vert ; FJO : Fluorescence Jaune Orange ; ( ) : Rf

Fluorescence

Avant révélation Après révélationcultivars

Nombre de

constituant

trouvés A 254 nm A 365 nm A 365 nm

Nature probable

des phytoconstituants

Baouadhim 6 Q (0.35) ; Q (0.45) ; Q (0.73)FB (0.56)

FJO (0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91) ;

FB (0.56)

Flavonoides-

acides phénoliques

Timjuhert / / / / /

Bamakhlouf / / / / /

Adoukli / / / / /

Aghamou / / / / /

Aghamou (Bayoud) / / / / /

Tgaza / / / / /

Aharthan / / / / /

Timliha / / / / /

Ghars / / / / /

Tinakour / / / / /

Deglet nour / / / / /

Takarbuchet / / / / /

Aghares / / / / /

Deglet mahmoud / / / / /

Deglet bouda / / / / /

Tinaceur 7 /FB (0.62)

FB (0.56)

FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FB (0.62) ; FJO(0.73); FJV(0.91) ;

FB (0.56)/

Baouarif 7 /FB (0.97)

FB (0.56)

FJO (0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;

FB (0.56)/

Warglia 7 /FB (0.97)

FB (0.56)

FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;

FB (0.56)/

Doukar (pied mâle) / / / / /

Phoenix canariensis 7 /FB (0.97)

FB (0.56)

FJO(0.35); FJO(0.45); FJV(0.50); FJO(0.73); FJV(0.91); FB (0.97) ;

FB (0.56)/

Chamaerops humilis 6 Q (0.73)FB (0.62)

FB (0.56)

FB(0.05); FJV(0.21); FJV(0.41); FB(0.62); FJO(0.73) ;

FB (0.56)/


51

1.2.1.3. Hydrolyse acide :

1.2.1.3.1. Identification des génines :

Après observation des trois hydrolysats, sous UV à 254 nm et à 365 nm avant et

après révélation, on constate que (Figure 23) :

Ø Les hydrolysats de Bamakhlouf, Chamaerops humilis et Phoenix canariensis

présentent une bande de même RF (0.52) correspondant à la quercétine.

Ø L’extrait Bamakhlouf présente une bande de plus de même RF (0.613) que

l’isorhamnétine.

Figure 23: Chromatogramme des aglycones des flavonoides observés à 365nm sous UV

des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé Toluène-AcOEt-HCOOH (50 :40 :10) et révélés par Neu

Pc : Phoenix canariensis L., Ch : Chamaerops humilis L.; Bk : Bamakhlouf; Irh : Isorhamnétine;

Kam : Kaempférol; Qrc : Quercétine ; Flal : Flavanol; Flan : Flavone.

1.2.1.3.2. Identification des glucides :

Cette hydrolyse acide a permis de détecter une tache ayant le même Rf

(0.375) que le monosaccharide galactose dans les trois extraits (Bamakhlouf,

Chamaerops humilis L. et Phoenix canariensis L.) (Figure 24).

Pc Ch Bk Irh Kam Qrc Flal Flan


52

Figure 24: Sucres observés après révélation au DPAP des extraits aqueux

des trois Arecaceae étudiées.Système utilisé CHCl3- MeOH- H2O (64 :40 :8)

Bk: Bamakhlouf; Ch: Chamaerops humilis L.; Pc: Phoenix canariensis L.; Gal: Galactose; Glu: Glucose; A.glu: Acide

glucuronique; Mel: Melibiose; Rha: Rhamnose; Xyl: Xylose; Ara: Arabinose; Fuc: Fucose; Ac.gal: Acide galacturonique.

1.2.1.4. Mise en évidence des tanins :

Le résultat a été positif sur l’ensemble des extraits aqueux, car la réaction au

chlorure ferrique donne un précipité bleu–noir (Figure 25) caractéristique des tanins.

Cependant l’intensité de la coloration est variable, elle est claire chez Chamoerops

humilis L.

+ FeCl3

Figure 25: Mise en évidence des tanins par réaction en tube

des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.

Bk Ch Pc Gal Glu Ac.glu Mel Rha Xyl Ara Fuc Ac.gal


53

y = 82,222x - 0,0294R2 = 0,9994

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03

concentration de l'acide gallique (mg/mL)

Abso

rban

ce à

765

nm

1.2.2. Autres métabolites secondaires:

Les réactions de mise évidence par CCM des quinones, des anthraquinones, des

coumarines, des lignanes, des dérivés anthracéniques, des sesquiterpènes lactones, des

saponines et des glycosides cardiotoniques dans les différents aqueux des Arecaceae

étudiées ont été négatives. En effet, aucune coloration ou fluorescence n’est apparue

après pulvérisation des révélateurs spécifiques correspondants aux métabolites

recherchés. Deux éventualités, soit ils sont absents, soit leurs faibles teneurs ne

permettent pas de les détecter avec les techniques utilisées.

1.3. Analyse quantitative :

1.3.1. Dosage des polyphénols totaux :

Les teneurs des polyphénols totaux des différents extraits ont été obtenues à partir

d’une courbe d’étalonnage établie avec des concentrations croissantes en acide gallique

(Figure 26). Elles sont exprimées en mg d’équivalents d’acide gallique par gramme de

l’extrait lyophilisé.

Figure 26: Courbe d’étalonnage des polyphénols totaux réalisée à l’aide

de l’acide gallique.

Les résultats sont regroupés dans le tableau 9. Il montre que les cultivars Ghars,

Deglet bouda, Aharthan, Adoukli, Baouarif, Aghamou et Aghares, ainsi que le pied

mâle ou Doukar (pied mâle) sont les plus riches en polyphénols totaux (>100mg/g).


54

Les autres cultivars Bamakhlouf Takarbuchet, Baouadhim, Warglia, Timjuhert,

Timliha, Tgaza, Tinakour, Tinasser, Deglet mahmoud, Deglet nour, Aghamou (Bayoudé)

ont des valeurs inférieures à 100 mg/ml de même que Phoenix canariensis L. Par contre

Chamaerops humilis L. est beaucoup moins riche en polyphénols. Ces résultats sont

représentés par la figure 27.

Tableau 9: Analyse quantitative des polyphénols de l’extrait aqueux des Arecaceae

étudiées.

