Biologie de la réparation de l'os et du cartilage ... · Médecine régénératrice La médecine...

Cellules souches mésenchymateuses et thérapie cellulaire du cartilage

Marie Maumus

IRMB - Inserm U1183, Equipe 1, Montpellier, France

DU Médecine Régénératrice – Montpellier – 26/11/2015

Médecine régénératrice

La médecine régénératrice est une stratégie thérapeutique visant à réparer, renouveler, restaurer ou régénérer des cellules, un tissu ou un organe malade grâce à des cellules souches qui vont se différencier ou qui vont induire une réponse adaptative de l’organisme.

Médecine régénératrice

Maladies cardiovasculaires

Maladies neurodégénératrices

Maladies musculaires

Hématologie

Peau

Cancers

Rétine - Cornée

Maladies autoimmunes

Maladies Ostéo-articulaires

Pancréas

Foie

Réparer Renouveler Restaurer Régénérer

La base de cette médecine est la thérapie cellulaire → intérêt des cellules souches.

Cellules souches

Une cellule souche est une cellule indifférenciée.

Qu’est-ce qu’une cellule souche?

Son auto-renouvellement qui est la capacité pour une cellule de proliférer indéfiniment tout en maintenant un état indifférencié.

Ses potentialités de différenciation qui sont les capacités pour une cellule de se différencier en un ou plusieurs types de cellules matures.

totipotence pluripotence multipotence unipotence progéniteur cellule

différenciée

Potentialités

Capacités d’auto-renouvellement

Spécialisation

Les différents types de cellules souches

Les cellules souches adultes

Renouvellement tissulaire

L’œuf fécondé = zygote

2 grands types de cellules souches

Embryon Annexes extra-embryonnaires

Thérapie cellulaire

Cellules totipotentes - Cellules rares, localisées dans certains organes

- Cellules multi- ou uni-potentes

Cellules souches embryonniques (ES) Pluripotentes

Cellules souches pluripotentes induites (iPS)

Renouvellement tissulaire en conditions physiologiques

En situation physiologique: - Un corps humain perd plus de 20 milliards de cellules par jour

Fuchs E, 2009

Épiderme - Poil/cheveux Barker N, 2008

Cellules souches de l’épiderme et du follicule pileux

Épithélium intestinal Watt FM, 2002

Cellules souches intestinales

Orkin SH and Zon LI, 2008 Cellules sanguines – Moelle osseuse

Cellules souches hématopoïétiques

- Certains organes se renouvellent peu ou pas

- D’autres sont en renouvellement constant

Cœur

Cerveau

Reins

Et le cartilage articulaire ???

Le cartilage articulaire - structure

Fin des os longs

Zone calcifiée (5-10%)

Zone superficielle (5-10%)

Zone moyenne (40-60%)

Zone profonde (30-40%)

Os souschondral

Cellularité Protéoglycans Collagène

Collagène type II

Comp

Intégrine

Fibronectine

Aggrecan

Hyaluronane

Link

Chondrocyte

Aspect morphologique du cartilage

Chondrocytes: cellules matures, différenciées, capacité limitée de proliférer (cellules quiescentes)

Différents types de lésions du cartilage

Défauts focaux

Essentiellement post-traumatiques - 20% de toutes les procédures

arthroscopiques (genou: 5-10% de patients jeunes et

plus de 60% de patients vieux)

Zones larges

Associées avec les maladies rhumastismales - Arthrite rhumatoïde:

0,3% de la population totale - Arthrose: 35% des femmes et

20% des hommes au dessus de 65 ans

Peu ou pas de réparation tissulaire par les chondrocytes et/ou les cellules souches endogènes → intérêt de l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses en médecine régénératrice du cartilage !

