Biologie Moléculaire & Génie Génétique

Biologie Moléculaire & Génie Génétique

6GT SG&SB FWB

A.R. d’Esneux

Maître de Stage: Sylvie Bossrez

Stagiaire: Pierre LECOCQ

1

Introduction & Plan du cours

Les leçons proposées dans ce document s’adressent aux élèves de 6-ième Générale/Transition, Sciences Générales (2P/sem). Elles portent sur l’acquisition de compétences/connaissances en Biologie Moléculaire / Biotechnologies et incluent la mise en pratique expérimentale (labo). Ce document sera distribué en partie aux élèves aux élèves au fil des leçons et accessibles dans sont entièreté (excepté évaluation, publiée plus tard) lors de la dernière leçon précédent l’évaluation via le lien: http://ngyx.eu/homepage/AESS/PrepasStages/Biologie/ar_esneux_jan2015/index.html Sachant que la matière proposée est importante il est fortement recommandé aux élèves d’assister aux leçons de manière proactive: Prendre des notes pour pouvoir discerner les éléments importants (évaluation…) de ceux donnés à titre plutôt informatif.

Leçons Titre/Contenu

6 GT SG 1 ADN, Transgénèse.

6 GT SG 2 PCR + Intro aux Labos d’Electrophorèse et de Transformation Bactérienne.

6 GT SG 3 Labos d’Electrophorèse et de Transformation Bactérienne (info: Enzymes de Restriction / Plasmide)

6 GT SG 4 Analyse des Résultats expérimentaux. Clonage et Séquençage.

6 GT SG 5 Fin clonage et Séquençage. Au choix Thérapie Génique, Next Generation Sequencing, VIH, Bioinformatics . + Info. Evaluation.

6 GT SG 6 Evaluation.

2

http://ngyx.eu/homepage/AESS/PrepasStages/Biologie/ar_esneux_jan2015/index.html

http://ngyx.eu/homepage/AESS/PrepasStages/Biologie/ar_esneux_jan2015/index.html

ADN, ARN & Protéines: Evaluation des Connaissances (1a)

3

5’- AAGCGGCTACaatgccgcTCGCCTATgccaccccgtGCCCCGCCTAGccgctaaGGGATT -3’

3’- TTCGCCGATGttacggcgAGCGGATAcggtggggcaCGGGGCGGATCggcgattCCCTAA -5’

5’- TCAGCTAGCGGATTAAGCATAT -3’

3’- AGTCGATCGCCTAATTCGTATA -5’

Soit le fragment d’ADN ci-dessous où les bases soulignées représentent des sites potentiels d’initiation de la transcription et où les bases en minuscule représentent des introns.

1. Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse. 2. Ecrivez la séquence de l'ARNm, telle qu’elle se présente dans le cytoplasme. 3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction. 4. Ce fragment d’ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien ? Justifiez. 5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un

épissage alternatif excluant l’exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit?

Pour vous faciliter la tâche voici (figure 1) le code International Union of Pure

and Applied Chemistry (IUPAC; 1970).

Comme la mémoire fait parfois défaut et qu’en sus il s’agit d’une question de 1ier BAC Ulg (cours de M. Thiry): Travail de groupe (3-4) & « Consultation autorisée ».

Vous avez 15 minutes à partir de maintenant!

L ’un de ces deux brins code pour un petit peptide.

Source: New England Biolabs

Figure 1

?

ADN, ARN & Protéines: Evaluation des Connaissances (1a)

4

5’- AAGCGGCTACaatgccgcTCGCCTATgccaccccgtGCCCCGCCTAGccgctaaGGGATT -3’

3’- TTCGCCGATGttacggcgAGCGGATAcggtggggcaCGGGGCGGATCggcgattCCCTAA -5’

5’- TCAGCTAGCGGATTAAGCATAT -3’

3’- AGTCGATCGCCTAATTCGTATA -5’

Soit le fragment d’ADN ci-dessous où les bases soulignées représentent des sites potentiels d’initiation de la transcription et où les bases en minuscule représentent des introns.

1. Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse. 2. Ecrivez la séquence de l'ARNm, telle qu’elle se présente dans le cytoplasme. 3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction. 4. Ce fragment d’ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien ? Justifiez. 5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un épissage alternatif excluant l’exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit?

Comme la mémoire fait parfois défaut et qu’en sus il s’agit d’une question de 1ier BAC Ulg (cours de M. Thiry): Travail de groupe (3-4) & « Consultation autorisée ».

L ’un de ces deux brins code pour un petit peptide.

ADN, ARN & Protéines: Evaluation des Connaissances (1b)

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5’-AAGCGGCTACTCGCCTATGCCCCGCCTAGGGGATTTCAGCTAGCGGATTAAGCATAT-3’

3’-TTCGCCGATGAGCGGATACGGGGCGGATCCCCTAAAGTCGATCGCCTAATTCGTATA-5’

1. Identifiez le brin sens. Justifiez votre réponse.

On « oublie » les introns (minuscules car ils vont disparaitre lors de la maturation de l’ARNm) ET ce qui est en amont (coté 5’) du site d’initiation de la transcription (tout simplement parce que cela ne fera pas partie de l’ARNm primaire = « Transcrit »). On démarre en 5’ au site d’initiation et on cherche un ATG (le premier) et ensuite le premier codon STOP en phase. Ce qui donne donc (couleurs pour faciliter la visualisation):

Réponse: C’est le brin du haut le seul à posséder la séquence 5’-ATG … - 3’ Remarque: En pratique on prend le premier ATG qu’on trouve après le site d’initiation de la transcription. Mais la « Nature » est la championne du monde pour nous réserver des surprises! Et on ne trouve pas toujours un codon Stop car la séquence communiquée peut-être incomplète ou/et incorrecte (ou l’on trouve un faux codon Stop)

Attention: Il s’agit d’une ARN (T / U) et dans le cytoplasme = après maturation! • Splicing (épissage) des introns (voir point 1) • Coiffe (7méthylGuanosine) et queue poly A (stabilité du ARNm) au signal de

polyadénylation (AAUAAA mais variantes…)

2. Ecrivez la séquence de l'ARNm, telle qu’elle se présente dans le cytoplasme.

3. Donnez la séquence en acides aminés du polypeptide obtenu après traduction.

Exons/Introns… Uniquement (presque) chez les Eukaryotes!

5. Lorsque les cellules contenant ce gène sont soumises à un choc thermique, un épissage alternatif excluant l’exon 3 se produit. Quelle répercussion cela aura-t-il sur le peptide produit?

4. Ce fragment d’ADN pourrait-il correspondre à un gène bactérien ? Justifiez.

Introduction à la « biologie moléculaire »: La Transgénèse (exemple E.coli)

6

Source: http://georges.dolisi.free.fr/Microbio/Genie_gen.htm

Résultat: La bactérie synthétise la protéine humaine grâce au transgène présent dans son ADN recombiné.

Questions: Comment? Quelles méthodes utilise-t-on?

Remarque importante à propos du transgène…

Il ne doit pas contenir d’introns mais uniquement la séquence codante de l’ATG (Méthionine) au codon STOP car la bactérie ne fait pas d’épissage, n’utilise pas

le promoteur Eucaryote ni la « queue PolyA+ »

Figure 2

?

http://georges.dolisi.free.fr/Microbio/Genie_gen.htm



La PCR (Polymerase Chain Reaction) (1/6)