Extraits aqueuxPolyphénols

(mg/g ± E.S)

Ghars 170,79 ± 2,393

Deglet bouda 143,121± 2,609

Aharthan 142,908 ± 10,329

Adoukli 135,162 ± 1,888

Baouarif 123,412 ± 4,491

Aghamou 120,007 ± 2,037

Aghares 104,682 ± 4,023

Takarbuchet 98,553 ± 3,498

Bamakhlouf 95,530 ± 4,413

Baouadhim 87,953 ± 1,852

Warglia 82,377 ± 4,413

Timliha 79,738 ± 4,187

Timjuhert 79,738 ± 3,003

Tgaza 79,440 ± 1,424

Tinakour 73,778 ± 3,622

Tinaceur 71,820 ± 2,801

Deglet mahmoud 68,968 ± 1,715

Deglet nour 57,943 ± 3,139

Cultivars des palmiers

dattiers

Aghamou bayoudée 47,897 ± 1,407

pied mâle Doukar 122,220 ± 3,945

Phoenix canariensis L. 98,766 ± 0,460Autres Arecaceae

Chamaerops humilis L. 25,209 ± 0,460

E.S : erreur standard.


55

y = 0,0454x - 0,11R2 = 0,9999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20 25

Concentration de la catéchine (ug/mL)

Abs

orba

nce

à 51

0 nm

-

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Extraits aqueux

Qua

ntité

s de

s po

lyph

énol

sto

taux

(mg/

g)

GharsDeglet boudaAharthanAdoukliBaouarifDoukaraAghamouAgharesPhoenix canariensisTakarbuchetBamakhloufBaouadhimWargliaTimlihaTimjuhertTgazaTinakourTinnaceurDeglet mahmoudDeglet nourAghamou bayoudéeChamaerops humilis

Figure 27: Histogramme représentant la quantité des polyphénols totaux par ordre décroissant,

exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 3 répétitions pour chaque concentration.

1.3.2. Dosage des Flavonoïdes:

Les teneurs en flavonoïdes des différents extraits végétaux ont été obtenues à

partir d’une courbe d’étalonnage établie avec des concentrations précises de catéchine

(Figure 28).

Figure 28: Courbe d’étalonnage des flavonoïdes réalisée à l’aide de la catéchine


56

Le tableau 10 montre que les cultivars Ghars, Aharthan, Deglet bouda, Adoukli,

Aghamou ont les teneurs les plus importantes en flavonoides, supérieures à 50 mg/g de

poudre lyophilisée. Les autres cultivars de palmier dattier de même que Phoenix

canariensis L. ont des teneurs inférieures à cette valeur. Chamaerops humilis L. a une

teneur plus faible, 17 mg/g de poudre lyophilisée. Ces résultats sont représentés par la

figure 29.

Tableau 10: Analyse quantitative des flavonoïdes des extraits aqueux des Arecaceae

étudiées. E.S : erreur standard

Extraits aqueuxFlavonoïdes

(mg/g ± E.S)

Ghars 69,075 ± 2,688

Aharthan 66,197 ± 3,397

Adoukli 59,413 ± 1,552

Deglet bouda 57,151 ± 2,166

Aghamou 52,423 ± 1,632


Baouarif 48,106 ± 2,136

Takarbuchet 45,022 ± 0,000

Aghares 43,789 ± 1,233

Warglia 40,910 ± 1,983


Tinakour 36,593 ± 0,942

Tinaceur 35,565 ± 0,356

Timliha 29,809 ± 1,552

Baouadhim 28,576 ± 1,884

Tgaza 27,959 ± 1,983

Timjuhert 27,753 ± 1,233



dattiers

Deglet nour 24,258 ± 0,712





57

-

10

20

30

40

50

60

70

80

Extraits aqueux

Qua

ntité

s de

s fla

vono

ides

(mg/

g)

GharsAharthanAdoukliDeglet boudaDoukaraAghamouBamakhloufBaouarifTakarbuchetPhoenix canariensisAgharesWargliaAghamou bayoudéeTinakourTinnaceurTimlihaBaouadhimTgazaTimjuhertDeglet mahmoudDeglet nourChamaerops humilis

Figure 29: Histogramme représentant la quantité des flavonoides par ordre décroissant,

exprimée en mg/g de poudre lyophilisée des extraits aqueux des trois Arecaceae étudiées.

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 3 répétitions pour chaque concentration

1.3.3. Dosage du partage solide-liquide:

Les résultats du dosage des teneurs en polyphénols et en flavonoides sur les

différents extraits de palmier dattier obtenus à partir du partage solide-liquide sont notés

dans le tableau 11.

Tableau 11: Dosage des polyphénols et des flavonoïdes des l’extraits obtenus par partage

solide liquide de cultivars de palmiers dattiers.

O

Cultivars Extraits

Polyphénols(mg d'acide

gallique/g d'extrait

lyophilisé)

flavonoïdes

(mg de catéchine / g

d'extrait lyophilisé)

H2O essai 1 123.758 ±2.454 53.506 ±4.878H2O essai 2 120.877 ±2,345 53.908 ±2,512Aghamou

MeOH 143.217 ±2,798 63.161 ±1,844H2O essai 1 44.156 ±2,068 31.782 ±1.844H2O essai 2 43.704 ±2,345 31.379 ±2.090Aghamou

bayoudé MeOH 66.721 ±5.902 34.598 ±1.844Takarbuchet MeOH 109.787 ±2.063 57.529 ±2.512Deglet nour MeOH 66.279 ±5.472 27.356 ±1.844


58

On note que la teneur en polyphénols et en flavonoides est plus élevée dans les

extraits méthanoliques que dans les extraits aqueux donc une meilleure solubilisation de

ces constituants dans le méthanol.

Parallèlement, le cultivar Aghamou bayoudé montre une plus faible teneur de ces

deux constituants que le cultivar sain.

Le cultivar Takerbucht (résistant au bayoud) a une plus forte teneur en polyphénols

et en flavonoides que le cultivar sensible Deglet nour.