Caractéristiques des MSCs Différentes sources

Propriétés

- Adhérentes au plastique

Les cellules souches mésenchymateuses = MSC Caractéristiques

CD34 CD106

CD90

HLA-DR

CD105

CD14 CD45

Counts

CD31

CD73 CD13

CD11b

Counts

C

ou

nts

Counts

C

ou

nts

Counts

Counts

C

ou

nts

C

ounts

Counts

C

ou

nts

- CD73+, CD90+, CD105+, (CD13+) - CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45-, HLA-DR-, (CD31-, CD106-)

- Capacités de différenciation en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes

Adipocyte Ostéoblaste

Chondrocyte

- Immunophénotype

Cellule

endothéliale

Neurone

Myocyte

Cardiomyocyte

Hépatocyte Cellule

produisant

de l’insuline

Anti-apoptotic effects

VEGF, HGF, IGF-1, TGF-β, bFGF, GM-CSF, IL-6

MSC

Anti-bacterial effects

LL37

Angiogenic effects VEGF-A, VEGF-D, HGF, Ang-1, bFGF, IGF-1, PDGF, PIGF, IL6, EPO, MCP-1

Neuroprotective effects

BDNF, NGF, GDNF, galectin-1

Hematopoietic stem cell supportive effects TPO, SCF, TGFβ, M-CSF, LIF,

Ang-1, SDF-1

Proliferative effects

KGF, FGF-2, VEGF, IGF, PDGF, HGF

Anti-fibrotic effects

MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, HGF, bFGF, Ang-1, KGF

Chemoattractive effects

SDF-1, HGF, LIF, IGF, G-CSF, M-CSF, VEGF, CCL-2, -3, -4, -5, -6, -20, CXCL-

2,-3, -5,-8,-10 -11

Immunomodulation

IDO, PGE2, TGF-β, TSG-6, HGF, LIF, NO, HO-1, HLA-G, IL-6

Fonctions paracrines des MSC

Les MSCs sont facilement isolables et peuvent être produits en grandes quantités in vitro et de facon GMP

Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des MSC

Kobolak J et al, Methods, 2015

Tissus adultes

Tissus fétaux

Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des ASC in vivo

Lectine/CD34/Noyau

Immunohistochimie sur TA humain

NG2/CD34/Noyau

CD140b/CD34 /Noyau

Les ASC périvasculaires sont différentes des péricytes.

Localisation stromale et périvasculaire des ASC

Lectine: marqueur des cellules endothéliales CD140b (PDGF-R): marqueur des péricytes NG2 (chondroitin sulfate proteoglycan) : marqueur des péricytes

Péricytes?

Différentes sources de MSC

Tissus adultes (BM-MSC, ASC)

- Grandes quantités

- Peu invasif - Utilisation autologue

- Déjà utilisées dans de nombreux essais cliniques

- Différenciation A/O/C

- Cellules immunomodulatrices

Tissus fétaux (A-MSC, C-MSC, UC-MSC, WJ-MSC)

- Grandes quantités

- Pas invasif - Fort taux de prolifération

- Faible sénéscence - Utilisation allogénique

- Plus de potentiels de différenciation

(lignages neuronal, pancreatique) - Cellules immunomodulatrices

MSC

Application à l’arthrose

Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux

Chondrocyte MSC

Capacités de différenciation

Fonctions immunorégulatrices

Synovial Fibroblaste

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Synoviocytes

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

Formation

d’osteophytes

Dégradation

du cartilage

Application à la polyarthrite rhumatoïde

Contrer l’inflammation

Thérapies cellulaires anti-inflammatoire

Chondroprotection et stimulation de la réparation

endogène

Fonctions trophiques

Différenciation en chondrocytes sur

biomatériaux

Applications cliniques des MSC en rhumatologie

MSC



Chondrocyte MSC




IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Synoviocytes

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

Formation

d’osteophytes

Dégradation

du cartilage




Médecine régénératrice des défauts focaux du cartilage


endogène



biomatériaux

Traitements pour les défauts focaux

Microfracture Mosaicplastie ou Greffes osteo-

chondrales

ACI: autologous chondrocyte implantation MACI: matrix-induced chondrocyte implantation