7

Travail de groupe (3-4) Visionnez attentivement la video (prenez des notes). Puis répondez aux questions qui suivent. Vocabulaire (Anglais vs. Français) Sample Echantillon Small Petit Target Cible Single Unique Primer Amorce Fingerprinting Empreinte DNA ADN Involving Impliquant Amount Quantité Carry out Réaliser, générer, créer Polimerase Polymerase (erreur) Annealing Appariemment Length Longueur (taille en bp)

https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo




8

L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR est l'abréviation anglaise de Polymerase Chain Reaction) est une méthode de biologie moléculaire d'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique (séquence spécifique d’ADN (l’Amplicon)) et d'amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides). On peut ainsi, par exemple, détecter la présence du virus VIH ou de mesurer une charge virale (concentration du virus dans le plasma), des traces d'OGM (organismes génétiquement modifiés), ou encore des virus d'hépatites B, C et D. De plus en plus utilisée en criminalistique, cette technique se fonde sur la combinaison de deux facteurs : 1. Les propriétés de synthèse enzymatique et d’initiation spécifique à l'ADN

double brins spécifique des ADN polymérases dépendantes à l'ADN thermostables.

2. Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température.

Ces éléments permettent de contrôler l’activité enzymatique grâce à des transitions de température (assurées par un thermocycleur) répétées de manière cyclique (cf. réaction en chaîne). Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes (créées par construction génétique) , ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles… La figure 3 page suivante schématise le processus de PCR. Et ci-dessous les liens vers les 2 videos sur la PCR.


https://www.youtube.com/watch?v=jFl6HmcGw9Q






9

L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Figure 3

Source:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/87/PCR.svg


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Travail de groupe (3-4). Visionnez attentivement la video (prenez des notes). Puis essayez de répondre aux questions. Vocabulaire (Anglais vs. Français) Sample Echantillon Small Petit Target Cible Single Unique Primer Amorce Fingerprinting Empreinte DNA ADN Involving Impliquant Amount Quantité Carry out Réaliser, générer, créer Polimerase Polymerase (erreur) Annealing Appariement Length Longueur (taille en bp)


Questions. Un chercheur de chez Janssen Diagnostics (JnJ) a isolé l’ARN du virus VIH (rétrovirus, SIDA) à partir d’un échantillon de sang d’un patient. Il en a fait une copie ADN double-brin (partielle; la région codant pour la Protéase du virus) en utilisant une Reverse Transcriptase. Avant de procéder au séquençage (double brin) de ce fragment, il doit l’amplifier par PCR. Il sait que le VIH est un virus qui a la particularité de modifier (mutations) très fortement la séquence codante pour la protéase (soulignée) mais par contre pas les régions en amont et en aval de celle-ci. Aidez-le à faire le « design » de 2 amorces pour amplifier l’entièreté de la région codante de la Protéase sur base de la séquence nucléotidique (brin codant 5’ vers 3’) ci-dessous en sachant que : 1. La taille minimale d’une amorce doit être de 18 nucléotides 2. Il est préférable que l’amorce se termine en 3’ par un G ou un C 3. En première approximation la température d’appariement (mT°) doit être au minimum

de 54°C et que les 2 les amorces doivent avoir approximativement (+/- 2°C) les mêmes mT°. Formule de Wallace pour le calcul: mT° = 4 x Σ GC + 2 x Σ AT (en °C)

http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/asearch/query_one.comp?se_id=K03455 Séquence du variant HXB2, le VIH utilisé comme référence pour l’analyse des séquences VIH.



http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/asearch/query_one.comp?se_id=K03455

http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/asearch/query_one.comp?se_id=K03455


11

…

2161 ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag

2221 ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc

2281 tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg

2341 atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa

2401 ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata

2461 aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt

2521 tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa

2581 aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa

…

La région en rouge (soulignée dans l’énoncé) est celle dont le chercheur souhaite (au final) obtenir la séquence nucléotidique. Toutes les amorces doivent donc être choisies en amont et en aval. Oublions le séquençage et la RT-PCR, concentrons-nous sur l’amplification! Amont:

5’ccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctca 3’

5’gaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttC 3’

422442442444422242422442242422244222224224 Wallace mT°

98877776666555444433332211111000 Cumulative mT°

06286428620540862064206208642864

444333333333322222222221111111111000000000 Position from 3’

210987654321098765432109876543210987654321

Aval (séquence complémentaire réécrite 5’ vers 3’!!!):

5’ttttttcttctgtcaatggccattgtttaacttttgggccatccattcct 3’