1.4. Activité anti-radicalaire contre de DPPH par bioautographie :

Les chromatogrammes des différents extraits de palmiers dattiers révélés par une

solution de DPPH, présentent de nombreux constituants qui apparaissent sous forme de

spots de couleur jaune blanc sur fond violet (figure 30a, 30b.), et nous indique la rapidité

de décoloration d'une solution à 0,2 mg, de DPPH, en moins de 30 secondes.

Figure 30a: Screening de l’activité antioxydante par bioautographie

des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.Système utilisé: AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)

Bm : Baouadhim; Tj : Timjuhert; Bk : Bamakhlouf; Wg : Warglia; Tn : Tinakour; Ad : Adoukli; Ag : Aghamou ;

Agb : Aghamou(Bayoud); Tg : Tgaza; Br : Baouarif; Pc : Phoenix canariensis L.

Bm Tj Bk Wg Tn Ad Ag Agb Tg Br Pc


59

1.5. Dosage de l’activité antioxydante :

Le radical (DPPH) est utilisé pour déterminer la capacité antioxydante. En

présence d'un antioxydant le (DPPH) est réduit en DPPH-H et son absorbance

spectrophotométrique diminue.

Les examens réalisés à partir de différents extraits caractérisant l’activité

antioxydante des palmiers dattiers ont montré leur haute capacité antiradicalaire.

L'activité antioxydante est exprimée en pourcentage d'inhibition (P.I%) du radical

(DPPH) après 30 minutes d'incubation, en utilisant la formule suivante :

Abs (témoin) – Abs (antioxydant)

P.I % = x 100 (Wang et Mazza, 2002)

Abs (témoin)

Soit :

Abs : Absorbance à la longueur d’onde de 517 nm

La valeur de IC50, déterminée pour chaque extrait est définie comme étant la

concentration de substrat qui cause la perte de 50 % de l’activité de DPPH (Tableau 12).

Figure 30b: Screening de l’activité antioxydante par bioautographie

des extraits aqueux des Arecaceae étudiées.Système utilisé : AcOEt-HcooH-AcOH-H2O (100 :11 :11 :26)


Dm : Deglet mahmoud; Db : Deglet bouda; Ah : Aharthan; Ch : Chamaerops humilis L.

Th Gh Tc Dn Tk Dk As Dm Db Ah Ch


60

Tableau 12: Valeurs des IC50 de l’extrait aqueux des Arecaceae étudiées.

E.S : erreur standard

Extraits aqueuxIC50 ± E.S

µg/ml

Ghars 13,155 ± 0,279

Adoukli 16,394 ± 0,071

Aghamou 18,395 ± 0,352

Baouarif 18,739 ± 0,233


Aharthan 24,093 ± 0,078


Deglet bouda 26,610 ± 0,456

Warglia 27,590 ± 0,711

Timliha 28,880 ± 0,386

Timjuhert 29,482 ± 0,560

Baouadhim 31,259 ± 0,553

Tinakour 31,303 ± 0,488

Tgaza 31,970 ± 0,570

Tinnaceur 32,070 ± 0,167

Takerboucht 32,923 ± 0,664

Aghares 35,967 ± 0,405

Deglet nour 67,806 ± 1,203


dattiers





Quercétine 13,525 ± 0,129

Acide ascorbique 14,379 ± 0,058Témoins

BHA 17,907 ± 0,139


61

-50

100150200250300350400450

Extraits aqueux

IC50

(ug/

mL)

GharsQercétineAc, AscorbiqueAdoukliBHAAghamouBaouarifBamakhloufAharthanAghamou bayoudéeDeglet boudaDoukaraWargliaTimlihaTimjuhertBaouadhimTinakourTgazaTinaceurTakarbuchetAgharesPhoenix canariensisDeglet nourDeglet mahmoudChamaerops humilis

Les valeurs IC50 de chaque extrait aqueux étudiés sont déterminées graphiquement

à partir des droites représentant les pourcentages d’inhibition en fonction des

concentrations croissantes représentant la moyenne de trois tests séparés. (Figure 31).

Les valeurs d’IC50 des extraits aqueux ont été comparées aux IC50 des substances

de références qui sont la quercétine (13,52 µg/ml), l’acide ascorbique (14,37 µg/ml) et

BHA (17,90 µg/ml) (Tableau 12).

Le cultivar Ghars présente une IC50 de 13,155 µg/ml, cette valeur est inférieur aux

valeurs des trois substances de référence.

Le cultivar Adoukli a une valeur d’IC50 inférieure à la substance de référence : le

BHA. Ces deux cultivars présentent donc une très forte activité antioxydante.

Phoenix canariensis L. semble posséder une activité antioxydante supérieure aux

cultivars Deglet nour et Deglet mahmoud.

Par contre Chamaerops humilis L. possède une très faible activité antioxydante

comme en témoigne le chromatogramme (Figures: 30a, 30b).

Figure 31: Histogramme représentant les IC50 des extraits aqueux

des trois Arecaceae étudiées. Chaque valeur représente la moyenne ± ES

de 3 répétitions pour chaque concentration


62

2. Discussion :

Nous avons effectué des études phytochimiques en vue de mettre en évidence les

constituants du métabolisme secondaire des différents extraits aqueux des cultivars

de P. dactylifera L. et des extraits aqueux de P. canariensis L. et de Chamearops humilis

L. ainsi que l’activité antioxydante de ces mêmes extraits.

Un screening phytochimique a été réalisé par CCM et par spectrophotométrique

pour caractériser les cultivars de palmier dattier.

Les résultats de la chromatographie sur couche mince confirment la richesse des

extraits de feuilles de palmiers dattiers en substances polyphénoliques comme les

flavonoïdes et les acides phénoliques déjà identifiés par d’autres auteurs dans des études

précédentes (Ouafi et Bounaga, 2008).

Les chromatogrammes révèlent la présence de 6 bandes communes à tous les

cultivars de P. dactylidera L. et à l'espèce P. canariensis L.

Les bandes en question seraient probablement des flavonoïdes si l’on se réfère à

leur comportement (observation sous UV à 254 et 365 nm) avant et après révélation au

réactif du Neu : avant révélation, quenching à 254 nm et fluorescence à 365 nm ; après

révélation, intensification de la fluorescence à 365 nm. Les fluorescences observées sont

variables : jaune-orange, jaune-verte, bleue (Wagner et Bladt, 1996).

