Bon Exo Biochi Tout

8/2/2019 Bon Exo Biochi Tout

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BIOCHIMIE I(CHMI 2227 F)

Problmes et solutions

Eric R. Gauthier, Ph.D.

Dpartement de chimie et de biochimieUniversit Laurentienne

Janvier 2007


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Note:

Ce cahier d'exercice est destin avant tout aux tudiants qui sont inscrits au cours Biochimie I(CHMI 2227F) tel qu'offert l'Universit Laurentienne. Il comporte de nombreux exercices etproblmes tires soit de manuels de rfrence, soit de l'imagination de l'auteur.

Quoique la majorit des problmes retrouvs dans ce manuel peuvent tre rsolus assez aisment l'aide des notes de cours, certains problmes d'un niveau de difficult plus avanc furent aussiinclus. Ainsi, les problmes marqus d'une astrisque (*) ncessiteront davantage de recherchede la part de l'tudiant(e). Quand aux problmes marqus d'une double astrisque (**), qui sontpeu nombreux, ils devraient constituer un excellent dfi pour l'tudiant intress les rsoudre.

L'tudiant(e) trouvera aprs la section "Problmes" la solution dtaille de tous ces exercices.Pour des raison pdagogiques videntes, nous suggrons l'tudiant(e) de n'y avoir recoursqu'aprs avoir pris le temps de rflchir sur le problme.

La liste des pKas et pI des 20 acides amins naturels, ainsi que le tableau du code gntique, sontinclus en annexe la fin de la section "Problmes".

Les manuels de rfrence suivants furent consults lors de l'laboration de cet ouvrage:

1) Kuchel, P. W. et Ralston, G. B. Biochimie 1. Cours et problmes. Srie Schaum. McGraw-Hill. 1989.

2) Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Principles of Biochemistry. 2ime dition. WorthPublishers. 1993.

3) Mathews, C. K. et van Holde, K. E. Biochemistry. 2ime dition. Benjamin/CummingsPublishing Company, INC. 1996.

4) Rawns, J. D. Trait de biochimie. Editions du renouveau pdagogique. 1990. (disponible larserve de la bibliothque).

5) Wood, W. B., Wilson, J. H., Benbow, R. M., Hood, L. E. Biochemistry. A ProblemsApproach. Benjamin/Cummings Publishing Company, INC. 1981. (disponible la rserve de labibliothque).

6) Zubay, G. L., Parson, W. W., Vance, D. E. Principles of Biochemistry. Wm. C. BrownPublishers. 1995.

Des exercices et problmes supplmentaires peuvent tre trouvs dans ces rfrences.


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Problmes


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Chapitre 1 : quilibre acide-base et spectrophotomtrie

1.1quilibre acide-base :Quel est le pH de chacune de ces solutions?

a) Acide chlorhydrique 0.35M

b) Acide actique 0.35M (pKa=4.76)c) Acide actique 0.035M

1.2quilibre acide-base :Un acide faible HA dune concentration totale de 0.20M est ionis (dissoci) 2%.

a) Quel est le Ka de cet acide?b) Quel est le pH de cette solution?

1.3quilibre acide-base :Quel est le pH des mlanges suivants :

a) 1M dacide actique avec 0.5M dactate de sodiumb) 0.3M dacide phosphorique avec 0.8M de KH2PO4 (pKa=2.14)

1.4quilibre acide-base :Vous dsirez prparer une solution tampon de pH = 7.00 en utilisant du KH2PO4 et Na2HPO4(pKa=7.21). Si vous disposez dune solution de 0.1M de KH2PO4, quelle devra-tre laconcentration de Na2HPO4 que vous devrez utiliser?

1.5quilibre acide-base :Vous dsirez prparer une solution tampon de pH=7.00 en utilisant du KH2PO4 et du Na2HPO4.

Quelles devront-tre les concentrations respectives de ces substances si vous dsirez obtenir uneconcentration finale en phosphate ([HPO4-2] + [H2PO4

-1]) de 0.3M?

1.6 Spectrophotomtrie :Quelle sera la concentration de lacide amin tyrosine (=1 420 L mol-1 cm-1) si on obtient uneabsorbance de 0.71 laide dune cuvette de 1cm? Avec une cuvette de 0.1 cm?

1.7 Spectrophotomtrie :Quelle sera labsorbance dune solution de 37 mM de tyrosine?

1.8 Spectrophotomtrie :

Vous dsirez dterminer la concentration dhmoglobine dans un chantillon sanguin parspectrophotomtrie. Pour cela, vous tablissez une courbe standard de labsorbance 412 nm desolutions dhmoglobine de concentration connues. Les rsultats obtenus sont prsents dans letableau ci-dessous. Quelle est la concentration (en g/mL) en hmoglobine dans votrechantillon, si vous obtenez une valeur dabsorbance 412 nm de 0.303?


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Absorbance(412nm)

Concentration dustandard (g/mL)

0.069 10.113 2

0.201 40.377 80.730 16

Chapitre 2: Acides amins

* 2.1. Masse molculaire d'un acide amin.1.812 g d'un acide -amin cristallis (pKa1: 2.4; pKa2; 9.7) donne une solution de pH 10.4quand il est dissout dans 100 mL de NaOH 0,1M. Calculez la masse molculaire de cet acideamin.

2.2. Courbe de titrage.Calculez le pI de l'histidine et tracez sa courbe de titrage. Indiquez la position du pI, des pKas,ainsi que le pourcentage des formes ioniques chacun des pKas ainsi qu'au dbut et la fin dutitrage. La liste des pKas des 20 acides amins est disponible la fin de la section Problmes du cahier dexercices.

2.3. Charge nette des acides amins.Quelle est la charge nette (+, 0, -) de chacun des acides amins suivants: glycine, srine, acideaspartique, glutamine et arginine, :

a) pH 2.01 b) pH 3.96 c) pH 5.68 d) pH 10.76

2.4. Chromatographie changeuse d'ions.On spare un mlange de lysine, glycine, alanine, isoleucine et d'acide glutamique parchromatographie changeuse d'ions. Quel sera l'ordre d'lution des acides amins si on utilise untampon allant progressivement de pH 10 pH 2, et si on utilise:

a) une rsine changeuse de cations

b) une rsine changeuse d'anions

Quelle est selon vous la colonne donnant la meilleure sparation?

2.5. Acides aminsQuels acides amins peuvent tre convertis en d'autres acides amins par hydrolyse douce, aveclibration d'ammoniaque?


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2.7. Acides aminsLa phosphosrine se retrouve dans les hydrolysats enzymatiques de la casine, une protine dulait. Cependant, elle ne fait pas partie des 20 acides amins cods lors de la synthse protique.Fournissez une explication plausible.

*2.8. Chromatographie changeuse d'ions.La glycine, l'alanine, la valine et la leucine peuvent tre spars efficacement parchromatographie changeuse d'ions. Pourtant les pKas de ces acides amins sont presque

identiques. Expliquez ce comportement des acides amins.

2.9. Peptides.Un petit peptide a t hydrolys et on a effectu l'analyse de ses acides amins. En outre, commel'hydrolyse acide dtruit le tryptophane, on a estim le contenu en tryptophane par une mesure auspectrophotomtre. D'aprs les donnes fournies ci-dessous, tablissez la formule empirique dupeptide:

Acide amin mmolAla 2.74

Glu 1.41

Leu 0.69

Lys 2.81

Arg 0.72

Trp 0.65

2.10. Peptides.

Dessinez la structure du peptide GWYQR. Indiquez la forme ionise de ce peptide aux pHsuivants:

a) pH 2.0 b) pH 7.0 c) pH 10.5

CH2-CH2-CH-COOHO

PO3-2

NH2

Phosphosrine


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Chapitre 3. Proprits gnrales et purification des protines

3.1. Purification des protines.Pourquoi utilise-t-on souvent la procdure de prcipitation au sulfate d'ammonium comme tapeinitiale de purification d'une protine?

3.2. Purification des protines.Une colonne de DEAE cellulose est rarement utilise un pH suprieur 8.5. Pourquoi?

3.3. Purification des protines.La 6-phosphogluconate dshydrognase possde un pI de 6. Expliquez pourquoi le tamponutilis lors d'une chromatographie sur DEAE-cellulose devra avoir un pH suprieur 6 maisinfrieur 9 pour que l'enzyme puisse lier efficacement la colonne.

3.4. Purification des protines.Est-ce-que la 6-phosphogluconate dshydrognase pourra se lier une rsine de CM-cellulose si

on utilise les mmes conditions de tampon qu'au problme prcdent? Pourquoi?

3.5. Purification des protines.Rfrant au problme prcdent, quel pH approximatif le tampon devra-t-il possder afin depermettre la dshydrognase de lier efficacement la colonne de CM-cellulose?

3.6. Purification des protines.On charge une colonne de DEAE-cellulose pH 6.5 avec un mlange de protines: ovalbumine(pI 4.6), urase (pI 5.0), et myoblobine (pI 7.0). La colonne est lue avec un tampon de faibleforce ionique pH 6.5, puis avec le mme tampon contenant des concentrations croissantes dechlorure de sodium. Dans quel ordre les protines apparatront-elles dans l'luant?

3.7. Purification des protines.Une enzyme (Mr 24 kDa, pI 5.5) est contamine par deux autres protines, l'une de massemolculaire analogue et de pI 7.0, et l'autre de Mr 100 kDa et de pI 5.4. Suggrez un protocolegnral de purification de l'enzyme.

3.8. Purification des protines.Une procdure servant purifier la 6-gluconate dshydrognase dE. coli est prsente ci-dessous.

a) Pour chaque tape, calculez (1) l'activit spcifique, (2) le pourcentage de rendement par

rapport la quantit initiale d'enzyme, et (3) le degr de purification (p.ex. 5 fois plus pur).

b) Indiquez quelle tape permet la plus grande purification de la protine.

c) Assumant que la protine est pure aprs le tamisage molculaire (Bio-Gel A), quelpourcentage de l'extrait initial tait constitu de 6-gluconate dshydrognase?


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tape depurification

Volume (mL)Protines

totales (mg)Activit

enzymatique (g/min)

1- Extrait cellulaire 2 800 70 000 2 700

2- Sulfate d'ammonium 3 000 25 400 2 300

3- Dnaturation chaleur 3 000 16 500 1 980

4- Chromato. DEAE 80.00 390.00 1 680

5- CM-cellulose 50.00 47.00 1 350

6- Bio-Gel A 7.00 35.00 1 120

3.9. Purification des protines.Pourquoi n'ajoute-t-on jamais de SDS des protines devant subir une focalisation isolectrique?

3.10. Purification des protines.Une srie de protines de masse molculaire connue et une enzyme inconnue ont t tudies parchromatographie sur gel de sphadex G-200. Le volume d'lution (V el) pour chaque protine estdonn dans le tableau ci-dessous. Estimez la masse molculaire de la protine inconnue.

Protine Mr Vel(mL)

dextran bleu 1 000 kDa 85.00lysozyme 14 kDa 200.00

chymotrypsinogne 25 kDa 190.00

ovalbumine 45 kDa 170.00srum albumine 65 kDa 150.00aldolase 150 kDa 125.00urase 500 kDa 90.00

ferritine 700 kDa 92.00ovomucoide 28 kDa 160.00

inconnu ? 130.00

*3.11. Purification des protines.Rfrant au problme prcdent, fournissez une explication plausible quant au comportement

bizarre de la ferritine lors de sa chromatographie sur gel de sphadex.

3.12. Purification des protines.Une tudiante isole une protine partir d'une bactrie anarobique et soumet son chantillon une lectrophorse en gel de polyacrylamide en prsence de SDS (PAGE-SDS). Aprscoloration, une seule bande est visualise, ce qui enthousiasme beaucoup le superviseur del'tudiante. Cependant, ce dernier suggre l'tudiante d'effectuer une seconde lectrophorse deson chantillon, mais cette fois sous des conditions natives (i.e. non-dnaturantes, i.e. sans SDS).