5’ggctttaattttactggtacagtctcaatagggctaatggG 3’

44422222222224244224242424222244442222444 Wallace mT°

9888877766665554444333222111100 Cumulative mT°

0864084086206408420862840864284

44333333333322222222221111111111000000000 Position from 3’

10987654321098765432109876543210987654321

2 amorces utilisables (mT° = 68°C) en PCR pourraient être:

Amont: 5’ caaggaactgtatcctttaacttC 3’ (24 mer)

Aval: 5’ acagtctcaatagggctaatggG 3’ (23 mer)


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L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Source:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/87/PCR.svg


Real live lab practice



Laboratoire de Transformation Bactérienne et Electrophorèse d’ADN en gel d’agarose. (1/9)

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La technique de l'électrophorèse en gel d'agarose est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

L’électrophorèse d’ADN en gel d’agarose

Un plasmide une molécule d'ADN surnuméraire distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule. Ils sont généralement circulaires et de petites taille. On les retrouvent essentiellement chez les bactéries. Ils sont énormément utilisés en biologie Moléculaire « comme des outils ».

Une enzyme de restriction est une protéine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique.

On peut donc l’utiliser pour caractériser par exemple un produit de PCR: Voir s’il à bien la taille attendue, si la PCR n’a pas amplifié d’autres fragments…

Dans notre expérience nous allons l’utiliser pour caractériser d’autres ADN Mais pour bien comprendre il faut quelques infos supplémentaires

1. Les Enzymes de Restriction

5’ ACGTCGT G AATTC CGTCTC 3’ 3’ TGCAGCA CTTAA G GCAGAG 5’

5’ ACGTCGTG 3’ 3’ TGCAGCACTTAA 5’

5’ AATTCCGTCTC 3’ 3’ GGCAGAG 5’ +

L’enzyme EcoRI reconnait la séquence 5’ GAATTC 3’ (vert) dans l’ADN et coupe à celui-ci à un endroit et d’une façon spécifiques (rouge)

2. Les Plasmides


21

L’électrophorèse d’ADN en gel d’agarose

Un chercheur souhaitant vérifier les caractéristiques / la structure d’un plasmide d’un point de vue présence de sites de restrictions, à réalisé les digestions de restriction suivantes (ER/quantité d’ADN): • Digestion de 200 ng du plasmide par XbaI • Digestion de 1400 ng du plasmide par EcoRI • Digestion de 280 ng du plasmide par BamHI • Digestion de 280 ng du plasmide par HindIII • Digestion de 280 ng du plasmide XhoI Les digestions de restriction ont toutes été réalisées dans un volume final de 20 µl et incubées 1 heure à 37C°. Placées ensuite sur glace (2 min.), 2 µl de « loading buffer » ont été ajoutés et la moitié du volume de chaque digestion a été déposée sur gel d’agarose 1% 1x Tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) pour électrophorèse (100volt pendant 30 minutes en tampon TBE 1x additionné de BrEt = Bromure d’Ethidium). En parallèle notre chercheur à déposé comme référence 5 µl d’un « marqueur de poids moléculaire d’ADN « (acheté dans le commerce ). L’appareil à UltraViolet étant en panne, le gel à été ensuite coloré au Bleu de Méthylène puis décoloré pour visualiser l’ADN. Ce même chercheur disposant encore de quelques puits sur son gel et ayant reçu une demande d’identification de paternité pour la famille X (Père, Mère, Fille, Fils) à réalisé une digestion de restriction sur 500 ng des produits de PCR de chacun des membres de la famille (protocole identique). A noter: Solutions d’Enzymes de restriction à 10 unités par µl Solution de plasmide à 600 ng/µl Tampons des Enzymes de restriction 10x concentrés Eau dés ionisée/distillée Loading Buffer 10x (contenant du BrEt)

Analyse des résultats expérimentaux Transformation Bactérienne

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Protocole expérimental

Etudiants

Profs

E

Prepare Material, Solutions, Plates, etc.

Comment interprétez-vous ses résultats expérimentaux?