Faible intégration

Mortalité au site donneur

Limité aux petits défauts

Formation

d’osteophytes et fibrocartilage dans

la lésions

Mortalité au site donneur

Hypertrophie Du périoste

Résultats: ACI = microfracture > mosaicplaty

Mais quelques limitations

- Nouvelles approches pour l’ingénierie tissulaire - Nouvelles sources cellulaires

Traitements pour les défauts focaux

MSCs pour le traitement des défauts focaux

Faisabilité de l’implantation de BM-MSC authologues pour les maladies orthopédiques

- 1998: premier essai clinique utilisant les BM-MSCs dans 2 reports de cas (Wakitani S et al, 2004)

Amélioration importante des symptômes cliniques (douleur, marche…) mais fibrocartilage

- 2002: 24 patients avec OA du genou ont reçu des BM-MSCs dans des éponges de collagène sous un lambeau de périoste

Wakitani et al, Osteoarthr. Cart. 2002

Intérêt de l’utilisation des MSCs pour la réparation du cartilage !

Pas d’amélioration significative comparé au groupe collagène/périoste.

Meilleur score arthrospique et histologique dans le groupe traité avec les MSC avec un grand contenu en cartilage hyalin dans les biopsies 10 mois après l’implantation.

Col I Col II

Col X PG

Efficacité des BM-MSCs comparée à l’implantation des chondrocytes autologues?

- MSCs sont aussi efficaces que les chondrocytes pour la réparation (n=36) - amélioration de la qualité de vie des patients et de leurs activités dans la vie courante et sportives - formation de cartilage hyalin (1an) - l’implantation des chondrocyte est meilleure pour les patients <45 ans et pas de différences en rapport avec l’age pour le groupe MSC

Nejadnik et al, Am J. Sports Med, 2010

Les MSCs peuvent être utilisées comme une alternative aux chondrocytes pour la réparation du cartilage - couts réduits, - une opération en moins, - minimiser la morbidité au niveau du site donneur


- Sécurité des implantation de BM-MSC autologues pour les maladies orthopédiques?

- 2005-2009: 10 ± 7 mois de suivi pour 227 patients traités pour différentes conditions orthopédiques.

(Centeno et al, Curr Stem Cell Res Ther 2010) Pas de tumeur au site d’implantation - 1998-2009: 5 mois à 11 ans de suivi de 41 patients ayant reçu

une transplantation de BM-MSC (Wakitani et al, J Tissue Eng Regen Med 2010)

Pas de tumeur ni d’infection enregistré

Sécurité des MSC en thérapie?

“If the cells are harvested for therapy well before the cultures reach senescence, there is a very low probability of malignant transformation and tumor formation in patients”

(Prockop et al, Cytotherapy september 2010)


Combinaison optimale des 3 composants indispensables:

Signaux inducteurs (facteurs de croissance)

Mesenchymal Stem Cell

Biomatériaux (synthétique or

naturel)

MSCs pour l’ingénierie du cartilage

H2O

H2O

PAMs (Pharmacological active microcarriers) pour la libération prolongée de TGF-b3 pour la différenciation de MSC

Collagen II Aggrecan

Aggrecan Collagen II

Bouffi et al, Biomaterials, 2010

d21 d21

h1 d1 d7

Implantation sous-cutanée des TGF-β3-PAMs in vivo

Cu

mu

lative

rele

ase (

µg/m

l)

0

1

2

3

4

0 4 8 12 16 24 32

Day

released functional

d20

MSCs pour l’ingénierie du cartilage

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40

Cu

mu

late

d r

ele

ase

of

TGFβ

3 (

%)

Time (days)

Augmentation significative du relargage: 3 X TGFβ3 bioactif

X3

P188 1:10 PLGA

P188 1:20 PLGA-P188-PLGA

P188 1:10 PLGA-P188-PLGA

Protein:additive polymer ratio

Total protein Bioactive protein

H2OH2O

Optimisation du relargage du TGFβ3

PAMs pour l’ingénierie du cartilage

Adhérence à 4h Survie à 24h Prolifération à 7 jours

0

100

200

300

400

500

600

Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGAPAMs

Cel

l nu

mb

er (

%)