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Elle observe alors deux bandes aprs coloration du gel. Assumant que l'tudiante n'a pas fait degaffes au cours de ses expriences, expliquez ces observations.

3.13. Purification des protines.Un tudiant du cours CHMI 2227 F effectue l'analyse de la srum albumine bovine ( bovine

serum albumin-BSA) en lectrophorse sur gel de polyacrylamide (PAGE-SDS). Au cours deson exprience, il omet d'ajouter du -mercaptothanol son chantillon. En comparant sesrsultats ceux de ses collgues, il s'aperoit que la masse molculaire apparent de sonchantillon de BSA dtermin par PAGE-SDS est de 57 kDa, alors que la valeur obtenue partous les autres tudiants (qui eux n'ontpas oubli d'ajouter le -mercaptothanol) est de 68 kDa.Expliquez l'origine de cette diffrence.

3.14. Squenage de polypeptidesConsidrant le peptide suivant:

A-L-K-M-P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R

Indiquez quels fragments seront gnrs suite la digestion avec:

a) la trypsine b) la pepsine c) la protase V8 d) le bromure de cyanogne

3.15. Squenage de polypeptidesDduisez la squence du polypeptide pour lequel on a obtenu les rsultats suivants:

a) hydrolyse acide: (Ala2 , Arg, Lys2 , Met, Phe, Ser2);

b) digestion la carboxypeptidase A: Ala;

c) digestion la trypsine: (Ala, Arg)(Lys, Phe, Ser)(Lys)(Ala, Met, Ser)

d) traitement au bromure de cyanogne: (Ala, Arg, Lys2 , Met, Phe, Ser)(Ala, Ser)

e)digestion la thermolysine: (Ala)

(Ala, Arg, Ser)(Lys2 , Met, Phe, Ser)

3.16. Squenage de polypeptidesUn polypeptide est rduit avec le -mercaptothanol et donne deux fragments peptidiques de lasquence suivante:


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chane 1: A-C-F-P-K-R-W-C-R-R-V-C

chane 2: C-Y-C-F-C

Le polypeptide sous sa forme non-rduite est digr avec la thermolysine et donne les fragments

suivants:(A,C,C,V)(R,K,F,P)(R,R,C,C,W,Y)(C,C,F)

Indiquez la position des ponts disulfure dans le polypeptide.

3.17. Squenage de polypeptidesOn procde l'analyse du polypeptide Shawi isol de la bactrie Chrtientus ngativii, et on

obtient les rsultats suivants:a) hydrolyse acide: (Ala4 , Val, Lys2 , Arg, Gly, Asp, Met, Pro, Trp)

b) digestion la carboxypeptidase: Lys

c) traitement au dinitrofluorobenzne: Val

d) traitement au bromure de cyanogne: gnration de deux peptides:

peptide A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala)

Le traitement de ce peptide au DNBF et carboxypeptidase donne:

DNFB: Gly Carboxypeptidase: Lys

peptide B: (Ala3 , Lys, Val, Met, Pro)

Le traitement de ce peptide au DNFB et carboxypeptidase donne:

DNFB: Val Carboxypeptidase: Met

e) digestion la trypsine: gnre trois peptides:

peptide C: (Lys, Trp, Ala)


DNFB: Trp


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peptide D: (Ala3 , Val, Lys, Pro)

peptide E: (Met, Asp, Gly, Arg)


DNFB: Met

Finalement, le traitement du peptide D avec la thermolysine donne :ValAla

Ala(Ala, Lys, Pro)

Quelle est la structure primaire de ce peptide?

Chapitre 4. Structure tridimensionnelle des protines

4.1. Structure 3-D des protines

Quels acides amins parmi les suivants vous attendriez-vous retrouver a) l'intrieur, et b) lasurface d'une protine globulaire typique, en solution aqueuse et pH 7?Glu Arg ValPhe Ileu AsnLys Ser Thr

4.2. Structure 3-D des protinesD'aprs la structure de l'ure, dduisez comment ce compos provoque la dnaturation desprotines.

4.3. Structure 3-D des protinesQuoique la phnylalanine est un acide amin hydrophobe, on la rencontre frquemment la

surface de protines natives et fonctionnelles. Donnez le rle le plus probable de laphnylalanine dans cette situation.

*4.4. Structure 3-D des protinesQuoique l'aspartate est un acide amin charg, on le rencontre frquemment l'intrieur deprotines natives et fonctionnelles. Expliquez comment cela peut tre possible.



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Le tableau suivant dcrit la composition en acides amins de trois protines.

nombre de rsidus par molculeacide amin protine 1 protine 2 protine 3

Rsidus polairesArg 12.00 4.00 7.00Asn 9.00 6.00 5.00Asp 14.00 5.00 9.00Cys 7.00 2.00 6.00Gln 8.00 7.00 6.00Glu 11.00 4.00 6.00His 4.00 2.00 4.00Lys 22.00 6.00 15.00Ser 20.00 5.00 11.00Thr 15.00 3.00 11.00Trp 2.00 3.00 3.00Tyr 7.00 7.00 6.00

Rsidus apolairesAla 14.00 28.00 25.00Gly 9.00 9.00 8.00Ileu 5.00 16.00 9.00Leu 3.00 19.00 7.00Met 7.00 11.00 9.00Phe 9.00 13.00 11.00Pro 8.00 13.00 10.00Val 16.00 29.00 21.00

Sachant que la protine A possde une forme de btonnet, la protine B est une protineglobulaire monomrique, et que la protine C est une protine globulaire forme de quatre sous-

units identiques, dduisez quelle composition en acides amins correspondent ces protines.4.6. Structure 3-D des protinesIndiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hlice , feuillet , pelote statistique) adoptera lepeptide suivant en solution aqueuse pH 7:

Ileu-Glu-Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp-Tyr

4.7. Structure 3-D des protinesIndiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hlice , feuillet , pelote statistique) adoptera le

peptide suivant en solution aqueuse pH 7:

Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala

4.8. Structure 3-D des protinesIndiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hlice , feuillet , pelote statistique) adoptera le


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peptide suivant en solution aqueuse pH 7:

Lys-Gly-Arg-Arg-Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Pro


Indiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hlice , feuillet , pelote statistique) adoptera lepeptide suivant en solution aqueuse pH 7:

1 10 20Gly-Pro-Glu-Ser-Ala-Tyr-Lys-Thr-Leu-Phe-Asp-Val-Pro-Asp-Asp-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-

26Gly-Ser-Ser-Gly-Ala


Le tableau suivant dcrit la composition en acides amins de trois protines. Dterminez si cesprotines adopteront une structure en hlice , en feuillet ou en triple hlice de collagne.

Protine A B C Protine A B CAla 29.40 5.00 10.70 Leu 0.50 6.90 2.40Arg 0.50 7.20 5.00 Lys 0.30 2.30 3.40Asp 1.30 6.00 4.50 Met - 0.50 0.80Cys - 11.20 - Phe 0.50 2.50 1.20Glu 1.00 12.10 7.10 Pro 0.30 7.50 12.20Gly 44.60 8.10 33.00 Ser 12.20 10.20 4.30His 0.20 0.70 0.40 Trp 0.20 1.20 -

Hypro - - 9.40 Tyr 5.20 4.20 0.40

Ileu 0.70 2.80 0.90 Val 2.20 5.10 2.30

Chapitre 5. Enzymologie

5.1. Cintique enzymatiqueSoient les rsultats suivants obtenus lors de l'analyse de l'activit d'une enzyme. Dterminez:a) le Vmaxb) pourquoi la vitesse v est-elle constante [S] suprieure 2 x 10 -3 M?c) quelle est la [E] libre une [S] de 2 x 10-2 M?

[S] (mol/L) v (mol/min)2 x 10-1 60,00

2 x 10-2 60,00

2 x 10-3 60,00

2 x 10-4 48,00

1,5 x 10-4 45,00

1,3 x 10-5 12,00


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5.2. Cintique enzymatiqueVous trouverez ci-dessous les rsultats de l'analyse de l'activit d'une enzyme. Sans faire degraphique, dterminez:

a) le Vmax;b) le Km;c) la vitesse initiale [S] de 1 x 10 -1 M;d) la quantit de produit form au cours des 5 premires minutes une [S] de 2 x 10 -3 M. une[S] de 2 x 10-6 M?e) quel est le Km et le Vmax si on augmente la [E] d'un facteur 4?

5.3. Cintique enzymatiqueLe tableau suivant dcrit les rsultats d'une exprience d'enzymologie. Trouvez grce au graphede Lineweaver-Burke:a) le Km;b) le Vmax;

5.4. Cintique enzymatique

On tudie l'influence du pH sur l'activit enzymatique de la 6-phosphogluconate dshydrognase.Cette enzyme catalyse la raction:

6-phosphogluconate + NADP acide 6- phosphogluconique + NADPH2

[S] (mol/L) v (mol/min)5 x 10-2 0.25

5 x 10-3 0.25

5x 10-4 0.25

5x 10-5 0.205 x 10-6 0.07

5 x 10-7 0.01

[S] (mol/L) v (mol/min)1 x 10-3 65.005 x 10-4 63.00

1x 10-4 51.00

5x 10-5 42.00

3 x 10-5 33.00

2 x 10-5 27.00

1 x 10-5 17.00

5 x 10-6 9.50

1 x 10-6 2.20

5 x 10-7 1.10


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Le NADPH2 absorbe 340 nm. L'activit de la dshydrognase a t mesurespectrophotomtriquement en mesurant la densit optique 340 nm, qui est proportionnelle laconcentration de NADPH2.

[S] x 104 M Accroissement delabsorbance

pH 7.6

Accroissement delabsorbance

pH 9.0

0.174 0.074 0.034

0.267 0.085 0.047

0.526 0.098 0.075

1.666 0.114 0.128

4.000 - 0.167

quel pH l'enzyme a-t-il le plus d'affinit pour le substrat?

5.5. Cintique enzymatiqueLes rsultats suivants dcrivent l'effet d'un inhibiteur sur l'activit enzymatique d'une enzyme.Dterminez:

a) le Vmax en prsence et en absence de l'inhibiteurb) le Km en prsence et en absence de l'inhibiteurc) le Ki

d) de quel type d'inhibition s'agit-il?

[S] (mol/L) Sans inhibiteurv (mol/min)

Avec inhibiteur[I] = 2,2 x 10-4 M

v (mol/min)1 x 10-4 28.00 17.00

1,5 x 10-4 36.00 23.00

2x 10-4 43.00 29.00

5x 10-4 65.00 50.00

7,5 x 10-4 74.00 61.00

5.6. Cintique enzymatiqueUne biochimiste tudie les proprits d'une enzyme mtabolique qu'elle vient tout juste d'isoler.Elle obtient les rsultats d'analyse cintique suivants en absence et en prsence de deuxinhibiteurs diffrents (A et B). L'identit des inhibiteurs est inconnue, mais on sait que l'un d'euxest un analogue du substrat et l'autre est un agent alkylant.


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Dterminez:

a) le Km et le Vmax de cette enzyme;b) quel inhibiteur est l'analogue du substrat. Lequel est l'agent alkylant?

c) quelles sont les constantes d'inhibition (Ki) respectives des inhibiteurs A et B?d) quel sera le Vo de cette raction enzymatique une concentration de substrat de 3 x 10 -4 M eten prsence de 2 x 10-5 M de l'inhibiteur A?

