Biologie Moléculaire des LAP Maladie résiduelle DES/DES … · Mode d’action des récepteurs...
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Biologie Moléculaire des LAP Maladie résiduelle Bruno CASSINAT Hôpital Saint-Louis
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Biologie Moléculaire des LAP
Maladie résiduelle
Bruno CASSINAT
Hôpital Saint-Louis
CSH
Platelets
Eosinophils
Erythrocytes
Granulocytes
Monocyte/
macrophages Lymphocytes
EMP
GMP
CM
P
CLP
GM-CSF
M-CSF
VD3
CSH Plaquettes
SCF
IL-3
IL-6
IL-11
IL-12
LIF Erythrocytes
Granulocytes
Monocyte/
macrophages
G-CSF
GM-CSF
AR
E/MK
progenitor
GM
progenitor
SCF
IL-3
G-CSF
GM-CSF
Contrôle par les cytokines et hormones
EPO
TPO
CLP
NB: Importance de la disponibilité des récepteurs: régulation transcriptionnelle
CSH
CM
P
CLP
AML-1
SCL
GATA-2
Lmo-2
C/EBPa
PU.1
PU-1
GATA-1
Contrôle par les Facteurs de Transcription
d ’après Ward et al., 2000 et Tenen 2007
Granulocytes C/EBPe
RARa
Gfi-1 (répresseur)
PU.1
IRF8
Plaquettes GATA-1
NF-E2
GATA-1
EKLF Erythrocytes
GATA-1
FOG MEP
PU.1
C/EBPa
RARa
GMP
PU-1
GATA-2
GATA-1
CM
P
Contrôle par les Facteurs de Transcription
Monocyte/
macrophages
Mode d’action des récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque
en absence de ligand
Répression de la transcription
Déacétylation des histones
Complexe corépresseur
NCoR / SMRT
HDAC
RAR RXR
Complexe coactivateur P300/CBP
p160
HMT
kinase
PCAF
Histones acétylation
en présence de ligand doses physiologiques (nM)
Répression de la transcription
RAR RXR
Acide rétinoïque
( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)
Mode d’action des récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque
en présence de ligand doses physiologiques (nM)
en absence de ligand
Répression de la transcription
Déacétylation des histones
Complexe corépresseur
NCoR / SMRT
HDAC
RAR RXR
Complexe médiateur SMCC
facteurs de transcription RNA
pol II
( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)
RARE TATA
Complexe coactivateur P300/CBP
p160
HMT
kinase
PCAF
RAR RXR
Acide rétinoïque Activation de la transcription
activation de la transcription Complexe médiateur
SMCC RNA
pol II facteurs de transcription
Contexte de la LAM3
RARE TATA
Doses physiologiques d’ATRA (nM)
Répression de la transcription
Déacétylation des histones
Complexe corépresseur
NCoR / SMRT
HDAC
RAR RXR
Acide rétinoïque
PML
PML : forte affinité pour le complexe corépresseur
Acétylation des histones
RARE TATA
Doses pharmacologiques d’ATRA (µM)
RAR RXR
Acide rétinoïque
PML
Complexe coactivateur P300/CBP
p160
HMT
kinase
PCAF
( d'après J. Bastien, C. Rochette-Egly, 2004)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
RARa (17q12-21) Point de cassure
bcr3
transcrit court ou bcr3 (20%)
Bcr3
bcr2
transcrit intermédiaire ou bcr2 (10%)
Bcr2
bcr1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PML (15q22-23)
transcrit long ou bcr1 (70%)
Exons 3 4 5 6 7a 3 4
Bcr1
PML RARa
t(15;17): trois transcrits PML-RARa
p= 0.06
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
months
bcr2, bcr3 bcr1
Event-free survival
p= 0.05
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
months
bcr2, bcr3 bcr1
Time to relapse after remission
Pronostic selon le typage Bcr
p= 0.05
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
months
bcr2, bcr3 bcr1
Overall survival
N= 110 Mais:
Non indépendant de la leucocytose
Reciprocal translocations with concurrent deletions
Translocations with large deletions
Welch et al JAMA 2011
Insertional Fusions
D’après T Ley
Translocations des APL
PML-RARa
PLZF-RARa
NuMA-RARa
NPM-RARa
STAT5b-RARa
PRKAR1A
FIP1L1-RARa
t(15;17)
insertions
t(11;17) (q23;q21)
t(11;17) (q13;q21)
t(5;17)
der(17)
der(17)
t(4;17)
> 95%
1%
1 cas
< 1%
1 cas
1 cas
1 cas
B C A D E F
B C D E F
B C D E F
B C D E F
B C D E F
B C D E F
RARa
PML-RARa
PLZF-RARa
NuMA-RARa
NPM-RARa
STAT5b-RARa
DNA
binding
Ligand binding
transactivation
dépendante de l’ATRA 530
Coiled-coil Pro Ring B1 B2
POZ/BTB Pro Zn
fingers
455
Coiled-coil Phosphorylation
1883
Oligomérisation
Coiled-coil DNA
binding
SH3 SH2
117
636
Protéines de Fusion X-RARa
Maladie résiduelle
Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute
PCR
Standard +++ +
_ _ + +++
Temps
Marqueur Diagnostic
Pronostic Réponse
traitement
Suivi
Rechutes
PCR
Quantitative
Accumulation des produits de PCR
Seuil
Cycle Seuil = Ct
Pour quantifier nécessité de détecter le cycle seuil (proportionnel à quantité de cible dans échantillon initial)
Nécessité de suivre en temps réel l’apparition de l’ADN
Méthodes fluorescentes
PCR Quantitative en temps réel
3’ 5’
5’ 3’
5’
3’
Amorce sens
Amorce antisens
R Q
3’
3’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Q
3’
3’
3’ 5’ 5’ 3’
5’
Q
3’
3’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Q
3’
Polymérisation
Déplacement du brin
Clivage
Fin de la polymérisation
R
R
R = Reporter Q = Quencher
Sonde Taqman
Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10
Ct des différentes dilutions
Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10
Sonde
Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel
1 2 3 4 5 6
RARa PML
Sonde
1 2 3 4 5 6
Bcr1
Bcr2
Sonde
1 2 3
RARa PML
Bcr3
Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene (ABL1 etc…)
Hokland P , and Ommen H B Blood 2011;117:2577-2584
Traitement Entretien et hors traitement
Indétectable
10
102
103
104
105
106
107
Diagnostic 1 mois
RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois
N= 25
No
mb
re d
e c
op
ies a
u d
iagn
ostic
Valeur pronostique?
% o
f p
ati
en
ts p
er
arm
MRD fin d’induction (n= 370 patients)
MRD après 1ère
Consolidation
pati
en
ts p
er
arm
Exemples APL 2006
Echantillon positif ne prédit pas la rechute
- après l’induction
- après la consolidation
Seul point reconnu: négativité après les consolidations
RQ-PCR: réduction du transcrit sous traitement
Fin de Consolidation :
ELN recommendations: Sanz et al, Blood 2009
10
102
103
104
105
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
HR
mR
(Months)
6
4
PM
L-R
AR
/PB
GD
x1
04
10
102
103
104
105
2 4 6 8 10 12 14 16
HR
BM PB
mR
(Months)
2
3
PM
L-R
AR
/PB
GD
X1
04
10
102
103
104
105
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(Months)
HR
3 PM
L-R
AR
/PB
GD
X1
04
Tous les 3 mois: permet de détecter la rechute
Mais pas toujours
Exemples APL 2006
Induction + consolidation
Maintenance
Rythme des prélèvements de MRD
Rythme des prélèvements de MRD
Grimwade et al., JCO 2009
Cinétique de rechute variable, parfois très rapide
RQ-PCR: recommandation de suivi
Type de prélèvement: Moelle ou Sang ?
Fréquence de prélèvement:
- Diagnostic, Induction, 1ère et 2ème conso
- Entretien: tous les 3 - 6 mois
- Après traitement: ??
Rechute = évènement très rare !!
Lo-Coco et al., NEJM 2013
Critères à prendre en compte:
Efficacité du suivi: probabilité de détecter la rechute
Coût
Acceptation par le patient
Réserver à sous-population ?
-Patients à risque ? Mais lesquels ?
-Traitement incomplet
-Enfants
-Protocoles de désescalade ?
Anomalies additionnelles détectées par SNP arrays
Akagi et al., Blood 2009
Additions
Délétions
LOH
47 patients analysés
19 patients avec 1 anomalie ou plus
Anomalies additionnelles détectées par SNP arrays
Valeur pronostique ?
Nowak et al, 2012
Mutations détectées par exome sequencing
Cas des sujets sains
Les mutations non leucémogènes s’accumulent en fonction de l’âge
Welch et al., cell 2012
3 clones analysés par échantillon.
Sang de cordon et HSC de moelle isolées de
sujets sains d'âge croissant,
D’après T Ley
Mutations détectées par exome sequencing
Reanalysis with deep coverage of
RMGs
D’après T Ley
Mutations détectées par exome sequencing
Ding et al, Nature 2012
Evolution clonale des LAM
Welch et al., cell 2012
Modèle intégrant les différents types de mutations dans les LAM
Evolution clonale et sous-clonale
Welch et al., cell 2012
Nombreux sous-clones dans les LAM3
Evolution clonale et sous-clonale
Evolution clonale et sous-clonale: rechute ?
Rechute = évènement très rare !!
Mutations dans ATRA Ligand Binding Domain de PML-RAR
chez patients résistants à l’AR
Lo-Coco et al., NEJM 2013
Gallagher et al., Blood 2012
Mutations dans PML proche site liaison
As2O3 chez patients résistants à l’Arsenic
Goto et al., Blood 2011