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Paramètres Expérimentaux ?

1. Milieu de culture (boîtes)

2. Ce que l’on dépose sur le milieu de culture.

Variabilité (« Variables »)

(LB) (LB) Ampicilline

(LB) Ampicilline +

Arabinose

(Bactéries) Sans pGLO

(Bactéries) Avec pGLO

Rien AMP ARA AMP ARA

Sans pGLO

Avec pGLO

2 « Variables » présentes ou absentes 00 / 10 / 01 / 11

1 « Variable » présente ou absente 0 / 1

Si l’on souhaite tester toutes les possibilités:


Sans pGLO

Avec pGLO

Résultats Expérimentaux ?

Conclusions ?

L’Ampicilline (antibiotique) tue les bactéries qui n’ont pas incorporé le plasmide mais la présence d’Arabinose (sucre) ne change rien

Bien que… Quand on ne teste pas toutes les possibilités…

Question: Pourquoi tester l’Arabinose ?

Prenez les torches à ultra-violets…


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Paramètres Expérimentaux ?

Nous devons inclure une propriété nouvelle liée au pGLO: La Fluorescence

Résultats Expérimentaux ?

Conclusions ?

L’Ampicilline (antibiotique) tue les bactéries qui n’ont pas incorporé le plasmide et celles qui ont incorporé le plasmide sont capables

d’émettre de la Fluorescence en présence d’Arabinose.

Question: Si l’on voit bien la raison de l’utilisation de l’Ampicilline (sélection des bactéries avec ou sans le plasmide), par contre pour

l’Arabinose cela est plus obscur.


Sans pGLO

Avec pGLO

Sans Fluo

Avec Fluo

Il est donc grand temps de nous pencher sur quelques notions supplémentaires qui vous aideront à comprendre…

Les enzymes de restriction Le clonage

La structure et le fonctionnement du pGLO ET ses utilisations.

La Transfection et les OGM Organismes Génétiquement Modifiés La thérapie virale

Et nous termineront par le séquençage de l’ADN Mais auparavant passons quelques minutes sur l’analyse de

l’expérience d’électrophorèse d’ADN en gel d’agarose

Analyse des résultats expérimentaux Electrophorèse d’ADN en gel d’agarose

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Ce qu’il faut savoir avant d’analyser les résultats

L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines. Elle est basée sur le fait que des molécules chargées vont sous l’effet d’un champ électrique traverser une matrice d’agarose (ou d’autres types; ex. polyacrylamide) à des vitesses différentes dépendant de leur taille de leur charge et de leur forme.

Pour les acides nucléiques de structure et composition très similaires, chargés négativement de manière uniforme, la séparation s'effectue principalement sur base de la taille : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

Source: www.genethon.fr

L’expérience réalisée (démonstration) dans notre laboratoire est décrite page 21


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Résultats Expérimentaux

Légende: Puits 1 et 7: Marqueur de poids moléculaire: Tailles (Kb): 0,2/0,4/0,6/0,8/1,0/1,5/2,0/2,5/3,0/4,0/5,0/6,0/8,0/10,0 Puits 2: Plasmide digéré par XbaI Puits 3: Plasmide digéré par EcoRI Puits 4: Plasmide digéré par HindIII Puits 5: Plasmide digéré par BamHI Puits 6: Plasmide digéré par XhoI Puits 8: Produit de PCR de la mère digéré par NgyxI Puits 9: Produit de PCR du père digéré par NgyxI Puits 10: Produit de PCR du fils digéré par NgyxI Puits 11: Produit de PCR de la fille digéré par NgyxI

Rappel / Info. Des fragments d’ADN différents mais ayant des tailles identiques migreront conjointement (traverseront le gel à la même vitesse). Le produit de PCR amplifié a une taille de 7,0 Kb. Pour rappel le génome de l’homme est diploïde.