[S] (mol/L) Sans inhibiteurv (mol/min)

Avec inhibiteur A[I] = 5 x 10-4 M

v (mol/min)

Avec inhibiteur B[I] = 3,2 x 10-6 M

v (mol/min)

5 x 10-4 1.25 0.82 0.48

2,5 x 10-4 0.87 0.49 0.33

1,7 x 10-4 0.67 0.36 0.25

1,2 x 10-4 0.54 0.26 0.20

1 x 10-4 0.45 0.23 0.17

5.7. Catalyse enzymatique

L'effet du pH sur l'activit d'une enzyme est dmontr dans le graphique ci-dessous:

Comment expliquez-vous l'effet du pH sur l'activit de l'enzyme?

5.8. Catalyse enzymatiquePlusieurs enzymes montrent une dpendance vis--vis le pH qui est similaire celle schmatisedans le graphique du problme prcdent. Cependant, le pH optimal varie beaucoup d'uneenzyme l'autre. Quelles chanes latrales retrouverait-on au site actif d'enzymes dont le pHoptimal est de:

a) pH 4

pHActivitenzymatiq

ue(%)


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b) pH 11

5.9. AllostrieOn tudie la cintique de deux enzymes (A et B). partir des donnes suivantes, distinguez le

type d'enzyme (c'est--dire si il s'agit d'un enzyme ordinaire ou allostrique) et expliquez l'alluredes courbes reprsentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat.

[S] (x 103 M) v (enzyme A)(mol/min)

v (enzyme B)(mol/min)

0.00 0.00 0.000.50 8.80 0.301.00 14.00 1.002.00 19.00 4.703.00 21.50 12.404.00 22.80 19.005.00 22.30 21.806.00 23.50 22.80

8.00 23.60 23.30

Chapitre 6. Structure et proprits des acides nucliques.

6.1. Structure des acides nucliques.Soit le polynuclotide suivant:

AUUACGUGGUGCACUCGGGAACAUCCCGAGUGCACCACGUAAUGGA

Dessinez les deux structures secondaires intramolculaires les plus stables que ce polymrepeut adopter.

*6.2. Structure des acides nucliques.Une solution d'ADN double-brin est chauffe puis refroidie la temprature de la pice pendantdeux minutes. Prdisez qualitativement la variation dans l'absorbance 260 nm dans lesconditions suivantes:

a) la solution est chauffe jusqu' ce que la temprature soit juste sous le Tm avant d'trerefroidie;

b) la solution est chauffe jusqu' ce que la temprature dpasse largement le Tm, puis estrefroidie;

c) suggrez la structure de deux polynuclotides (synthtiques ou naturels) qui rsulteront dansun profil d'absorbance suite au refroidissement qui sera l'inverse parfaitdu patron obtenu suiteau chauffage de la molcule au-dessus du Tm.

6.3. Structure des acides nucliques.


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17

Expliquez pourquoi l'ARN, mais non l'ADN, est hydrolys sous des conditions de pH basique.

6.4. Structure des acides nucliques.Les rsultats suivants sont obtenus lors d'une exprience de dnaturation/renaturation d'un acidenuclique simple (polyA:polyU). Comment interprtez-vous ces donnes?

6.5. Structure des acides nucliques.L'IMP (inosine monophosphate) est prsent chez E. coli en tant qu'intermdiaire de labiosynthse des nuclotides puriques, et il est possible d'incorporer de l'IMP l'ADN si le dITP(inosine triphosphate) est prsent dans le milieu ractionnel. Pourtant, le dIMP n'est jamaisprsent dans l'ADN dans la nature. Proposez une explication.

6.6. Structure des acides nucliquesQuels sont les produits de la digestion de l'oligoribonuclotide:

5'pACGAUGCUAUC 3'

par chacun des enzymes suivants:

a) ribonuclase pancratique;b) ribonuclase T2;c) ribonuclase T1;

6.7. Structure des acides nucliquesOn veut procder l'analyse d'un ARN. Sa composition globale en bases est 2A, 2C, 1U, 1G.

Le traitement par la phosphodiestrase de venin de serpent libre pC.

Temprature (oC)

Absorb

ance(260nm)

Solution refroidie rapidement

Solution refroidie lentement

Tm


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L'hydrolyse par la ribonuclase pancratique libre 1C, un dinuclotide qui comprend A et C, etun trinuclotide qui contient A, G et U.

L'action de la ARNase T2 donne pAp, un dinuclotide qui contient U et C, et un trinuclotideayant A, G et C.

Quelle est la structure primaire de cet ARN?

6.8. Structure des acides nucliquesOn procde l'analyse d'un ARN dont la composition brute en bases est 2A, 4C, 2G, 1U.

La ribonuclase pancratique libre 2Cp, deux dinuclotides dont un contient G et C et l'autre Aet U, et un trinuclotide fait de A, C et G.

Un mlange de ARNase T1 et T2 produit C, Ap, pGp, et deux trinuclotides, le premier

contenant A et C et le deuxime CG et U.La phosphodiestrase du venin de serpent libre pC.

Quelle est la formule de cet ARN?

6.9. Structure des acides nucliquesQuelle est la charge globale porte par le trinuclotide ApGpUpC pH neutre?

6.10. Structure des acides nucliquesPourquoi d'un duplex circulaire d'ADN se renature-t-il plus rapidement qu'un duplex linaire?

6.11. Structure des acides nucliquesPourquoi l'ADN se dnature-t-il dans l'eau pure, c'est--dire force ionique voisine de zro?

6.12. Structure des acides nucliquesLa taille du chromosome de E. coli est de 4000 kpb. Quelle longueur d'ADN contient-il?

6.13. Synthse des acides nucliques.Au cours d'une exprience du type de celle effectue par Meselson et Stahl, vous laissez lesbactries pousser pour 3 gnrations (au lieu de 2 dans l'exprience classique) dans un milieu necontenant que du 14N. Suite l'isolation de l'ADN et son analyse par centrifugation analytique,quelle proportion de molcule d'ADN lourdes, hybrides ou lgres obtiendrez-vous?

6.14. Synthse des acides nucliques.Un brin isol (+) d'ADN (composition en bases: 10% de A, 20% de G, 30% de C et 40% de T)est rpliqu par la ADN polymrase de E. coli en un brin complmentaire (-). L'ADN bicatnairesert ensuite de modle la ARN polymrase de E. coli qui transcrit le brin (-).


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Indiquez la composition en bases (en % de A, C, G et T/U) du brin form.

*6.15. Synthse des acides nucliques.Le temps requis pour synthtiser compltement le gnome dE. coli est de 40 minutes. Pourtant,le temps de gnration de cette bactrie est de seulement 20 minutes. Trouvez une explication

ce paradoxe.

**6.16. Synthse des acides nucliques.Vous avez l'insigne honneur d'tre le premier scientifique analyser un micro-organismeprovenant de la plante Mars. Cette bactrie contenant de l'ADN double-brin comme matrielgntique, vous dcidez d'effectuer une analyse de type Meselson-Stahl. et vous obtenez lesrsultats dcrits la page suivante.

a) comment interprtez-vous ces rsultats?

b) afin de mieux comprendre ce phnomne, vous isolez tous les composants impliqus dans larplication de l'ADN chez cet organisme. Vous identifiez:

- une activit d'ARN polymrase;- une ADN polymrase qui fonctionne seulement sur de l'ADN monocatnaire (simple brin);- une nouvelle enzyme qui peut gnrer un produit sensible la ADNase en prsence de NADHet d'un produit insensible la ADNase et rsistant la chaleur.

D'aprs ces informations, dduisez le mcanisme selon lequel ce micro-organisme rplique sonADN.

6.17. ARNm et transcription la diffrence de lADN polymrase, lARN polymrase neffectue pas de relecture aveccorrection ventuelle de son produit.

a) Pourquoi cette absence dautocorrection de la synthse dARN ne menace-t-elle pas laviabilit cellulaire?

Gnrations aprstransfert dans 14N

0

1

2

LL HL HH


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b) En quoi le fait, pour un organisme, de possder une enzyme utilisant lARN comme matricepour synthtiser lADN modifierait-il le taux de mutation de cet organisme?

*6.18. ARNm et transcriptionLa trs grande majorit des ARNm ont une demi-vie trs courte de lordre de 3 minutes chez

les bactries. Quelle raison a pouss lvolution faonner les ARNm en molcules aussiinstables?

6.19. ARNm et transcriptionSi lARN polymrase allonge lARN la vitesse de 35 70 nuclotides par seconde et si chaquemolcule de polymrase saccole 70 paires de bases dADN :

a) Quelle est la vitesse maximale de transcription par minute laquelle un gne de 6000 pairesde bases est transcrit en molcules dARN?

b) Quel est le nombre maximal de molcules de polymrases qui pourraient se retrouver

attaches ce gne un moment donn?6.20. Codage des protines.Soit l'ARNm suivant:

AGU CUC UGU CUC CAU UUG AAG AAG GGG AAG GGG

a) indiquez la squence d'acides amins qui sont cods (lecture de 5' vers 3'). Le tableaucontenant le code gntique est inclus en annexe.

b) on obtient des mutations qui consistent en l'addition ou la dltion d'un seul nuclotide. Si oninsre G entre le troisime et le quatrime nuclotide de la squence prcdente, et que l'onlimine le dixime nuclotide partir de la droite (cest un G), quelle sera la squence peptidiqueobtenue?

6.21. Codage des protines.La squence d'acides amins d'une partie du lysozyme provenant d'un bactriophage T4 de typesauvage et d'un mutant sont:

type sauvage: -Tyr-Lys-Ser-Pro-Ser-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys-

mutant: -Tyr-Lys-Val-His-His-Leu-Met-Ala-Ala-Lys-

a) ce mutant peut-il tre le rsultat du changement d'une seule paire de bases dans l'ADN duphage T4? Si non comment ce mutant peut-il avoir t produit?

b) quelle est la squence en bases de l'ARNm qui code pour les cinq acides amins du typesauvage qui sont diffrents dans le mutant?

6.22. Codage des protines.


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22

ADN standard Apa I Pvu I BamH ILongueur (pb) Distance migre

(cm)Distance migre

(cm)Distance migre

(cm)Distance migre

(cm)23 130 3.5 2.76 2.76 2.769 416 4.1 4.12 3.02 2.89

6 557 4.5 3.29 3.064 361 4.9 3.98 3.242 320 5.25 3.432 027 6.15 4.65560 6.7


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Annexes


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Annexe 1

pKas et pI des acides amins

pKa1 pKa2 pKr pI

G 2,34 9,60 5,97A 2,34 9,69 6,01V 2,32 9,62 5,97L 2,36 9,60 5,98I 2,36 9,68 6,02

P 1,99 10,6 6,48

F 1,83 9,13 5,48Y 2,20 9,11 10,07 5,66W 2,83 9,39 5,89

S 2,21 9,15 13,60 5,68T 2,63 10.43 13,60 5,87C 1,71 10.78 8.33 5,07M 2,28 9,21 5,74N 2,02 8,80 5,41

Q 2,17 9,13 5,65

D 2.09 9,82 3,86 2,77E 2,19 9,67 4,25 3,22

K 2,18 8,95 10,79 9,74R 2,17 9,04 12,48 10,76H 1,82 9,17 6,00 7,59


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Annexe 2

Le code gntique

Base en 5' Base centrale Base en 3' U C A G U

Phe Ser Tyr Cys UPhe Ser Tyr Cys CLeu Ser Stop Stop ALeu Ser Stop Trp G

CLeu Pro His Arg ULeu Pro His Arg CLeu Pro Gln Arg ALeu Pro Gln Arg G

A Ile Thr Asn Ser UIle Thr Asn Ser CIle Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

GVal Ala Asp Gly UVal Ala Asp Gly CVal Ala Glu Gly AVal Ala Glu Gly G


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Solutions


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Chapitre 1: Equilibre acide-base et spectrophotomtrie

1.1quilibre acide-base :a) Comme le HCl est un acide fort, il se dissociera compltement lorsque mis en solution :

HCl H+ + Cl-

Ainsi, comme la concentration de HCl de dpart est de 0.35M, la stoechiomtrie nousindique que la concentration finale de H+ dans la solution sera aussi de 0.35M. Nous auronsdonc :

pH = - log[H+] = -log 0.35 = 0.46

b) Lacide actique en solution se dissociera lui aussi :

CH3-COOH CH3-COO- + H+

Par contre, comme il sagit dun acide faible, il ne se dissociera pas compltement. Nousdevrons donc tenir compte de la constante dassociation (Ka) dans nos calculs. Cetteconstante est dfinie de la manire suivante :

pKa = - log Ka

Donc Ka = 1/10pKa = 1.74 x 10-5M

On peut alors facilement calculer la concentration en H+ :

Ka = [H+

] [CH3COO-

][CH3COOH]

1.74 x 10-5M = [H+] [CH3COO-]0.35 M

1.74 x 10-5M x 0.35M = [H+] [CH3COO-] = [H+]2

[H+] = (6.09 x 10-6 M2)1/2 = 2.47 x 10-3M

Enfin: pH = - log [H+] = - log 2,47 x 10-3 = 2.61

c) Suivant la mme procdure quen (b), nous obtenons un pH de 3.11.