Par recoupement de ces résultats avec ceux de l’hydrolyse acide effectuée sur ces

extraits ainsi que les témoins authentiques utilisés, la nature probable de ces constituants

serait :

- Fluorescence jaune-orange : quercétine ou ses dérivés glycosidiques

- Fluorescence jaune-verte : isorhamnétine ou ses dérivés glycosidiques

- Fluorescence bleue : acides phénoliques

Les résultats obtenus par hydrolyse acide corroborent ceux obtenus par Ouafi et

al., 1988. Ces auteurs révèlent la présence d' aglycones flavoniques (deux flavones et

trois flavonols). L’hydrolyse acide a permis aussi de révéler le monosaccharide

galactose.

Les chromatogrammes révèlent également d’autres bandes particulières à certains

cultivars, notamment :

-une bande de fluorescence bleue avant et après révélation, de Rf 0,62, propre à la

variété Tinnaceur et à coté des autres bandes déjà observées chez les autres cultivars,


63

-une bande de fluorescence bleue avant et après révélation, de Rf 0,97, propre aux

variétés Baouarif, Warglia et Phoenix canariensis L. et en plus des autres bandes déjà

observées chez les autres cultivars.

- Chamaerops humilis présente un profil très différent des autres variétés. Six

bandes peuvent être distinguées : 3 de fluorescence bleue (Rf = 0,05- 0,56 et 0,62) ; 2 de

fluorescence jaune-verte (Rf = 0,21 et 0,41) et 1 de fluorescence jaune-orange de faible

intensité (Rf = 0,73). Cette dernière est probablement un dérivé de la quercétine si l’on se

réfère au chromatogramme de l’hydrolysat acide.

Ouafi et Bounaga, 2008 ont montré que l’équipement phénolique des feuilles de

palmier dattier est d’une grande diversité puisque les différentes familles phénoliques

sont représentées. Les flavono des, principaux polyphénols des feuilles sont

essentiellement des combinaisons avec des sucres : hétérosides de la quercétine, de

l’isorhamnétine comme flavonols. De la lutéoline, tricine et chrysoeriol comme flavone,

Quand au niveau des racines, on note l’absence des flavono des. Les dérivés hydroxy

cinnamiques (DHCS) ont été signalés dans les feuilles en tant que composés mineurs (3 à

6 % de la composition phénolique), alors qu’au niveau des racines, ils représentent la

quasi-totalité de l’extrait phénolique.

La composition phénolique soluble de la racine du palmier-dattier est dominée par

la présence de l’acide3- caféoyl shikimique (acide dactyliférique) et ses isomères (Ziouti

et al., 1996). Ces substances sont classiquement considérées comme caractéristiques de la

datte (Maier et al., 1964) , les acides p- coumariques, hydroxybenzoiques, férulique et

sinapique constituent l’essentiel des phénols liés aux différents constituants des parois

cellulaires.

Par ailleurs, les résultats obtenus ont montré que les teneurs en polyphénols et en

flavonoïdes sont plus élevées au sein du cultivar résistant Takerbucht que dans le cultivar

sensible Deglet nour. Cela semble confirmer le rôle attribué aux polyphénols dans la

défense des plantes contre les stress abiotiques. Il est à noter que d'autres cultivars

possèdent des teneurs plus élevées que Takerbucht et pourtant ce sont des cultivars

sensibles tel que le cultivar Ghars.

De plus, ce rôle de défense lié aux polyphénols n'a pas été observé dans la

comparaison des teneurs de ce constituant au sein d'un même cultivar Aghamou sain et

malade.


64

Les résultats et interprétations précédents sont à prendre avec précaution car le

travail n'a été fait que sur un individu par cultivar. Les seuls éléments de réponse

concernant la phytochimie des trois palmacées (P.dactylifera L., P.canariensis L. et

Chamaerops humilis L.) sont les différences obtenues au sein de ces deux genres..

Le test antioxydant effectué sur plaque CCM par révélation avec une solution de

DPPH présente une traînée où de nombreuses tâches actives montrent l'activité anti-

radicalaire des extraits aqueux de P. dactylifera L. et P.canariensis L. Cette activité peut

être expliquée par la présence des polyphénols dont l'activité antioxydante a été prouvée.

Par contre, Chamaerops humilis L. ne présente qu'une tache à intensité très faible ,donc

une faible activité antioxyante et conséquence d'une faible teneur en polyphénols.

Le dosage de l’activité antioxydante par DPPH montre que certains cultivars de

palmier dattier ont une activité antioxydante équivalente à celle des témoins utilisés tels

que Ghars et Adoukli. Cette forte activité dénote que l’extrait aqueux renferme des

substances réagissantes avec le radical du DPPH, ce qui a été montré dans les tests

phytochimiques effectués sur ces extraits.

L’activité antioxydante a été aussi trouvé dans les dattes de palmier dattier

(Mansouri et al., 2005 ; Allaith. 2008 ; Biglari et al., 2009).

D’après la bibliographie et les enquêtes sur le terrain, le palmier dattier est utilisé

comme plante médicinale (Bellakhdar,1997).En effet, il est utilisé contre les pathologies

oesophago-gastro-intestinaux, du système broncho-pulmonaire, de la sphère bucco-

dentaire, contre les affections oculaires, comme fortifiants, analeptiques et stimulants.

P. canariensis L. est aussi utilisé comme plante médicinale, contre les

pathologies de la peau (Bellakhdar, 1997).

De même que Chamaerops humilis L., il est utilisé contre les pathologies

oesophago-gastro-intestinaux, et il est astringent : ressert les tissus, modère les secrétions,

assèche les écoulements et facilite la cicatrisation. (De Lanessan, 1885)

Nous pensons que l'activité antioxydante résulte de la présence des polyphénols

et des flavonoides qui ont des propriétés médicinales. En effet, plusieurs études ont

rapporté que l’activité antioxydante des plantes qui ont des propriétés thérapeutiques est

due à la présence de substances naturelles principalement des polyphénols (Pokorny et

al., 2001).

Conclusion&

Perspectives

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

66

L'objectif de ce travail est la recherche des marqueurs d'identification à partir de

métabolites secondaires. Notre travail se veut une contribution à l'étude phytochimique

des différents groupes biochimiques du métabolisme secondaire des extraits aqueux de

cultivars de Phoenix dactylifera et des extraits de Phoenix canariensis et de Chamaerops

humilis.