24h

7days

** *

H2OH2O

Adhésion et meilleure prolifération

A B

DC

E

F

Zeta potential (mV)

PLGA MS -8.1 ± 1.6

PLGA PAMs +15.4 ± 0.3

PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3

PLGA-P188-PLGA PAMs +7.9 ± 0.8

A B

DC

E

F

Zeta potential (mV)

PLGA MS -8.1 ± 1.6

PLGA PAMs +15.4 ± 0.3

PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3

PLGA-P188-PLGA PAMs +7.9 ± 0.8

MAB IF anti-FN 0

100

200

300

400

500

600

Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs

Cel

l su

rviv

al (%

)

24h 48h 7days

**24h

48h

7days

50 µm 50 µm

100µm 100µm

25µm 25µm

A. B.

*

PLGA PAMs

PLGA-P188-PLGAPAMs

0

100

200

300

400

500

600

Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs

Cel

l su

rviv

al (%

)

24h 48h 7days

**24h

48h

7days

50 µm 50 µm

100µm 100µm

25µm 25µm

A. B.

*

PLGA PAMs

PLGA-P188-PLGAPAMs

48h Day 7


TGFβ3-PLGA PAMs

TGFβ3-PLGA-P188-PLGA PAMs

PLGA-P188-PLGA PAMs

Augmentation de la formation de

matrice avec la nouvelle formulation

H2OH2O

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

D0 TGF-β3 PLGA PAMs

NewPAMs

TGF-β3 New

PAMs

0

20000

40000

60000

80000

100000


NewPAMs

TGF-β3 New

PAMs

0

500

1000

1500

2000

2500


NewPAMs

TGF-β3 New

PAMs

**

Collagen II Aggrecan Collagen X

New PAMs

PLGA PAMs

Fo

ld in

cre

ase

** **

Différenciation in vitro (jour 21)

Morille et al., J. Control Release, 2013


H2OH2O

Formation de cartilage in vivo

Injection intra-articular

de collagenase

d0 d2 d42

Sacrifice

d10

TGFβ3

Injection PAM/MSC

Histological scoring 3D imaging of cartilage


H2OH2O

Imagerie 3D du cartilage (CLSM)

Evaluation quantitative de la structure 3D du cartilage grâce à la propiété d’autofluorescence du tissu (le volume 3D est recontruit à partir de l’empilement des images 2D)

Echantillon

CLSM CLSM

1er scan

(coupe)

CLSM

3ème scan

(coupe)

CLSM CLSM

Lateral plateau Median plateau Tibial plateaux

Stok K. and Müller R. Microscopy research and technique 2009


H2OH2O

Imagerie 3D du cartilage (CLSM)

*

*

median lateral Tibial plateau

colla

gena

se

PAM

PA

M/T

GF

β3

Les paramêtres du cartilage indiquent une meilleure intégrité tissulaire.


Morille M et al. En Préparation

MSC



Chondrocyte MSC




IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Synoviocytes

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

Formation

d’osteophytes

Dégradation

du cartilage




Médecine régénératrice des maladies auto-inflammatoires: application à l’arthrite


endogène



biomatériaux

0

40

80

120

MSC:responder ratio

1:1 1:10 1:100 0:1

Rela

tive p

rolif

era

tive

respon

se (

% ±

SD

)

Djouad et al., Blood 2003

0

20

40

60

80

100

120

140

allo MSC MSC + transwell

Pro

lifera

tion

(%

± S

D)

L’effet immunosuppresseur des MSC est dose-dépendant et passe par des facteurs solubles.