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28

1.2quilibre acide-base :a) On a un acide faible. Lquilibre acide-base sera donc le suivant :

HA H+ + A-

On peut dterminer le Ka de la manire suivante :Ka = [H+] [A-]

[HA]

Lnonc du problme indique que cet acide nest ionis qu 2% (ou 0.20, cest pareil).Ceci nous permet de dterminer les concentrations respectives de HA, H+ et A- :

[H+] = [A-] = 0.20M x 0.02 = 0.004M

[HA] = 0.2M [H+] = 0.196 M

Ainsi :Ka = [H+] [A-]

[HA]

Ka = 0.004M x 0.004M0.196 M

Ka = 8.16 x 10-5 M

b) Le pH de cette solution sera donc de : pH = - log [H+] = - log 0.004M = 2.39

1.3quilibre acide-base :a) Ce mlange constitue une solution tampon fabrique avec lacide actique et sa base

conjugue, lactate de sodium :

CH3COOH H+ + CH3COO

- Na+

Le pH de ce type de solution peut facilement tre dtermin grce lquation dHenderson-Hasselbach :

pH = pKa + log [Base conjugue][Acide]


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29

pH = 4.76 + log 0.5M = 4.461 M

b) On a lquilibre suivant :

H3PO4 H+ + H2PO4

- K+

Utilisant la mme procdure quen (a), on obtient :

pH = pKa + log [H2PO4-]

[H3PO4]

pH = 2.14 + log 0.8 M0.3 M

pH = 2.57

1.4quilibre acide-base :Nous avons ici lquilibre suivant :

H2PO4- H+ + HPO4

-2

Et le pKa donn est de 7.21.

Lquation dHenderson-Hasselbach nous donne:

pH = pKa + log [HPO4-2][H2PO4

-]

7,00 = 7.21 + log [x]0.1 M

-0.21 = log x log 0.1 M

-0.21 + log 0.1 M = log x = -1,21

x = 10logx = 0.062 M

1.5quilibre acide-base :On a toujours lquilibre acide base suivant :

H2PO4- H+ + HPO4

-2


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30

Daprs lnonc du problme, on a : [H2PO4-] + [HPO4

-2] = 0.3M

Ainsi : [H2PO4-] = 0.3 M - [HPO4

-2]

partir de lquation dHenderson-Hasselbach, on aura donc :

pH = pKa + log [HPO4-2]

[H2PO4-]

7,00 = 7.21 + log [HPO4-2]

[H2PO4-]

7,00 = 7.21 + log [HPO4-2]

[H2PO4-]

-0.21 = log [HPO4-2]

[H2PO4-

]10-0.21 = [HPO4

-2][H2PO4

-]

0.616 = [HPO4-2]

[H2PO4-]

0.616 x [H2PO4-] = [HPO4

-2]

Ceci est identique :0.616 x (0.3M - [HPO

4

-2]) = [HPO4

-2]

0.185 0.616 x [HPO4-2] = [HPO4

-2]

0.185 = 1.616 x [HPO4-2]

0.114 M = [HPO4-2]

Et la concentration de [H2PO4-] sera :

[H2PO4-] = 0.3M - [HPO4

-2] = 0.186 M

1.6 SpectrophotomtrieLa relation entre labsorbance dune solution et sa concentration est donne par lquation deBeer-Lambert :

A = cl


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31

O : A = absorbance = coefficient dextinction molaire (units : litres x mol-1 x cm-1)c = concentration (units : mol/l = M)l = trajet optique (paisseur de la cuvette; units : cm)

On aura alors :0.71 = 1.420 l mol-1 cm-1 x c x 1 cm

c = 0.71 mol cm1420 l x 1 cm

c = 5 x 10-4 M

Si on utilise une cuvette de 0.1 cm, on aura:

0.71 = 1.420 l mol-1 cm-1 x c x 0.1 cm

c = 0.71 mol cm1420 l x 0.1 cm

c = 0.005 M

1.7 SpectrophotomtrieGrce lquation de Beer-Lambert, on a :

A = cl

Ainsi :

A = 1420 l mol

-1

cm

-1

x (37 x 10

-3

M) x 1cmA = 52.54

1.8 SpectrophotomtrieNous devons tout dabords tracer la courbe standard de labsorbance en fonction de laconcentration en hmoglobine. Ce graphique est reprsent la page suivante.

Comme linconnu a une absorbance de 0.303, nous pouvons reporter cette valeur sur la courbestandard afin de trouver la concentration en hmoglobine correspondante, qui est de 6.31g/mL.

Cette valeur peut aussi tre obtenue avec beaucoup plus de prcision en utilisant lquation dunedroite :

y = mx + b

o y = valeur sur laxes des yx = valeur sur laxe des x


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32

m = pente de la droiteb = intersection sur laxe des y

Les valeurs de m et b sont obtenues soit directement sur le graphique, soit en les calculant parrgression linaire (de loin la meilleure mthode).

Donc, on aura :

y = 0.0441x + 0.0246

x = (y-b)/m

x = (0.303-0.0246)/0.0441mLg-1 = 6.31 g/mL.

6.31 g

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Concentration hmoglobine (g/mL)

Absorbance

A = 0.303


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Chapitre 2: Acides amins

* 2.1. Poids molculaire d'un acide amin.Suite l'ajout du NaOH, on assiste un dplacement de l'quilibre acide-base de l'acide aminvers la forme basique:

NH3+-CH(R)-COO- NH2-CH(R)-COO-

l'aide de l'quation d'Henderson-Hasselbach, il est possible d'obtenir la proportion d'acideamin sous forme de base et d'acide suite l'ajout du NaOH:

pH = pKa + Log [base] / [acide]

10,4 = 9,7 + Log [base] / [acide]

0,7 = Log [base] / [acide]

5,011 = [base] / [acide]

Comme 0,01 mol de NaOH (100 ml de 0,1M) a t utilise afin d'atteindre pH 10,4, ceci nousindique que 0,01 mol de l'acide amin a t convertie en base. Nous aurons donc:

5,011 = [base] / [acide]

5,011 = 0,01 mol /[acide]

[acide] = 0,002 mol

La somme de la quantit d'acide amin sous forme basique et acide nous donne la quantit totaled'acide amin, soit 0,012 mol. Il ne reste plus qu' utiliser ces donnes afin d'obtenir le poidsmolculaire:

1,812 g = 0,012 mol

Donc, poids molculaire: g / mol = 1,812 g /0,012 mol = 151 g / mol

2.2. Courbe de titrage.Le titrage de l'histidine implique les quilibres acide/base suivants:

H+N

HN

CH2 CH COOH

NH3+

H+N

HN

CH2 CH COO

NH3+

N

HN

CH2 CH COO

NH3+

N

HN

CH2 CH COO

NH2pKa1 pKaR pKa2


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34

Afin de dessiner la courbe de titrage, nous avons besoin des valeurs des pKas et des pointsd'inflexions. Pour l'histidine, les pKas sont les suivants:

pKa1: 1,82pKaR: 6,00

pKa2: 9,17Par dfinition toujours, le pKa est le point o la moiti de l'acide amin dans la solution a perduun proton, alors que l'autre moiti possde encore ce proton.

Les points d'inflexion sont dtermins par la moyenne arithmtique de deux pKa conscutifs:

point d'inflexion no. 1: (1,82 + 6,00) / 2 = 3,91

point d'inflexion no. 2: ( 6,00 + 9,17) / 2 = 7,59

Le pI est dfini comme tant le pH o la charge nette de l'acide amin est neutre, et il estdtermin par la moyenne arithmtique des pKas prcdant et suivant l'espce neutre de l'acideamin. Pour l'histidine, le pI sera donc de 7,59 (soit le point d'inflexion no. 2).

On peut ainsi dessiner la courbe de titrage de l'histidine (voir page suivante).

2.3. Charge nette des acides amins.Pour dterminer la charge nette d'acides amins diffrents pH, on doit d'abord dterminer le pIde ces diffrents acides amins. Avec cette information, la charge de l'acide amin peut tredduite diffrents pH: en effet, par dfinition, la charge de l'acide amin un pH gal son pIest nulle. un pH infrieur son pI, l'acide amin est charg positivement, alors qu'il est chargngativement un pH suprieur son pI.

Ainsi, pour ce qui est de ce problme, nous obtenons les rsultats suivants:

pH glycine(pI: 5.97)

srine(pI: 5.68)

acideaspartique(pI: 2.77)

glutamine(pI: 5.68)

arginine(pI: 10.76)

2.01 + + + + +3.96 + + - + +5.68 + 0 - 0 +

10.76 - - - - 0


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35

Graphe du problme 2.2.

1.0 2.0 3.00.5 1.5 2.5

9.0

7.5

6.0

3.91

1.82

H

quivalents dions OH-

pKa1=1.82

pKaR=6.0

pKa2=9.17

pI = 7.59

H+N

HN

CH2 CH COOH

NH3+

H+N

HN

CH2 CH COO

NH3+

N

HN CH2 CH COONH3

+

N

HN

CH2 CH COO

NH2

pKa1

50%

50% pKaR

50%

50%N

HN

CH2 CH COO

NH3+

pKa2

50%

50%

H+N

HN

CH2 CH COO

NH3+

100%

100%

H+N

HN

CH2 CH COO

NH3+

N

HN

CH2 CH COO

NH3+


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2.4. Chromatographie changeuse d'ions.On dbute la chromatographie pH 10. ce pH, tous les acides amins dans le mlange serontchargs ngativement(pH est suprieur au pI).

a) sur une rsine changeuse de cations, aucun des acides amins ne s'accrochera la rsine et ils

seront donc tous retrouvs dans l'luant.b) sur une rsine changeuse d'anions, tous les acides amins s'accrocheront la rsine. Au fur et mesure que l'on diminue le pH, les acides amins lueront ds que le pH du tampon deviendrainfrieur leur pI. Ainsi, dans l'ordre, on recueillera:

1- lysine

2- isoleucine, alanine, glycine (tous trois peu prs en mme temps cause de leur pIrapprochs)

3- acide glutamique.videmment, c'est la rsine changeuse d'anions qui donnera la meilleure sparation.

2.5. Acides aminsSeulement deux acides amins peuvent gnrer d'autres acides amins en librant de l'ammoniac:l'asparagine et la glutamine:

*2.6. Acides aminsCette observation ne peut tre explique que si l'on assume que la srine est d'abord insre dansla casine lors de la traduction, et que le groupe phosphate lui est attach une fois la synthseprotique termine. Les rsultats exprimentaux confirment cette hypothse.