Ø Les résultats montrent l’extrême similitude du profil phytochimique des cultivars,

à l'exception de certains cultivars Baouarif, Warglia, Tinaceur et Phoenix

canariensis L.

Ø Sur le plan quantitatif, on note des différences notables en ce qui concerne la

teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes entre les différents cultivars.

Ø Il est difficile d’établir une corrélation entre le profil phytochimique des cultivars

étudiés et leur statut de résistant ou sensible à la lumière des résultats obtenus.

Ø Cette approche chimiotaxonomique n'a pas permis de trouver des marqueurs

biochimiques qui correspondent d'une façon univoque pour chaque cultivar

Ø L’activité antioxydante des différents extraits est variable et révèle que certains

cultivars sont aussi actifs que les témoins authentiques utilisés. Tel est le cas de

Ghars qui présente l’IC50 la plus faible (et donc l’activité est la plus forte) et

Baouarif dont l’activité est sensiblement similaire à celle du BHA. Ghars est par

ailleurs le cultivar qui renferme également les teneurs en polyphénols totaux et en

flavonoïdes les plus élevées.

Ø Les résultats de ces travaux sont insuffisants et ne nous permettent pas de valider

l'utilisation des deux espèces de Phoenix '(dactylifera et canariensis) en médecine

traditionnelle, bien que tous les extraits aqueux de ces deux espèces ont donné une

activité antioxydante. Il est nécessaire de tester d'autres activités biologiques pour

confirmer les propriétés médicinales de ces deux espèces.

Ce travail n'est pas un aboutissement mais il est à poursuivre en prenant quelques

précautions :

Ø travailler sur plusieurs individus par cultivar.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

67

Ø prendre des palmiers du même âge, bien que ce facteur est très difficile à prendre

en considération dans des palmeraies.

Ø séparer les pennes d’une palme malade montrant une hémiplégie (pennes vertes et

pennes brunâtres).

Ø caractériser d'autres métabolites secondaires.

Ø poursuivre d'une part l’investigation avec des extraits de polarité différente et

d'autre part mettre l’accent sur les particularités phytochimiques de certains

cultivars.

Référencesbibliographiques

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

69

Allaith A.A., 2008. Antioxidant activity of Bahraini date palm (Phoenix dactylifera L.)fruit of various cultivars. International Journal of Food Science and Technology, 43, 1033-1040.

Baaziz M. et Saaidi M., 1988. Preliminary identification of date palm cultivars by esteraseisoenzymes and peroxidase activities. Can. J. Bot., 66, 89-93.

Baaziz, M., 1989. The activity and preliminary characterization of peroxidases in leaves ofcultivars of date palm, Ph nix dactylifera L. New Phytol., 111, 403-411.

Barrow, S. C. 1998. A monograph of Ph nix L. (Palmae: Coryphoideae). Kew Bull.,53,533.

Bellakhdar J., 1997. La pharmacopée marocaine traditionnelle. Médecine arabe ancienneet savoirs populaires. Ibis Press, p.247.

Belguedj M. 2002. Les ressources génétiques du palmier dattier, caractéristiques descultivars de dattiers dans les palmeraies du Sud-Est Algérien. Institut national de larecherche agronomique d’Algérie p. 289.

Bennaceur M., Lanaud C., Chevalier M.H. et Bounaga N., 1991. Genetic diversity ofthe date Palm (Ph nix dactylifera L.) from Algeria revealed by enzyme markers. PlantBreeding, 107, 56-69.

Benslimane A.A., Rode A. et Hartmann C., 1994. Characterization of two minicircularplasmid-like DNAs isolated from date palm mitochondria. Curr. Genet., 26, 535-541.

Bendiab K., 1998. Contribution à l'étude de la variabilité des hydrolases et des transféraseschez le palmier dattier (Ph nix dactylifera L.). Apport à l'amélioration et l'étude de lastructure génétique des palmeraies marocaines. Thèse de Doctorat d'Etat ès-Sciences,Université Cadi Ayyad, Marrakech (Maroc).

Bendiab K., Baaziz M., et Majourhat K., 1998. Preliminary date palm cultivarcomposition of Moroccan palm groves as revealed by leaf isoenzyme phenotypes.Biochemical Systematics and Ecology, 26, 71-82.

Benkhalifa A., 1999. Gestion de la diversité génétique du palmier dattier en Algérie.Atelier 'Constitution et organisation d'équipes de recherche scientifique dans les domainesde foresterie et des arbres fruitiers', Marrakech, 13-15 Avril.

Berthod A., Billardello B. et Geoffroy S., 1999. Polyphenols in countercurrentchromatography. An example of large scale separation1. Analusis. EDP Sciences, Wiley-VCH, 27, 750-757.

Beta T., Nam S., Dexter J. E. et Sapirstein H.D., 2005. Phenolic Content and AntioxidantActivity of Pearled Wheat and Roller-Milled Fractions. Cereal Chem., 82 (4), 390–393.

Biglari F., Alkarkhi AF., Easa AM., 2009. Antioxidant activity and phenolic content ofvarious date palm (Phoenix dactylifera L.) fruits from Iran. Food Chemistry, 107, 1636–1641.


70

Biglari F., Alkarkhi AF., Easa AM., 2009. Cluster analysis of antioxidant compounds indates (Ph nix dactylifera L.): Effect of long-term cold storage. Food Chemistry, 112 (04),998-1001.

Bouguedoura N., 1991. Connaissance de la morphogenèse du palmier dattier (Ph nixdactylifera L.). Etude in situ et in vitro du développement morphogénétique des appareilsvégétatif et reproducteur. Thèse. Doct. USTHB. Alger, p. 20 l.

Bouchireb N. et Clark M.S., 1997. The application of biotechnology to date palm culture.Plant Biotechnology and plant genetic Resources for Sustainability and Productivity.Edited by Kazuo Watanabe and Eija Pehu Academic Press, p.183-195.

Bounaga N. 1991. Groupe palmier dattier ((Ph nix dactylifèra L): rappels biologiques etproblèmes physiologiques. In Physiologie des arbres et arbustes en zones arides et semi-arides de Riedacker A., Dreyer E., Pafadnam C., Joly H. et Bory G. Edition John Libbey,Eurotext, p.476.