Effet immunosuppresseur des MSC

Facteurs solubles impliqués dans l’effet immunosuppresseur des MSCs

Djouad et al, Nat Rev Rheum 2009

IDO

iNOS

Inhibition de la

différenciation et de

la maturation

Fonction de présentation des

Ag diminuée

Inhibition de la prolifération et

des fonctions cytotoxiques

Inhibition de la prolifération

& fonction des CD8 cytotoxic

Prolifération et fonction

Inhibition de la prolifération

et différenciation des

cellules sécrétrices

d’anticorps

Tyndall A et al, Immunology letters, 2015

Effets immunosuppresseurs des MSCs

Intérêt de l’utilisation des MSC dans les maladies autoimmunes

(© 2001 Terese Winslow)

Inflammation tissulaire - douleur

Destruction tissu-specifique - chondrocytes dans la RA - cellules pancreatiques β dans le diabetes - cellules rénales dans le lupus

Différents traitements: - anti-inflammatoire (methotrexate) - agents immunosuppresseurs (steroids) - biotherapies (anti-TNF,…) Mais: résistance, pas d’amélioration

Perte de tolérance

Activation des lymphocytes T CD4

Prolifération et activation des lymphocytes T CD8 et

Lymphocytes B

Destruction des tissus

L’arthrite: maladie inflammatoire chronique, auto-immune, d’origine multifactorielle (génétique et/ou environnementale), caractérisée par une destruction progressive des articulations

Traitement médicaux: - anti-douleurs: soulager les douleurs inflammatoires (paracétamol, anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou encore corticoïdes) - immunosuppresseurs: réduisent la réponse immunitaire locale responsable de l’inflammation (méthotrexate: traitement de référence) - biothérapies: immunosuppresseurs spécifiques (anticorps ou protéines qui inhibent de manière spécifique une protéine de l’immunité): anti-TNFα (etanercept, infliximab, adalimumab)

La polyarthrite rhumatoïde = PR

Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour diminuer l’inflammation.

- Implication de nombreux types cellulaires (macrophages, lymphocytes B et T, chondrocytes, ostéoclastes et synoviocytes) contribuant à la destruction articulaire. - Activation du système immunitaire, réponses inflammatoires aberrantes, perte de la tolérance avec production d’auto-antigènes

…Mais: résistance, pas d’amélioration

Djouad et al., Arthr. Rheum 2005

** ** Control

4x106 C3-Luc / d0

4x106 C3-Luc / D21

106 C3-Luc / d0

106 C3-Luc / d21

0

0,1

0,2

0,3

0,4

20 25 30 35 40 45 50

Day after immunization

Pa

w s

ww

elli

ng

(m

m)

**

MSC MSC

Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite

modèle préclinique d’arthrite = CIA (Collagen Induced Arthritis)

Il y a une fenètre spécifique d’injection des MSC qui est indépendante de la souche des souris.

Control

d18+d24

d18+d32

d18

Pa

w s

we

llin

g in

cre

ase

(m

m)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

21 26 31 36 41 Day following arthritis induction

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

18 21 24 27 30 33 36 39 42

Day after arthritis induction P

aw

sw

elli

ng

incre

ase (

mm

)

Control

allogeneic MSC

Effet d’une injection de MSC syngenique à distance de l’immunisation ou du boost

* * * * * * *


Days after arthritis induction

Paw

sw

elli

ng incre

ase (

mm

)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

19 21 23 25 27 29 31

Control wt MSC IL6-/- MSC iNOS-/- MSC

Effet des MSC déficientes pour iNOS ou IL-6 dans le modèle d’arthrite (CIA)

% p

rolif

era

tion

0

20

40

60

80

100

ConA wt iNOS-/- IL-6-/-

C57BL/6 MSC

*

*

*

PG

E2 (

pg/m

l)

ConA wt iNOS-/- IL-6-/-

C57BL/6 MSC

10

102

103

104

105

106

1

10

102

103

IL-6

(ng/m

l)

La sécrétion dépendante de l’IL6 inhibe l’inflammation locale dans la CIA.

Bouffi et al., PLoSONE 2010

* *

*


Gonzales et al., Arthr. Rheum. 2009

La tolérance médiée par hASC passe par la génération de lymphocytes T régulateurs.

Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite

Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite

Effet des ASC sur la perte osseuse dans le modèle d’arthrite (CIA)

Garimella MG et al., J Immunol. 2015

Les ASC protègent contre la perte osseuse péri-articulaire et systémique en inhibant l’ostéoclastogenèse.

Ctrl CIA CIA+ASCs

Liu et al., Arthr. Res. Ther. 2010

Xenogeneic human UC-MSCs are efficient in reducing the arthritic symptoms

Effet des UC-MSC dans une modèle préclinique d’arthrite

MSC



Chondrocyte MSC




IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Synoviocytes

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

Formation

d’osteophytes

Dégradation

du cartilage




Médecine régénératrice pour les maladies dégénératrices: application à l’arthrose


endogène



biomatériaux

Arthrose (OA): maladie chronique caractérisée par une destruction lente du cartilage articulaire menant à une invalidité et à une perte de fonction. 16% personnes > 65 ans, affecte environ 4 millions de français

Besoins médicaux non satisfaits: -Absence de traitement efficace. - Les traitements symptomatiques les plus efficaces sont les AINS qui améliorent <50% du score WOMAC

- Nécessité de traitements plus sûrs: les AINS traditionnels donnent des complications gastro-intestinales importantes et les inhibiteurs COX-2 augmentent les risques cardiovasculaires

apoptosis

Cartilage

degenerescence

Osteophyte

formation

fibrosis

Chondrocyte

& Synovial

inflammation

hypertrophy

Arthrose (Osteoarthritis = OA)

Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour la protection du cartilage et sa régénération.

Chondroprotection – données préliminaires

Données pré-cliniques: • OA chez la chèvre

• Résection du ACL + menistectomie

• Injection IA de 107 GFP+ BM-MSC

+ HA à 6 semaines

Recueil des données à 6 et 20 semaines

• Régénération des ménisques pour 4/6 chèvres (moins fibrillation, moins perte PG, meilleure intégrité du cartilage)

• Peu de MSC GFP+ dans le cartilage

6 weeks

Murphy et al., Arthr Rheum 2003

La majorité des effets de l’injection des BM-MSC injection n’est pas due à l’intégration des cellules mais à leur activité trophique (stimulation des précurseurs endogènes)

Effets sur la prolifération des chondrocytes

ASC

0.4 µm transwell membrane

DMEM/

Ascorbic acid/

Proline/

Sodium pyruvate

Assays

Chondrocytes

2 or 7 days

Chondrocytes Chondro+ASC

Cou

nts

Annexin V

Effet anti-apoptotic des

ASCs

Effets sur l’apoptose des chondrocytes %

pro

lifera

tion

0

50

100

150

200

250

Chondro Chondro

+ASC

10%

FCS

*** ***

Pas d’effet sur la proliferation des

chondrocyte

Camptothecin-induced apoptosis

ratio 1:8

Chondroprotection – méchanismes d’action

% o

f an

nexin

V +

cho

ndro

cyte

s

0

10

20

30

40

*

Chondro Chondro

+ ASC

Effets sur le phenotype des chondrocyte

SC Abdo ASC

BM-MSC

Ge

ne

exp

ressio

n

(fo

ld c

ha

nge

)

Agg Col IIB Link Sox9 0

1

2

3

*

*

Ge

ne

exp

ressio

n

(fo

ld c

ha

nge

)

MMP13 AP Col I Col III 0

1

2

3

** ***

***

Ge

ne

exp

ressio

n

(fo

ld c

ha

nge

)

Agg Col IIB Link Sox9 0

1

2

3

Ge

ne

exp

ressio

n

(fo

ld c

ha

nge

)

MMP13 Col X Col I Col III 0

1

2

3

** ** **

Effets anti-fibrotique et anti-hypertrophique des

ASC et MSC


Quantification of secreted factors

No secretion of TNF-α, IL-1β and MMP-9

IL-1

RA

co

ncentr

atio

n

(pg/m

L)