C-CH2-CH-COOH

H2N

O

H2N

C-CH2-CH-COOH

HO

O

H2N

H2O NH3

ASN ASP

C-CH2-CH2-CH-COOHH2N

O

H2N

C-CH2-CH2-CH-COOHHO

O

H2N

H2O NH3

GLN GLU


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37

*2.7. Chromatographie changeuse d'ions.Comme ces quatre acides amins peuvent tre spars sur une rsine changeuse d'ions, mais queleurs pKa est presque qu'identique, une diffrence structurale quelconque doit logiquement treresponsable de la diffrence de comportement de ces acides amins lors de la chromatographie.L'examen de la structure de la glycine, l'alanine, la valine et la leucine rvle une augmentation

croissante du caractre hydrophobe de la chane latrale. On peut donc conclure que ces acidesamins forment des interactions hydrophobes d'intensit diffrente avec la rsine changeused'ions, ce qui permet leur sparation.

2.8. Peptides.Comme les rendements en leucine, arginine et tryptophane sont similaires, on peu conclure qu'ilsdevraient tre en proportion gale. De plus, comparativement la leucine, l'arginine et letryptophane, on a recueilli approximativement deux fois plus de glutamate et quatre fois plusd'alanine et de lysine. La formule empirique de ce petit peptide devrait donc tre:

(Arg, Leu, Trp, Glu2, Ala4, Lys4)n

Cette exprience ne nous permet pas cependant de connatre la squence de ce peptide.

2.9. Peptides.La structure du peptide GWYQR (Glycyl-Tryptophanyl-Tyrosyl-Glutaminyl-Arginine) est:

Afin de dterminer quelle sera la forme ionise de ce peptide aux diffrents pH, il suffit deprendre note du pKa des diffrents groupes chargs (y compris les chanes latrales), et dedduire l'tat d'ionisation de chacun de ces groupes ( pHpKa: formenon-protone):

pH 2: Tous les groupes sont protons:

NH2

H2N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH

O O O O

NH

CH2 CH2

OH

CH2

CH2

OC

(CH2)3

NH

C

NH2

NH

+

NH2

H3N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH

O O O O

NH

CH2 CH2

OH

CH2

CH2

OC

(CH2)3

NH

C

NH2

NH2+


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38

pH 7: Le groupe carboxyl de l'arginine est ionis (pH>pKa). Par contre, la chane latrales delarginine et le groupe amino de la glycine sont toujours protons (pHpKa). Par contre, le groupe amino de la chane latrale de l'arginine demeure proton

(pH


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ngativement.3.3. Purification des protines. un pI suprieur 6, la 6-phosphogluconate dshydrognase possde une charge globalengative (pH>pI): elle peut donc lier la colonne. un pH suprieur 9, le groupe dithylaminode la colonne perd son proton, empchant du mme coup toute sparation de l'enzyme selon sa

charge.3.4. Purification des protines.Non, car la CM-cellulose (CM = carboxymthyl = -CH2-COOH) est une rsine changeuse decations: un pH suprieur 6, la 6-phosphogluconate dshydrognase est charge ngativement(voir problme 3.3) et ne peut donc pas lier la colonne.

3.5. Purification des protines.Afin de sparer la 6-phosphogluconate dshydrognase sur une colonne de CM-cellulose, on doits'assurer que la protine possde une charge globale positive. Le pH du tampon devra donc treinfrieur au pI de la protine, soit infrieur 6.

3.6. Purification des protines.Afin d'luer des protines lies sur une rsine changeuse d'ions, deux possibilits s'offrent aubiochimiste: utiliser soit un gradient de pH, soit de sel (gnralement du NaCl).

Dans la cas o l'on a choisi d'utiliser un gradient de NaCl, on dbute gnralement avec untampon de faible force ionique, pour par la suite utiliser une srie de tampons dont laconcentration en NaCl augmente graduellement. Les ions Na+ ou Cl- dcrocheront les protinesde la colonne en neutralisant les charges ngatives ou positives qui permettent aux protinesd'interagir avec la rsine. Le rsultat est l'lution des protines selon leur densit de charge: eneffet, afin d'tre dcroches d'une colonne changeuse de cations, les protines possdant moinsde charges positive ncessiteront moins d'ions Cl- (donc une concentration de NaCl moinsleve) pour neutraliser leurs charges que des protines possdantplus de charges positives. Lamme logique s'applique aux ions Na+ lors de l'lution de protines fixes une rsinechangeuse d'anions (e.g. CM-cellulose).Dans le cas qui nous concerne, on peut donc conclure que :

- la myoglobine luera la premire car elle ne se fixera pas la colonne (pH


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protine dont le pI est diffrent de notre enzyme. En seconde tape, on peut effectuer untamisage molculaire afin de sparer notre enzyme (Mr 24 kDa) de l'autre protine contaminante(Mr 100 kDa).

Note: Des rsultats similaires seraient obtenus si l'on effectue d'abord le tamisage, suivi de la

chromatographie sur rsine changeuse d'ions.3.8. Purification des protines.a) L'activit spcifique tant dfinie comme tant le nombre d'unit enzymatique par mg deprotine, nous n'avons qu' diviser le nombre d'units enzymatiques dterminesexprimentalement par la quantit de protine dans l'extrait. Ainsi, pour l'tape du traitement lachaleur, on aura:

activit spcifique = activit enzymatique / mg protine

activit spcifique = 1 980 U/16 500 mg = 0,12 U/mg

Lepourcentage de rendement est dfini comme la quantit d'enzyme (ou de protine) recueilliaprs x tapes par rapport la quantit prsente initialement dans l'extrait brut. Il est obtenu endivisant l'activit enzymatique l'tape x par l'activit enzymatique initiale. Toujours pourl'tape de dnaturation la chaleur, on aura:

Pourcentage de rendement = act. enzym. tape x / act. enzym. initiale

Pourcentage de rendement = (1 980 U/2 700U) x 100 = 73,3 %

Quant audegr de purification, il est obtenu en divisant l'activit spcifique aprs l'tape x parl'activit spcifique initiale. On obtient alors le nombre de fois que notre enzyme fut concentre(donc purifie) aprs les traitements effectus. Pour l'tape de dnaturation la chaleur, on aura:

Degr de purification = act. spcif. tape x / act. spcif. initiale

Degr de purification = 0,12/0,039 = 3,07 fois.

Les rsultats pour chacune des tapes de purification sont indiqus dans le tableau ci-dessous:

tape depurification

Activitspcifique

(U/mg)

Pourcentagede rendement

Degr depurification

(n fois)Extrait cellulaire 0,039 100% ---

Sulfated'ammonium

0,09 85,2% 2,30


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tape depurification

Activitspcifique

(U/mg)

Pourcentagede rendement

Degr depurification

(n fois)Dnaturation

chaleur0,12 73,3% 3,07

Chromato. DEAE 4,31 62,2% 110,50CM-cellulose 28,72 50% 736,40Bio-Gel A 32,00 41,5% 820,50

b) Afin de dterminer quelle tape fut la plus efficace dans la purification de notre enzyme, ils'agit de diviser le degr de purification aprs une tape x par le degr de purification de l'tapeprcdente. Ainsi, l'tape de chromatographie sur DEAE a permis la plus grande purification del'enzyme, soit 36 fois.

c) Considrant que la protine est pure aprs tamisage molculaire, on aura donc recueilli 35 mg

de 6-gluconate dshydrognase. Ceci correspond 41,5 % de la quantit d'enzyme prsenteinitialement dans l'extrait (c.f. pourcentage de rendement). Ainsi, dans notre extrait initial, onavait:

35 mg / 41,5% = 75,9 mg

Et cette quantit d'enzyme tait initialement prsente dans 70 000 mg de protine. On avait doncdans l'extrait brut:

(75,9 mg / 70 000 mg) x 100 = 0,108 % de 6-gluconate dshydrognase

3.9. Purification des protines.Le but de la focalisation lectrique consiste sparer des protines selon leur point isolectrique,donc selon leur diffrence de charge diffrents pH. Le fait d'ajouter du SDS ferait en sorte quetoutes les protines auraient la mme densit de charge et, donc, ne pourraient pas tre sparesselon ce type d'lectrophorse.

3.10. Purification des protines.Afin de dterminer le poids molculaire de la protine inconnue, il suffit de tracer le graphe duvolume d'lution en fonction du log du poids molculaire (voir graphe la page suivante).

Protine Log Mr Vel (ml)dextran bleu 6,000 85,00

lysozyme 4,146 200,00

chymotrypsinogne 4,398 190,00

ovalbumine 4,653 170,00


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Protine Log Mr Vel (ml)

srum albumine 4,813 150,00

aldolase 5,176 125,00

urase5,699

90,00

ferritine 5,845 92,00

ovomucoide 4,447 160,00

En dterminant sur le graphe le poids molculaire correspondant au volume d'lution obtenupour l'inconnu, on obtient une valeur de 139 kDa.

Note: la valeur de volume d'lution obtenue pour la ferritine et l'ovomucoide furent exclus de lacourbe car ces protines semblent se comporter diffremment aux autres standards lors de la

chromatographie sur gel de sphadex.

Graphique, problme 3.10

Aldolase

Ferritine

Lysozyme

60

80

100

120

140

160

180

200

4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6

Log masse molculaire

Volumed'lution

Chymotrypsinogne

Ovalbumine

Dextran

Albumine

Urase

Ovomucoide

Log Mr =5.14

Mr = 139 kDa


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*3.11. Purification des protines.La ferritine possde un noyau d'hydroxyde ferrique, lui confrant une densit suprieure auxprotines de mme poids molculaire, ce qui influence son comportement en chromatographiesur gel de sphadex.

3.12. Purification des protines.

En prsence de SDS, toutes les protines possdent une densit de charge identique: c'est ce quipermet de d'utiliser le systme PAGE-SDS afin d'valuer la masse molculaire des protines.Ainsi, deux protines de pI diffrent mais de masse molculaire identique formeront une seulebande en gel PAGE-SDS. Par contre, en absence de SDS (donc dans des conditions dites nativesou non-dnaturantes), la migration des protines vers les bornes ngatives ou positives se fera enfonction de leur charge globale, donc de leur pI. Dans ce cas, deux protines de massemolculaire identique mais de pI diffrents donneront deux bandes distinctes suite la colorationdu gel.

3.13. Purification des protines.

En absence de -mercaptothanol, les ponts disulfure au sein de la protine demeurent intacts.Ainsi la protine adoptera une conformationplus compacte, et migrera plus rapidement en gel dePAGE-SDS qu'un chantillon de la mme protine dont les ponts disulfure ont t rduits et qui,par le fait mme, possde une structure plus allonge.

3.14. Squenage de polypeptidesa) La trypsine hydrolyse le lien peptidique du ct carboxy de acides amins basiques arginine etlysine. Les fragments de digestion avec la trypsine possderont tous des rsidus Arg ou Lys enC-terminal, sauf bien entendu le fragment correspondant l'extrmit C-terminal du peptide.Ainsi, avec le peptide dcrit ici, nous obtiendrons les deux fragments suivants:

A-L-K M-P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R

b) la pepsine hydrolyse le lien peptidique du ct N-terminal des acides amins aromatiques Phe,Trp, et Tyr. Les fragments de digestion la pepsine possderont donc tous un rsidu Tyr, Trp ouPhe leur extrmit N-terminale, sauf bien sr le fragment possdant le rsidu N-terminal dupeptide initial. On obtiendra donc les trois produits de digestion suivants:

A-L-K-M-P-E Y-I-S-T-D-Q-S-N W-H-H-R

c) la protase V8 hydrolyse le lien peptidique du ct C-terminal des acides amins acides Asp etGlu. Les fragments de digestion obtenus possderont donc tous un rsidu Asp ou Glu leur C-terminal, sauf bien sr le fragment possdant le rsidu C-terminal du peptide initial. On obtiendraalors les trois fragments suivants:

A-L-K-M-P-E Y-I-S-T-D Q-S-N-W-H-H-R


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d) le bromure de cyanogne hydrolyse le lien peptidique au niveau du C-terminal des rsidusmthionine. Les fragments de digestion obtenus auront donc tous un rsidu Met leur C-terminal, sauf bien entendu le fragment correspondant au C-terminal du peptide. On aura alorsles deux fragments suivants:

A-L-K-M P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R

3.15. Squenage de polypeptidesLa digestion la carboxypeptidase A nous indique que le rsidu C-terminal du peptide est Ala.