Brac de la Perrière R. A., et Benkhalifa A., 1989. Identification des cultivars de dattiers(Ph nix dactylifera L.) du Sud-Ouest Algérien. Plant Genetic Resources Newsletter 78/79 :13-19.

Burton G.W., Traber M.G. et Acuff R.V., 1998. Human plasma and tissue alpha-tocopherol concentrationsin response to supplementation with deuterated natural andsynthetic vitamin E. Am J Clin Nutr., 67, 669-684.

Buchanan B.B., Gruissem W., et Russell R.L., 2000. Biochemistry and molecularbiology of plants. American Society of Plant Physiologists; Rockville, Maryland, p.1367

Cavin A., 1999. Investigation phytochimique de trois plantes Indonésiennes aux propriétésantioxydante et antiradicalaire: Tinospora crispa (Ménispermacées), Merremia emarginata(Convolvulacées) et Oropea enneandra (annonacées). Thèse de Doctorat, Lausanne, p.241.

Corniquel B. et Mercier L., 1994. Date-palm (Ph nix dactylifera L.) cultivaridentification by RFLP and RAPD. Plant Sci., 101, 163-172.

Cowan M.M., 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical MicrobiologyReviews, 12 (4), 564–582.

De Lanessan J.L., 1885. Les plantes utiles des colonies françaises. Imprimerie nationale.Paris, p. 579.

Dubey V. S, Bhalla R. et Luthra R., 2003. An overview of the non-mevalonate pathwayfor terpenoid biosynthesis in plants. J. Biosci., 28 (5), 637-646.

Ekoumou C., 2003. Etude phytochimique et pharmacologique de 5 recettes traditionnellesutilisées dans le traitement des infections urinaires et de la cystite. Thèse PharmacieBamako, p. 147.


71

Fry S.C., 1988. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. LongmanScientific and Technical, ed., Harlow, Essex, UK.

Goodwin T.W. et Mercer E.I., 1983. Int. Plant Biochem., 2nd ed., Pergamon Press, NY,p. 677.

Guerradi M., Outlioua K. et Hamdouni N ., 2005. Projet RAB98/G31. Inhttp://www.maghrebdatepalm.org/ (Consulté le 04/01/2009)

Guignard. J. L., 2000. Biochimie végétale, Masson, Paris, p. 215-230.

Hannachi S, Benkhalifa A, Khtiri D. et Brac de la Perriere R.A. 1988. Inventairevariétal de la palmeraie algérienne. Commissariat au Développement de l’agriculture desrégions Sahariennes (CDARS)- Unité de Recherche sur les Zones Arides (URZA) del’Université des Sciences et Technologie «Houari Boumedienne». République Algérienne,p. 225.

Harborne J.B., 1989. Methods in plant biochemistry, In: Plant phenolics. Academic Press,London,UK.

Harborne J. B. et Williams C. A. 2000. Advances in flavonoid research since 1992.Phytochemistry, 55, 481-504.

Hale A.L., 2003. Screening Potato Genotypes for Antioxidant Activity, Identification ofthe Responsible Compounds, and Differentiating Russet Norkotah Strains Using Aflp andMicrosatellite Marker Analysis. Office of Graduate Studies of Texas A&M University.Genetics, p. 260.Hopkins G.W. et Evrard C-M., 2003. Physiologie végétale. De Boeck Université, ed, p.532

Igor Passi L B., 2002. Etude des activités biologiques de Fagara zanthoxylo_desLam.(Rutaceae). Thèse Pharmacie, Bamako, p. 133.

Jahiel M., 1996. Phénologie d’un arbre méditerranéen acclimaté en région tropicale.Le dattier au sud du Niger et son appropriation par la société Manga. Thèse. Doct.Université Montpellier II. Sc. Tech. Languedoc., p. 239.

Jovanovic S.V., Steenken S., Tosic M., Marjanovic B., Simic M.G., 1994. Flavonoids asantioxidants. J. Am. Chem. Soc., 116, 4846-4851.

Kim D.O., Chun O.K, Kim Y.J., Moon H.Y. et Lee C.Y., 2003. Quantification ofpolyphenolics and their antioxidant capacity in fresh plums. Journal of Agricultural andFood Chemistry, 51, 6509-6515.

Lugasi A., H vari J., Sagi K.V. et Bir L., 2003. The role of antioxidant phytonutrientsin the prevention of diseases. Acta Biologica Szegediensis. 47(1-4), 119-125.

Maydani M., 2000. Vitamin E and prevention of heart disease in high-risk patients. NutrRev., 58, 278-281.

http://www.maghrebdatepalm.org/


72

Mansouri A., Embarek G., Kokkalou E. et Kefalas P., 2005. Phenolic profile andantioxidant activity of the Algerian ripe date palm fruit (Phoenix dactylifera L.). FoodChemistry, 89, 411–420.

Meister A., 1983. Selective modification of glutathione metabolism. Science, 220, 472-477.

Munier P., 1973. Le palmier dattier. Ed. Maisonneuve et Larose, Paris, p. 209.

Ouafi S., 1987. Etude chimiotaxinomique par les flavonoïdes des cuttivars de palmiersdattier de la station de l’INRA de ADRAR. Thèse de magister, U.S.T.H.B, p. 125.

Ouafi S., Brac de la Perrière R.A., Bounaga N. et Lebreton PH., 1992. Les flavonoïdes,marqueurs infra spécifiques chez le palmier dattier (Ph nix dactylifera L.) Complexed’espèces, flux de gènes et ressources génétiques des plantes. Colloque International enhommage à Jean Pernès. Paris du 8-10 Janvier. Publications du bureau des ressourcesgénétiques (BRG), 567-568.

Ouafi S., Gaceb – Terrak R , Bounaga N. et Lebreton PH, 1988. Les flavonoïdesmarqueurs infraspécifiques chez le palmier dattier Ph nix dactylifera L. C. R. Aca. Sci.,306 (3), 399 404.

Ouafi S. et Bounaga N., 2008. Les glycosides flavoniques marqueurs de cultivars algériensdu palmier-dattier Phoenix dactylifera L. Acta Bot. Gallica, 2008, 155 (2), 307-315.