1 3 4 5 6 7 8 9 10 2 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

10000 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

8000 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

7000 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0

6000 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

5000 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1

4000 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1

3000 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0

2500 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0

2000 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1

1750 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1

1500 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0

1250 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1

1000 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

800 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

600 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

500 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

400 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

300 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

250 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

200 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

150 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

25 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

14 1 12 3 3 2 14 4 5 3 5

Taill

es

ob

serv

ée

s (e

n b

p)

Nombre de tailles différentes observées

Puits sur le gel Puits sur le gel

Tableau récapitulatif

E.R. Nombre Somme Tailles

XbaI 1 7000EcoRI 12 ? 4375

HindIII 3 7000

BamHI 3 7000

XhoI 2 7000


27

Analyse de Résultats Expérimentaux

1. Le Plasmide. Le chercheur souhaitait déterminer le nombre de sites de restriction pour chacune des enzymes de restriction utilisée et vérifier la taille du plasmide. Pouvez vous l’aider?

A. Nombre de sites de restriction

E.R. Nombre Somme Tailles

XbaI

EcoRI

HindIII

BamHI

XhoI

Des fragments de même taille se chevauchent! Donc plus de 12 en réalité!

EcoRI ???

B. Taille du Plasmide? 7000 bp = 7,0 Kbp

2. Le test de paternité à partir du produit de PCR digéré par l’enzyme de restriction NgyxI. Le chercheur doit répondre à la question de savoir si les enfants sont bien issus des mêmes père et mère. Qu’en pensez-vous?

Visualisons (mère):

1 Produit de PCR

2 Allèles 2 Produits

de PCR

Des fragments de Restrictions différents

A vous de jouer, vous avez tout le WE pour y penser…


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Une enzyme de restriction est une protéine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique.

1. Les Enzymes de Restriction

5’ ACGTCGT G AATTC CGTCTC 3’ 3’ TGCAGCA CTTAA G GCAGAG 5’

5’ ACGTCGTG 3’ 3’ TGCAGCACTTAA 5’

5’ AATTCCGTCTC 3’ 3’ GGCAGAG 5’ +

L’enzyme EcoRI reconnait la séquence 5’ GAATTC 3’ (vert) dans l’ADN et coupe à celui-ci à un endroit et d’une façon spécifiques (rouge)

http://www.dil.univ-mrs.fr/

Le plasmide se referme sur lui-même

sans incorporer le fragment

Le fragment se referme sur lui-même

Utilisation très, très fréquente: le Clonage dans un plasmide


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Le plasmide pGLO: structure, fonctionnalités et utilisations.

Transfection?

MCS

1

Origine de réplication du plasmide. Nécessaire pour permettre aux plasmides de se multiplier au sein de la bactérie hôte. 1

2

Gène codant pour la β-lactamase conférant la résistance à l’Ampicilline. Sélection des bactéries transformées. 2

3

Opéron Arabinose. En présence d’Arabinose il active le promoteur Pbad via un mécanisme assez complexe. 3

4

Promoteur Pbad. Un élément qui régule la transcription d’un gène situé généralement en aval (3’) et donc l’expression de ce gène (ex. protéine). 4

5

Gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP). Gène « rapporteur » permettant de visualise et/ou mesurer l'expression d'un gène d'intérêt (par exemple si le gène d’intérêt est fusionné au gène GFP)

5

6

Multiple Cloning Site. Courte région de l’ADN où l’on retrouve des (souvent 10 à 20) sites reconnus par des enzymes de restriction. Ces sites sont généralement uniques sur le plasmide et facilitent donc le clonage. Ici, situé juste en aval du gène GFP , il permet éventuellement de fusionner un gène d’intérêt à la GFP.

6

Correspond à la transformation bactérienne . C’est un transfert de gènes, c'est-à-dire l'introduction d'ADN exogène dans des cellules eucaryotes (non médié par un virus…Thérapie virale).. Le pGLO est un vecteur qui a été utilisé dans de nombreuses expériences de transfection pour par exemple créer des OGM (et la GFP permettait de visualiser le succès de la transfection). Exemple pGLO bien connu: Le Lapin Fluo « Alba »

Biologie Moléculaire & Génie Génétique

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