La digestion la trypsine nous permet d'ordonner partiellement deux des quatre fragmentsobtenus (rappel: la trypsine gnre des fragments dont le C-terminal est Arg ou Lys):

Ala-Arg (Phe, Ser)-Lys

De plus, la digestion la trypsine indique quune Lys est situ du ct C-terminal de Lys ou Arg(libration d'une lysine avec la trypsine).La digestion la trypsine indique aussi que le tripeptide (Ala, Met, Ser) correspond au C-terminal du peptide (il n'y a pas de Arg ou Lys dans ce fragment). De plus, la digestion au CNBrnous permet de dduire la position de la mthionine dans ce tripeptide comme tant:

Met-(Ala, Ser)

L'alanine tant le rsidu C-terminal du peptide (voir digestion la carboxypeptidase A), lasquence des trois rsidus du C-terminal du peptide sera:

Met-Ser-Ala

La thermolysine coupe du ct N-terminal de rsidus hydrophobes: on peut donc dduire laposition des rsidus hydrophobes des deux fragments obtenus:

Ala-(Arg, Ser) Phe-(Lys, Lys,)-Met-Ser

Avec cette dernire information et considrant le patron de digestion la trypsine, on peutconclure que la squence du peptide est:

Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala

3.16. Squenage de polypeptidesLa thermolysine coupe le lien peptidique du ct N-terminal de rsidus hydrophobes. Ladigestion des deux fragments du peptide suite la rduction des ponts S-S nous donne:

chane 1: A-C F-P-R-K W-C-R-R V-C

chane 2: C Y-C F-C


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Comme les liens disulfures du peptide sont intacts lors de la digestion la thermolysine, certainsdes fragments dcrits ci-dessus seront lis via des ponts S-S impliquant des Cys. Selon lesfragments de digestion alors obtenus, on peut dduire la position des ponts S-S comme tant:

Note: n'oublions pas qu' la fois des ponts S-S- intrachane etinterchanes peuvent tre prsentsdans la molcule.

3.17. Squenage de polypeptides

La digestion la carboxypeptidase indique que le C-terminal est Lys

Le traitement au DNFB indique que le N-terminal est Val

La digestion la trypsine nous permet d'ordonner partiellement les peptides obtenus comme suit:

peptide C: Try-Ala-Lys peptide D: Val-(Ala, Ala, Ala, Pro)-Lys (rappel: Val est N-terminal)

peptide E: Met-(Asp, Gly)-Arg

On peut ordonner le peptide E grce aux rsultats du traitement au CNBr:

Met-Gly-Asp-Arg

Finalement, le traitement avec la thermolysine permet dordonner les Ala par rapport Pro :

Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys

La squence du peptide est donc:

Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys-Met-Gly-Asp-Arg-Try-Ala-Lys

Chapitre 4. Structure tridimensionnelle des protines

4.1. Structure 3-D des protinesRgle gnrale, les acides amins hydrophobes sont retrouvs l'intrieur des protines (donc

S-S

S - S

- S S -

A-C-F-P-K-R-W-C-R-R-V-C

C-Y-C-F-C


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l'abri du solvant aqueux), et les rsidus polaires ou chargs sont retrouvs la surface desprotines. On aura donc la distribution suivante:

Intrieur: Val, Phe, Ileu

Surface: Glu, Arg, Asn, Lys, Ser, Thr*4.2. Structure 3-D des protinesLa structure de l'ure suggre que celle-ci dnature les protines en brisant les ponts H stabilisantla structure tridimensionnelle de la macromolcule (interaction des groupes amino et ctone del'ure avec les groupes amino et ctone du lien peptidique et avec les chanes latrales).

4.3. Structure 3-D des protinesMme si elle est situe la surface d'une protine, la phnylalanine doit viter le contact avec lesolvant aqueux. Ceci peut tre accompli si deux ou plusieurs sous-units d'une protineglobulaire tablissent des contacts entre-elles via des rgions hydrophobes (pouvant inclure la

Phe), protgeant ainsi ces rsidus non-polaires du solvant aqueux.*4.4. Structure 3-D des protinesLa prsence de lAsp l'intrieur des protines est possible si ce dernier peut tablir desinteractions intermolculaires impliquant ses groupements polaires et chargs. Ceci est entre-autre possible via l'inclusion de l'Asp dans une structure secondaire de type hlice .

4.5. Structure 3-D des protinesLa protine 1 possde un contenu lev en acides amins hydrophiles, et relativement peu dersidus hydrophobes (65% hydrophiles/35% hydrophobes). Ceci suggre que de nombreuxrsidus de cette protine sont en contact avec le solvant, ce qui est le cas pour les protines en

forme de btonnets (qui sont allonges). Il s'agirait donc de la protine A.La protine 3 possde un rapport acides amins hydrophiles/hydrophobe de 50%/50%, alors quecelui de la protine 2 est de 30%/70%. Ceci tend suggrer que la protine 3 serait de formeglobulaire, avec de nombreux rsidus hydrophobes enfouis l'intrieur, et plusieurs acidesamins hydrophobes la surface. La protine 3 serait donc la protine B.

Quand la protine 2, son contenu lev en acides amins hydrophobes et le petit nombred'acides amins hydrophiles prsents suggre qu'elle pourrait tre la protine C, o l'associationdes diffrentes sous-units monomriques s'effectuerait au niveau d'acides amins hydrophobeslocaliss la surface de la protine.

4.6. Structure 3-D des protinesLa structure primaire de ce peptide ne montre aucune caractristique des structures en feuillet ,et il y a absence de rsidus (Gly et Pro) qui normalement dtruisent les structures secondaires.On peut donc en dduire que ce peptide pourrait adopter une structure secondaire en hlice .

4.7. Structure 3-D des protinesLa structure primaire de ce peptide est caractristique des protines adoptant un structure


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secondaire en segment .

4.8. Structure 3-D des protinesLa prsence de plusieurs rsidus chargs positivement (Arg et Lys) ainsi que de la glycineindique que ce peptide n'adoptera aucune structure secondaire prcise (donc pelote statistique).

4.9. Structure 3-D des protinesGrce aux mmes critres tablis au cours des trois problmes prcdents, on peut dduire que:

acides amins 2-12: hlice ;

acides amins 13-17: pelote statistique (random coil);

acides amins 18-26: segment en structure .

4.10. Structure 3-D des protinesLa composition leve en Pro et Hypro indique que la protine C adopte un structure en triplehlice de collagne.

La protine A est riche en acides amins chane latrale petite (Gly, Ser, Ala): elle adopteradonc une structure en feuillet .

La protine B possde une composition en acides amins qui pourrait mener la formation d'unehlice . Cependant, cette hlice pourrait tre dstructure par la prsence occasionnelle dersidus Gly et Pro, et par la prsence d'acides amins basiques ou acides conscutifs.

Chapitre 5. Enzymologie

5.1. Cintique enzymatiquea) D'aprs les donnes disponibles, on remarque que la vitesse de la raction enzymatiquen'augmente pas lorsque la concentration de substrat dpasse 2 x 10 -3 M. Ceci constitue donc lavitesse maximale (Vmax) de l'enzyme, soit 60 mol/min.

b) v est constant une [S] suprieure 2 x 10-3 M car l'enzyme est alors sature par le substrat.

c) Comme une concentration de 2 x 10 -2 M on a atteint la vitesse maximale de catalyse parl'enzyme, presque tout l'enzyme existe sous la forme d'un complexe enzyme/substrat. La quantitd'enzyme libre dans le milieu ractionnel est alors ngligeable.

5.2. Cintique enzymatiquea) Vmax = 0,25 mol/min;

b) Le Km peut tre dtermin en utilisant l'quation de Michaelis-Menten:


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v = [S] Vmax[S] + Km

v[S] + vKm = [S]Vmax

vKm = [S]Vmax - v[S]

vKm = [S] (Vmax - v)

Km = [S] (Vmax - v)v

Prenant les donnes pour une [S] de 5 x 10-6:

Km = 5 x 10-6

M x (0,25 mol/min - 0,071 mol/min)0,071 mol/min

Km = 1,26 X 10-5 M

Note: le mme rsultat sera obtenu si l'on utilise une concentration de substrat diffrente, enautant que v < Vmax.

c) La vitesse initiale sera directement obtenue l'aide de l'quation de Michaelis-Menten:

- pour [S] = 1 x 10-6

M:v = [S] Vmax

[S] + Km

v = 1 x 10-6 M x 0,25 mol/min1 x 10-6M + 1,26 x 10-5 M

v = 0,0184 mol/min

- pour [S] = 1 x 10-1M: v = 0,25 mol/min (concentration saturante de substrat: v = Vmax).

d) Pour une concentration de substrat de 2 x 10-3 M, la vitesse initiale sera gale au Vmax. Onaura alors:

v = Vmax = 0,25 mol/min

Aprs 5 minutes, on aura alors: 0,25 mol/min x 5 min. = 1,25 mol de produit form.


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- Pour une concentration de substrat de 2 x 10-6 M, il nous faut d'abord trouver la vitesse de laraction, ce qui est possible grce l'quation de Michaelis-Menten:

v = [S] Vmax[S] + Km

v = 2 x 10-6 M x 0,25 mol/min2 x 10-6 M + 1,25 x 10-5 M

v = 0,035 mol/min

Donc, aprs 5 minutes de raction, on aura:

v = 0,035 mol/min x 5 min. = 0,175 mol de produit form.

e) Comme le Km est indpendant de la concentration d'enzyme, il ne sera pas affect parl'augmentation de [E] de demeurera gal 1,25 x 10-5 M.

Par contre, le Vmax sera altr car: Vmax = k cat x [Et]. Ainsi, comme kcat est une constante,l'augmentation de la concentration d'enzyme par un facteur 4 multipliera aussi le Vmax d'unfacteur 4. On aura alors Vmax = 1 mol/min.

5.3. Cintique enzymatiqueLe graphe de Lineweaver-Burke reprsente la rciproque de la vitesse initiale (1/v) en fonctionde la rciproque de la concentration du substrat (1/[S]). D'aprs les donnes du problme, on aura

alors les valeurs suivantes:

1/[S] M-1 1/v (mmol-1 x min.)1000,00

0,01542000,00

0,015810 000

0,019620 000

0,023833 333

0,030350 000

0,0370100 000

0,0588200 000

0,10501 000 000

0,45502 000 000

0,9090


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50

y = 4E-07x + 0.0149

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

-500000 0 500000 1000000 1500000 2000000

1/[S]

1/v

Le graphique de Lineweaver-Burke est reprsent ci-dessous.

Le Km est facilement obtenu par la rciproque de l'intersection sur l'axe des x. Dans ce cas-ci,Km = 2.7 x 10-5 M.

Quant lui, le Vmax est obtenu par la rciproque de l'intersection sur l'axe des y. Ici, Vmax =67 mol/min.

5.4. Cintique enzymatiquePour dterminer l'affinit de l'enzyme pour son substrat, on doit trouver la valeur de la constantede Michaelis-Menten. Ceci est facilement ralis grce au graphe de Lineweaver-Burke:

1/ [S] (M-1 x 10-4) 1/v (mol-1 x min.)(pH 7,6)

1/v (mol-1 x min.)(pH 9,0)

5,74 13,51 29,413,75 11,76 21,281,90 10,20 13,330,60 8,77 7,810,25 - 5,99

-1/Km = 36,750Km = 2.7 x 10-5M

-1/Vmax = 0.0149Vmax = 67 mol/min


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Le graphe de Lineweaver-Burke est reprsent ci-dessous.