Oomah B.D., 2003. Isolation, characterization and assessment of secondary metabolitesfrom plants for use in human health. PBI Bulletin (Plant Biotechnology institute, NRC),Saskatoon, 1, 26-27.

Packer L., Witt EH., et Tritschler HJ., 1995. Alpha-Lipoic Acid as a BiologicalAntioxidant. Free Radical Biology and Medicine, 19 (2), 227-250.

Pichersky E., Gang D. R., 2000. Genetics and biochemistry of secondary metabolites: anevolutionary perspective. Trends in Plant Science, 5, 439– 445.Pietta P.G. 2000. Flavonoids as Antioxidants. J. Nat. Prod., 63, 1035-1042.

Pincemail J., Meurisse M., Limet R. et Defraigne J.O., 1998. Mesure et utilisationdes antioxydants en médecine humaine. MS., 73.

Pokorny, S. B., Jason, L. A., Schoeny, M. E., Townsend, S. M. et Curie, C. J., 2001. Doparticipation rates change when active consent procedures replace passive consent?Evaluation Review, 25(5), 567-580.

Psotove J., Lasovsk J. et Vi ar J., 2003. Metal-Chelating Properties, ElectrochemicalBehavior, Scavenging And Cytoprotective Activities Of Six Natural Phenolics.Biomed. Papers, 147(2), 147–153.

Ribéreau-Gayon, J., 1968. Les composés phénoliques des végétaux. Traité d’oenologie.Edition Dunod, Paris, 13-15, 116-119.


73

Rizk A M., 1982. Constituents of plants growing in Qatar. Fitoterapia, 52(2), 35-42.

Roberto Lo Scalzo, 2008. Organic acids influence on DPPH, scavenging by ascorbic acid.Food Chemistry,107, 40-43.

Sekhar K.N.C., Mason D.A., 1988. Quantitative palm structure and protéine Phytochem.,28, 1331-1333.

Sedra My H., Lashermes P., Trouslot P., Combes M.C., et Hamon S., 1998.Identification and genetic diversity analysis of date palm (Ph nix dactylifera L.) varietiesfrom Morocco using RAPD markers. Euphytica, 103, 75-82.

Scandalios J.G., 1974. Isoenzymes in development and differentiation. An. Rev. PlantPhysiol., 58:25-225.

Shahidi F, 1997. Natural antioxidants: a review, In: Natural Antioxidants, Chemistry,Health Effects, and Applications, Shahidi F (ed.), Champaign, Illinois, AOCS Press, 1–11.

Svoboda K.P. et Hampson J.B., 1999. Bioactivity of essential oils of selectedtemperate aromatic plants: antibacterial, antioxidant, anti-inflammatory and otherrelated pharmacological activities. Plant Biology Department, SAC Auchincruive, Ayr,Scotland, UK., KA6 5HW.

Toutain G., 1979. Eléments d’Agronomie saharienne. INRA cd, p. 273.

Torres A.M. et Tisserat B., 1980. Leaf isoensymes as genetic markers in date palm Amer.J. Bot., (2): 162-167.

Tirichine H.S., 2007. Essai de mise en évidence de la conformité génétique des vitroplants du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) par l'utilisation des marqueursenzymatiques. Mémoire de DES. Université d'Oran Es-Sénia, p. 52.

Uhl N.W. et Dransfield J., 1987. Genera Palmarum: A Classification of Palms Based onthe Work of Harold E. Moore, Jr. (Hardcover). Allen Press, P. 6l0.

Vansant G., 2004. Radicaux libres et antioxydants: principes de base. Symposium«Antioxydants et alimentation». Institut Danone.

Verscheure M., Lognay G. et Marlier M., 2002. Les méthodes chimiques d’identificationet de classification des champignons. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., 6 (3), 131–142.

Wagner H. et Bladt S., 1996. Plant drug analysis, a thin chromatography atlas. Springer-Verlag, ed., Berlin. 2nd edition.

Wang J. et Mazza G., 2002. Effects of Anthocyanins and Other Phenolic Compounds onthe production of tumor necrosis factor in LPS/IFN- -Activated RAW 264.7.Macrophages. J. Agric. Food Chem., 50, 4183-4189.

Wichtel M. et Auton R., 1999. Plantes thérapeutiques, Ed. Tec et Doc., 35, 188.


74

Wrigley G., 1995. Date palm, Ph nix dactylifera L.(Palmae) In: Evolution of crop plants.Smartt J. et W Simmonds N. 2nd edition. Longman Scientific and Technical, UK, 399-403.

Zehdi S., Trifi M., Billotte N., Marrakchi M. et Pintaud J.C., 2004. Genetic diversity ofTunisian date palms (Ph nix dactylifera L.) revealed by nuclear microsatellitepolymorphism. Hereditas, 141 (3), 278-287

Ziouti A., El Modafar C., El Boustan L. et Macheix J., 1996. Identification des acidescafeoylshikmiques des racines du palmier dattier, principaux composés fongitoxiques vis-à-vis du Fuasarium orysporium f.sp albedinis. J. Phytopathology, 144, 197- 202.

Annexes

ANNEXES

76

MODE D’UTILISATION DES REACTIFS CHIMIQUES POUR LAREVELATION DES CCM

Tableau 13: Réactifs chimiques pour la révélation des CCM (Wagner et Bladt, 1996).

Réactifs subst. révélées Mode d’utilisation

Folin

-Cio

calte

u *

Acidesphénoliques

libres

Pulvériser. Attendre 1-2 min et noter les taches. Mettre laplaque dans une cuve contenant un bécher rempli d’unesolution d’ammoniaque concentré jusqu'à ce que le fondjaune se décolore. Noter toute tache apparaissant.Résultats : Taches bleues-noires. Celles forméesimmédiatement possèdent des groupements - ou O-dihydrobenzène ; celles formées après fumigation del’ammoniaque, n’en possèdent pas. Les taches sont stables àl’obscurité.