L'intersection des droites avec l'axe des x donne la valeur de -1/Km. Sur le graphique, plus lavaleur de -1/Km est petite, plus Km sera grand. Km est une constante d'affinit de l'enzyme pourle substrat et est quivalent la concentration de substrat ncessaire afin d'atteindre 1/2 Vmax.

Ainsi lorsque Km est lev, l'enzyme a peu d'affinit pour le substrat: il faut beaucoup desubstrat l'enzyme afin d'atteindre 1/2 Vmax.

D'aprs le graphique, on peut donc constater, sans dterminer exactement leur valeur, que le Kmde l'enzyme est suprieur pH 9 par rapport pH 7,6. Ainsi, se sera donc pH 7,6 que l'enzymeaura la plus forte affinit pour son substrat.

5.5. Cintique enzymatiqueAfin de rsoudre ce problme, nous devons d'abord dessiner le graphe de Lineweaver-Burke. Latransformation des donnes donne les rsultats suivants:

1/[S] (M-1) 1/v (mmol-1 x min.)sans inhibiteur

1/v (mmol-1 x min.)avec inhibiteur

10 0000,0357 0,0588

6 666,670,0277 0,0435

5 0000,0233 0,0345

pH = 9

0

5

10

15

20

25

30

35

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8

1/[S]

1/V

pH = 7.6


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52

2 0000,0154 0,0200

1 333,330,0135 0,0164

Et le graphe de Lineweaver-Burke est donn ci-dessous.

a) le Vmax nous est donn par la rciproque de l'intersection sur l'axe des y. Dans ce cas-ci:

1/Vmax = 0,0101 mol-1 x min.

Vmax = 99 mol/min

Comme l'intersection sur l'axe des y est la mme en absence qu'en prsence de l'inhibiteur, onpeut conclure qu'il s'agit d'une inhibition comptitive.

b) le Km nous est donn par le ngatif de la rciproque de l'intersection sur l'axe des x. Dans cecas-ci, les Km seront les suivants:

- en absence d'inhibiteur:

-1/Km = 3 800 M-1

Km = 2,63 x 10-4 M

- en prsence de l'inhibiteur:

-1/Kmapp

= 2000 M-1

Kmapp = 5 x 10-4 M

c) le Ki peut tre dtermin l'aide des donnes prcdentes grce l'quation:

Kmapp = Km + Km [I]Ki

Ki = Km [I](Kmapp-Km)

Ki = 2,63 x 10-4 M x 2,2 x 10-4M(5 x 10-4 M - 2,63 x 10-4 M)

Ki = 2,44 x 10-4 M


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5.6. Cintique enzymatiquea) afin de trouver le Km et le Vmax, nous devons tracer le graphe Lineweaver-Burke (reprsentci-dessous):

1/[S] (M-1) 1/v (mol-1x min.) 1/v (mol-1x min.)inhibiteur A

1/v (mol-1x min.)inhibiteur B

2000,00 0,80 1,22 2,08

4000,00 1,15 2,02 3,035882,00 1,49 2.78 4,008333,00 1,85 3.76 5,0010 000 2,22 4,42 5,88

y = 3E-06x + 0.0097

y = 5E-06x + 0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

1/[S]

1/V

Avec inhibiteur

Sans inhibiteur

1/Vmax = 0.0101 mol-1minVmax = 99 mol/min

-1/Km = 3800 M-1Km= 2.63 x 10-4 M

-1/Kmapp =2000 M-1

Kmapp= 5 x 10-4 M

1/V


55/70

54

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

1/[S]

1/v

Sans inhibiteur

Inhibiteur A

Inhibiteur B

La valeur du Vmax de l'enzyme nous est donne par la rciproque de l'intersection de la droitesur l'axe des y. Ainsi, Vmax = 2,36 mol/min.

De mme, le Km de l'enzyme nous est donn par le ngatif de la rciproque de l'intersection surl'axe des x. Ainsi, Km = 4,4 x 10-4 M.

b) D'aprs le graphe de Lineweaver-Burke, l'inhibiteur A possde un Vmaxapp de 2,36 mmol/minet un Kmapp de 8.3 x 10-4 M. Ceci correspond un inhibiteur de type comptitif, tel un analoguedu substrat.

Quand l'inhibiteur B, son Vmaxapp est de 0,889 mol/min et son Kmest de 4,4 x 10-4 M. Le Kmest identique celui de l'enzyme sans inhibiteur: on a donc une inhibition non-comptitive. Cetype d'inhibition est observ lorsque l'inhibiteur n'interfre pas avec l'interaction enzyme-

substrat. Ceci est le cas pour un agent alkylant, qui inhibe l'activit enzymatique en alkylantl'enzyme. Lalkylation des enzymes peut modifier la conformation de la protine, modifiantlgrement la structure du site actif et, par le fait mme, rendre lenzyme moins efficace commecatalyseur de ractions.

c) Constante d'inhibition de l'inhibiteur A: pour l'inhibition comptitive, on a:


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55

Kmapp = Km + Km [I]Ki

Ki = Km [I](Kmapp-Km)

Ki = 4,25 x 10-4 M x 5 x 10-4M(1,11 x 10-3 M - 4,25 x 10-4 M)

Ki = 5.64 x 10-4 M

Constante d'inhibition pour l'inhibiteur B: pour l'inhibition non-comptitive, on a:

Vmaxapp = Vmax(1 + [I]/Ki)

Ki = Vmaxapp [I]Vmax- Vmaxapp

Ki = 0,889 mol/min (3,2 x 10-6M)(2,36 mol/min - 0,889 mmol/min)

Ki = 1.93 x 10-6 M

d) la vitesse initiale peut tre dtermine par la modification de l'quation de Michaelis-Mentenpour les inhibiteur comptitifs:

v = Vmax x [S][S] + Kmapp

et Kmapp = Km + Km [I]Ki

Kmapp = 4,4 x 10-4 M + 4,4 x 10-4 M x 2 x 10-5 M5.64 x 10-4 M

Kmapp = 4,56 x 10-4 M

On aura alors:


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56

v = Vmax x [S][S] + Kmapp

v = 2,36 mol/min x 3 x 10-4 M

3 x 10-4 M + 4,56 x 10-4 M

v = 0,936 mol/min

5.7. Catalyse enzymatiqueLe fait que le pH optimal de l'enzyme soit pH 8,0 suggre que l'tat d'ionisation (ou deprotonation) de rsidus d'acide amin du centre actif de l'enzyme est important pour l'activit decette dernire. Par exemple, pH infrieur 8, la protonation de la chane latrale d'un rsiduhistidine (pKaR = 6) pourrait altrer le mcanisme de catalyse enzymatique soit directement au

sein du site actif, soit indirectement en induisant un changement conformationnel de la protine. un pH suprieur 8, la dprotonation de groupements prcis (e.g chane latrale de Tyr ouLys; groupe amino-terminal) pourrait avoir la mme consquence sur l'activit enzymatique.

5.8. Catalyse enzymatiquea) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 4, on peut supposer que la partie ascendante de lacourbe pourrait tre attribuable l'ionisation du groupe carboxyl de la chane latrale d'un Asp,ou du groupe -carboxyl de l'acide amin C-terminal. Pour la partie descendante, elle pourraittre le rsultat de la dprotonation de l'His ou de l'ionisation de la Glu.

b) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 11, la portion ascendante de la courbe pourrait tre

attribuable la dprotonation du groupe amino de la chane latrale de Lys. Quant la partiedescendante de la courbe, elle pourrait tre la consquence de la dprotonation de Arg.

5.9. Catalyse enzymatiqueAfin de rpondre cette question, nous devons d'abord dessiner le graphe de la vitesse de laraction en fonction de la concentration en substrat (voir page suivante).

D'aprs l'allure du graphe, A est une enzyme ordinaire qui suit la cintique de Michaelis-Menten.La vitesse initiale de la raction catalyse par l'enzyme A ne dpend que de la concentration dusubstrat, la vitesse maximale tant atteinte en prsence d'un excs de substrat.

Grce au graphique, on peut aussi conclure que l'enzyme B est une enzyme allostrique. En effet, des concentrations peu leves de substrat, l'enzyme (qui possde plusieurs sites de liaison dusubstrat) adopte une conformation telle que son affinit pour le substrat est faible. La vitesse deraction est alors lente. Par contre, la liaison d'une molcule de substrat l'enzyme induit unchangement conformationnel chez cette protine qui a pour consquence d'augmenter l'affinitdes autres sites envers le substrat. Plus la concentration en substrat augmente, plus le nombre desites haute affinit pour le substrat augmente, ce qui conduit une plus grande vitesse deraction.


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57

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

[S] (x 103M)

V(mmol/min)

Enzyme A

Enzyme B

Chapitre 6. Structure et proprits des acides nucliques.

6.1. Structure des acides nucliques.Le polynuclotide dont il est question ici est de l'ARN (remarquez la prsence de l'uracilecomme base azote). Mme si l'ARN n'existe pas, comme l'ADN, sous forme d'une doublehlice, il peut tout de mme adopter une structure secondaire hlicodale via l'appariement dergions complmentaires l'intrieur mme de la molcule. Les structures secondaires les plusstables seront videmment celles impliquant le plus de pont H (donc, celles o l'on aura le plusgrand nombre de paires de base). Dans le cas de la molcule qui nous intresse, les deuxstructures les plus stables seront:

AUCCCGAGUGCACCACGUAAUGGA3

C

AAGGGCUCACGUGGUGCAUUA5

AC C

G CU AG C

AUCCCGA GUAAUGGA3

C

AAGGGCU CAUUA5

C G

A U

C G

G G

U


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*6.2. Structure des acides nucliques.a) Comme le Tm n'a pas t atteint, les deux chanes polynuclotidiques ne se sont pascompltement spares, et sont donc encore alignes selon leur squence complmentaire. Onobtiendra alors une courbe du style suivant:

b) Comme on a largement dpass le Tm, les deux chane polynuclotidiques se sont spares.Lors de la rhybridation, les deux molcules devront s'aligner selon leurs paires de basescomplmentaires, ce qui est un processus relativement long (implique des collisions au hasard denos deux molcules monocatnaires). Comme le temps allou pour le refroidissement est assezcourt, la molcule d'ADN n'aura pas le temps de se rhybrider. L'absorbance ne diminuera doncque trs peu suite au chauffage, et on aura une courbe du style:

c) Une courbe parfaitement rversible peut tre obtenue si l'alignement peut se faire trsfacilement. Ceci est le cas si l'on a affaire des polynuclotides peu complexes du typepoly(G):poly(C), ou poly (AT):poly(AT).

Temprature juste

sous le Tm

Temprature (oC)

Temprature

augmente

Temprature

diminue

A260nm

Temprature>>>Tm

Temprature (oC)

Temprature

augmente

Temprature

diminue

A260nm


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6.3. Structure des acides nucliques.L'hydrolyse des acides nucliques implique la cassure des liens phophodiesters liant chaquenuclotides dans l'orientation 5' vers 3'. La seule diffrence majeurs dans le squelette sucre-phosphate entre l'ARN et l'ADN est la prsence d'un groupe hydroxyl en position 2' du ribosechez l'ARN. Ainsi, en milieu alcalin, ce groupe peut tre facilement ionis, gnrant un O- qui

peut facilement briser le lien phosphodiester en attaquant le groupe phosphoryl adjacent:

6.4. Structure des acides nucliques.Ces donnes peuvent tre interprte de la manire suivante:

a) si l'on refroidi la solution d'acide nuclique rapidement, l'absorbance 280nm ne varie quetrs peu, indiquant que les chanes de polynuclotides restent l'tat monocatnaire (la molculereste donc dnature).

b) si l'on refroidi la solution d'acide nuclique lentement, on observe un diminution progressivede l'absorbance 260 nm, indiquant que notre molcule est passe de l'tat monocatnaire bicatnaire (il y a donc eu rhybridation).