Dra

gend

orff

Alcaloïdes,composés azotéshétérocycliques

Solution acide d’iodobismuthate de potassium :A : 10 mL d’AcOH glacial + 40 mL d’eau distillée + 0,85 gde nitrate de bismuth basique (chauffer et filtrer sinécessaire) ; B : 20 mL d’eau distillée + 8 g d’iodure depotassium. Mélanger 5 mL de A et 5mL de B avec 20 mLd’AcOH glacial et 100 mL d’eau distillée. Pulvérisation etchauffage (éventuellement) jusqu'à apparition d’une couleurbrun ou orange-brunâtre (visible).

KO

H Anthrones etanthranols

KOH 5-10 % dans l’EtOH. Après pulvérisation et chauffageles anthrones et anthranols apparaissent fluorescents enjaunes sous UV 365 nm.

KO

H

CoumarinesKOH 5-10 % dans l’EtOH, chauffer jusqu'à apparition descouleurs (intensification de la fluorescence).

KO

H Dérivésanthracéniques

KOH 5-10 % dans l’EtOH. Après pulvérisation et chauffageles dérivés anthracéniques apparaissent rouges en visible etfluorescents en rouge sous UV 365 nm.

Neu Flavonoïdes

Mélange (5 : 4 v/v) de 2-aminoéthyldiphényl borinate (2 %m/v dans MéOH) et de PEG 4000 (5 % m/v dans EtOH). Leréactif de Neu met en évidence les flavonoïdes (flavonols,flavones) : les composés ortho-hydroxylés sur le noyau Bapparaissent jaunes-orangés à orangés et lesmonohydroxylés jaunes-verts à jaunes.

SbC

l 3 Glycosidescardiotoniques

Pulvérisation par le chlorure d’antimoine 20 % dans CHCl3ou EtOH. En lumière visible, les glycosides cardiotoniquesapparaissent verts, violets ou bruns ; en UV-365, lesfluorescences sont variables.

ANNEXES

77

Tableau (Suite) :

Réactifs subst. révélées Mode d’utilisation

Van

illin

e A

c-Ph

osph

oriq

ue

Lignanes

A : 1 g de vanilline dans 100 mL Ac phosphorique à 50 %,B : 2 parties Ac phosphorique à 24 % + 8 parties d’Acvanillique à 2 % dans l’EtOH. La plaque est pulvérisée parA ou B. Après chauffage, en lumière visible les lignanesapparaissent en bleus-rougeâtres ; en UV-365, lesfluorescences apparaissent en violettes, violettes-rougeâtres, bleues-violettes.

Van

illin

eH

2SO

4

Lignanes

A : vanilline à 1 % dans l’EtOH, B : H2SO4 à 10 % dansl’EtOH. La plaque est pulvérisée par A ou B. Aprèschauffage, en lumière visible les lignanes apparaissent enViolets-rougeâtres ; en UV-365, la fluorescence apparaisseen rouges.

SbC

l 3

LignanesPulvérisation par le chlorure d’antimoine 20 % dans CHCl3ou EtOH. Après chauffage, en UV-365, les fluorescencesapparaissent jaunes, bleues.

KO

H

Quinones libres KOH 5-10 % dans l’EtOH. Pulvérisation et chaufferjusqu'à l’apparition d’une couleur rougeâtre (visible).

Kom

arow

sky

Saponines

Mélange (5 : 1 v/v) de -hydroxybenzaldéhyde (2 % m/vdans MeOH) et H2SO4 50 % dans l’EtOH. Pulvérisation etchauffage avec le pistolet thermique jusqu'à apparitiond’une couleur brune-grisâtre (visible).

Zim

mer

man

n

Sesquiterpèneslactones

A : 10 g de dinitrobenzène + 90 mL de toluène, B : 6 g deNaOH + 25 mL H2O + 45 mL MéOH. La plaque estd’abord pulvérisée avec A puis par B. Les sesquiterpènesapparaissent colorées en violettes-grisâtres après unchauffage par le pistolet thermique (visible).

Ani

sald

éhyd

e

Triterpènes

Un volume de 0,5 mL d’anisaldéhyde est mélangé dontl’ordre, à 10 mL AcOH glacial, 85 mL MéOH et 5 mLH2SO4. Pulvérisation et chauffage avec le pistoletthermique jusqu'à apparition d’une couleur Violet ou bleu-violette (visible).

* (Fry, 1988)

ANNEXES

78

EXPRESSION DES RESULTATS DES DOSAGES

1. Expression des résultats des polyphénols totaux :

Exemple de Phoenix canariensis présentant une DO de 0.74.

D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :

y = 82.222 x – 0.0294 x = (y + 0.0294) / 82.222 avec y = DO x = (0.74 +0.0294)/ 82.222 = 0.0094 mg/ml

On multiplie cette valeur par 21 qui correspond au facteur de dilution de notre

échantillon ( = 100 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2100 µL (volume réactionnel)

= 1/21).

Donc x’= x × 21 = 0.0094 × 21 = 0.1974 mg/ml

La solution mère de Phoenix canariensis est à 2 mg/ml

On a 0.1974 mg/ml 2 10-3 g/mL

x’’ 1g

x’’= 0.1974. 103 / 2

x’ = 98.7 mg

Donc Phoenix canariensis contient 98.7 mg de polyphénols totaux par g de poudre

lyophilisée.

2. Expression des résultats des flavonoïdes:

Exemple de Chamaerops humilis qui présente une DO de 0.17.

D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :

y = 0.0454x – 0.11 x = (y + 0.11) / 0.0454 avec y = DO

x = (0.17 + 0.11) / 0.0454

x = 6.167 µg/ml

On multiplie cette valeur par 5.6 qui correspond au facteur de dilution de notre

échantillon ( = 500 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2800 µL (volume réactionnel)

= 1/5.6)

Donc x’= x × 5.6 = 6.167 × 5.6 = 34.54 µg/ml

ANNEXES

79

La solution mère de Chamaerops humilis est à 2 mg/ml

On a 34.54 µg/ml 2 10-3 g/ml

x’’ 1g

x'' = 34,54 10-6 g/ml / 2.10-3

x''= 34,54 10-3 / 2 = 17,27 10 -3 g / ml = 17,27 mg /ml

Donc Chamaerops humilis contient 17.27 mg de flavonoïdes par g de poudrelyophilisée.

Caractérisation phytochimique et activité antioxydante de ... · Ministère de l’enseignement...

Documents

Transcript of Caractérisation phytochimique et activité antioxydante de ... · Ministère de l’enseignement...