6.5. Structure des acides nucliques.La structure de l'IMP est la suivante:

L'IMP peut donc former des ponts H avec l'adnosine etavec la cytosine (compare la structurede lIMP avec celle de lAMP et de la CMP). Donc, lincorporation dans l'ADN mettrait

O

Base

-O-P-O-CH2

O

O-

O--O-P-O

O

O

O

Bas

e

CH2

O--O-P-O

O

O

H+

O

Base

-O-P-O-CH2

O

O-

O

O-P

O

O-

O

Ba

se

OHCH2

O--O-P-O

O

O

+

N

N

N

N

O

H

Ribose


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videmment en danger l'intgrit du code gntique en permettant une ambigut dans le pairagedes bases, ce qui serait ltal court terme pour l'organisme.

6.6. Structure des acides nucliques.a) la ribonuclase pancratique coupe l'ARN du ct 3' des nuclotides pyrimidiques, gnrant

une extrmit 3' phosphate. Dans le polynuclotide suggr dans cet exemple, la ribonuclasepancratique donnera donc les produits de digestion suivants:

5'pACp3' 5'GAUp3' 5'GCp3' 5'Up3' 5'AUp3' 5'C3'

b) la ribonuclase T2 coupe du ct 3' des nuclotides adnosine, et gnrera une extrmit 3'phosphate. On aura alors:

5'pAp3' 5'CGAp3' 5'UGCUA3' 5'UC3'

c) la ribonuclase T1 coupe du ct 3' des nuclotides guanosine, et gnrera une extrmit 3'phosphate. On aura alors:

5'pACGp3' 5'AUGp3' 5'CUAUC3'

6.7. Structure des acides nucliques.La phosphodiestrase de venin de serpent ne coupe que le nuclotide situ en 3'-terminal del'ARN, gnrant un nuclotide 5'phosphate. Cette information nous indique que Cp est situ en3'-terminal de notre polynuclotide.

La ribonuclase pancratique coupe du ct 3' des nuclotides pyrimidiques, gnrant desproduits de digestion se terminant par une pyrimidine 3' phosphate. D'aprs les rsultats obtenus,on peut dduire les squences suivantes:

5'ACp3' 5'(A,G)Up3'

Finalement, la ribonuclase T2 coupe aprs l'adnosine, gnrant des fragments se terminantavec une adnosine 3'phosphate. On peut donc utiliser cette information afin d'ordonner lessquences du produit obtenu:

5'(CG)Ap3'

De plus, la prsence de pAp aprs digestion avec la ribonuclase T2 indique que A est lenuclotide 5'-terminal.

En recoupant les informations obtenues par l'utilisation de ces trois enzymes, on obtient lasquence finale suivante:


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5'pACGAUCp3'

6.8. Structure des acides nucliques.La phosphodiestrase de venin de serpent libre le nuclotide situ l'extrmit 3' du fragment.

Le rsultat obtenu nous indique que pC est le nuclotide 3' terminal pour notre polynuclotide.La ribonuclase pancratique coupe les molcules d'ARN du ct 3' des pyrimidines, gnrantdes fragments se terminant avec une pyrimidine 3' phosphate. Grce aux fragments obtenus, onpeut dduire en partie leur squence:

5'GCp3' 5'AUp3' 5'(A,G)Cp3'

De plus, le fait que l'on a libr 2 Cp indique ces nuclotides sont situs tout de suite aprs U ouC.

L'ARNase T1 coupe du ct 3' de la guanosine, gnrant des fragments se terminant avec uneguanosine 3'phosphate. Quant la ARNase T2, elle coupe du ct 3' des adnosine, gnrant desadnosine 3'phosphate. L'utilisation combine de ces deux enzymes donnera un mlange defragments coups par l'un ou l'autre de ces enzymes, ou mme par les deux enzymes. On peutdduire la squence des fragments obtenus:

5'CCAp3' 5'(C,U)Gp3'

Note: on a dduit la prsence de deux C dans le premier fragment car on mentionne qu'il s'agitd'un trinuclotide, et qu'il manque un C si l'on fait le dcompte des nuclotides obtenus aprsdigestion avec le mlange T1 + T2.

D'aprs le rsultat obtenu avec la ribonuclase pancratique, l'uridine est prcde de l'adnosine.On aura alors le fragment suivant:

5'AUCGp3'

De plus, toujours d'aprs le rsultat avec T1 + T2, l'obtention de pGp indique que ce dernier estle nuclotide 5'-terminal. Le rsultat obtenu avec la ribonuclase pancratique indique aussi quece G est suivi de C. Aussi, le fait d'avoir obtenu C et Ap indique que ces deux nuclotides sontsitus tout de suite aprs A ou G.

On a donc jusqu'ici la squence suivante:

5'pGC....AUCG....C3'

Il ne nous reste que A et C placer. Comme avec la digestion avec T1 + T2 on a eu la squence5'CCAp3', ceci suggre que C est plac entre pGC...AUCG. Enfin, le dernier nuclotide, A,devrait logiquement tre situ l'avant-dernire place.


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En tenant compte de ces diffrents rsultats, on arrive la squence suivante:

5'pGCCAUCGAC3'


pH neutre, les bases azotes sont non-ionises. Les charges ne proviendront donc que desgroupes phosphates. Comme on a dans l'exemple suggr trois phosphate formant les liaisonsphosphodiester, on aura 3 x (1-) = 3 charges ngatives.

6.10. Structure des acides nucliques.Une fois l'ADN circulaire dnatur, les deux brins, quoique spars, forment deux cercles quis'enchevtrent. Au cours de la renaturation, il se retrouvent donc beaucoup plus facilement queles brins complmentaires spars d'un ADN linaire dont la rencontre s'effectue au hasard descollisions.


La temprature de fusion dpend de la force ionique: en diminuant la force ionique, on abaisse latemprature de fusion. Dans le cas extrme d'une force ionique nulle, la rpulsion lectrostatique l'intrieur de l'ADN, dont les groupements ne sont pas protgs par des contre-ions, estsuffisante pour rduire la temprature de fusion moins de 20oC.

6.12. Structure des acides nucliques.L'ADN sous la forme B a une longueur de 3,4 nm (34 A) pour 10 paires de bases. Lechromosome de E. coli, avec 4 000 kb (donc 4 000 000 pb), possde ainsi une longueur de 1,36 x106 nm, soit prs de 1,4 mm.

6.13. Synthse des acides nucliques.Lors de l'exprience de Meselson et Stahl, on incube d'abord les bactries dans un milieu deculture ne contenant que du 15N, et on transfre ensuite les cellules dans un milieu ne contenantque du 14N. Les rsultats suivants sont alors obtenus:

Aprs 0 gnration: 100% ADN lourd :

Aprs 1 gnration: 100% hybride :

Aprs 2 gnrations: 50% hybride, 50% lger

Aprs 3 gnrations: 25% hybride, 75% lger.


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6.14. Synthse des acides nucliques.Le brin de dpart (+) est compos de: 10% A, 20%G, 30%C et 40%T. Suite sa rplication, lebrin (-) qui lui est complmentaire aura la composition: 40%A, 30%G, 20%C et 10%T (parceque A s'apparie uniquement avec T, et C uniquement avec G). Enfin, lors de la transcription dubrin (-), l'ARN form possdera une composition en base qui lui sera complmentaire, soit

10%A, 20%G, 30%C et 40% U.6.15. Synthse des acides nucliques.Cette observation ne peut s'expliquer que si le gnome de E. coli s'est rpliqu 1 1/2 fois lors dela sparation physique des bactries.

**6.16. Synthse des acides nucliques.a) comme aucune molcule hybride n'est obtenue, nous devons conclure qu'un mcanisme derplication conservatifa lieu, au cours duquel les brins servant de gabarit reforment le duplexinitial aprs chaque ronde de rplication.

b) La prsence d'ARN polymrase suggre qu l'ADN bactrien est d'abord transcrit en unemolcule d'ARN. Par la suite, cet ARN (rsistant la ADNase) est converti en ADN (sensible la ADNase) via la rduction du carbone 2' par la nouvelle activit enzymatique et le NADH.Finalement, cet ADN sert de gabarit l'ADN polymrase, formant une molcule d'ADNbicatnaire identique au duplex parental initial.

6.17. ARNm et transcription.a) Lintroduction de mutations par absence dactivit ddition est un phnomne alatoirenaffectant quun petit nombre de copies dun ARN donn. De plus, chaque ARNm a une demi-vie trs courte et il ne dirige la synthse que de quelques molcules de protines avant dtredgrad. Lintroduction de mutations dans lARNm naffectera donc quune infime minorit desmolcules dune protine donne, ce qui sera sans effet apparent pour la cellule.

b) Lutilisation dun intermdiaire ARN afin de synthtiser lADN rsulterait dans lapparitionrapide de mutations dans le matriel gntique de lorganisme cause de lincapacit de lARNpolymrase corriger les erreurs survenues lors de la transcription. Ceci explique entre autrepourquoi certains virus ARN (p.ex. HIV) possdent un taux de mutation trs lev et peuventainsi chapper plusieurs formes traditionnelles de thrapie anti-virale.

6.18.ARNm et transcription.La courte demi-vie des ARNm permet 1) de se dbarrasser rapidement de transcrits ayant subides mutations, et 2) de rguler rapidement lexpression des gnes. En effet, larrt de latranscription dun gne sera suivie rapidement de la dgradation complte des ARNmcorrespondants, assurant ainsi un arrt rapide de la synthse de la protine encode par ce gne.

6.19. ARNm et transcription.a) La vitesse maximale de transcription tant de 4,300 nuclotides par minute (70 nuclotides parseconde x 60 secondes), un gne de 6,000 pb sera alors transcrit en approximativement 1.4minutes.


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b) tant donn que 70 pb sont couvertes par chaque molcule dARN polymrase, on aura quunmaximum de 86 molcules de polymrase pourront se retrouver attach ce gne un instantdonn.

6.20.Codage des protines.

a) l'aide du code gntique, on a la squence en acides amins suivante:AGU CUC UGU CUC CAU UUG AAG AAG GGG AAG GGG

Ser - Leu - Cys - Leu - His - Leu - Lys - Lys - Gly - Lys - Gly

b) Le rsultat des mutations sera:G

AGU GCU CUG UCU CCA UUU GAA GAA GGG AAG GGG

Ser - Ala - Leu - Ser - Pro - Phe - Glu - Glu - Gly - Lys - Gly

6.21. Codage des protines.

a) Commenons par convertir la squence en acides amins du type sauvage en squence ennuclotides:

- Tyr - Lys - Ser - Pro - Ser - Leu - Asn - Ala - Ala - Lys -

AUAU - AAA - UCX - CCX - UCX - UUG - AAC - GCX - GCX - AAG -

C G - AGU - AGU - CUX U AC C

Convertissons maintenant la squence en acides amins du mutant en squence en nuclotides:

- Val - His - His - Leu - Met -- GUX - CAU - CAU - UUA - AUG

C C G- CUX

Le mutant n'a donc pas pu tre form par une seule mutation: on a besoin d'une mutation pour

changer la squence sauvage en squence mutante, et d'une seconde mutation pour fairel'opration inverse (i.e. mutant sauvage).

Si l'on tudie attentivement les squences sauvages et mutantes, on s'aperoit que la squencemutante peut tre obtenue suite la dltion de la septime base de la squence sauvage (i.e. le Adu codon AGU de Ser). On obtient effectivement:


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ASauvage: UCX - CCX - UCX - UUG - AAC

AGU - AGU - CUX UC

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