0

25

50

75

100

ND

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

IL-1RA

TIM

P-2

co

ncentr

atio

n

(ng/m

L)

0

10

20

30

40

50

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

TIMP-2 MMP-1

MM

P1

co

ncentr

atio

n

(ng/m

L)

0

500

1000

1500

Ch

alone

ASC

alone

Co-

cultureT

IMP

-1 c

oncentr

atio

n

(ng/m

L)

0

200

400

600

800

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

TIMP-1

TG

F- b

1 c

once

ntr

atio

n (

pg/m

L)

0

200

400

600

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

ND

******

TS

P-1

co

ncentr

atio

n (

pg/m

L)

0

20

40

60

80

100

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

**

TSP-1 TGF-β1


Quantification of HGF secretion

HGF protein quantification HGF mRNA quantification

Induction of HGF secretion by ASCs in co-culture

HG

F c

oncentr

atio

n (

pg/m

L)

0

50

100

150

200

ND

Ch

alone

ASC

alone

Co-

culture

HG

F e

xpre

ssio

n (

2-

CT)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Ch Ch

-co

ASC

*

ASC

-co


Co-culture with a neutralizing anti-HGF antibody

Réversion de l’effet anti-fibrotic des ASC en utilisant un anticorps anti-HGF

Col1 Col3

Col

I ex

pre

ssio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

*

Chondrocytes

ASC

HGF-Ab Isotype control

+ + + + +

+ - - - - + + + - -

+ - - - - rhHGF (50ng/mL) - - - - +

Col

III

expre

ssio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*** *

Chondrocytes

ASC

HGF-Ab Isotype control

+ + + + +

+ - - - - + + + - -

+ - - - - rhHGF (50ng/mL) - - - - +

MMP13 AP

MM

P13 e

xpre

ssio

n

0.0

0.5

1.0

1.5

***

** **

**

Alk

alin

e phosp

hat

ase

0.0

0.5

1.0

1.5

*** *

Maumus M et al., Stem cell research, 2013.


Chondrocyte inflammation Synoviocyte inflammation

Effets sur le phenotype inflammatoire des chondrocytes et synoviocytes

Manferdini C et al., A&R, 2013

Manferdini C et al, Osteoarthritis Cartilage. 2015

Effet anti-inflammatoire des ASCs sur les chondrocytes et synoviocytes


Role des ASCs dans des modèles animaux d’arthrose

ter Huurne M et al., Arthritis Rheum., 2012 Nov. Desando et al. Arthritis Research & Therapy, 2013

Modèle murin Modèle lapin

Protège contre la destruction du cartilage

Diminue la formation d’ostéophyte Diminue l’inflammation de la synoviale

Effets thérapeutiques des ASC dans des modèles d’arthrose chez la souris et le lapin.

4% RSA 2.106 ASC

4% RSA 2.106 ASC

Protège contre la destruction du cartilage

Synovial

Fibroblaste

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, NO

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Synovial

Fibroblaste

IL1b, IL8,

TNF, PGE2, ROS

MMP

ADAMTS

TGFβ

BMP

Chondrocyte

Osteophyte

formation

Degradation

TIMP-1, -2

Inflammation

Immunomodulateur

(IDO, iNOs, PGE2, TSG-6,…)

Anti-apoptotique (HGF, Sfrp1)

Anti-fibrotique

Protecteur

Effets pléiotropiques dans des modèles de maladie dégénératives

Objectif scientifique: Sureté d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou.

Design de l’étude: Etude bicentrique ouverte de phase I

Buts primaires: Sureté et tolérance de l’injection d’ASC

Buts secondaires: Evaluation fonctionnelle et globale (WOMAC, VAS, examen physique)

Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec

une arthrose modérée/sévère du genou

Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage

Nombre de patients: 18 patients (6/dose)

Doses: 2 – 10 – 50 x106 ASC IA

Temps d’évaluation: semaine 2-4-8-12 (bi-annuel/5 ans)

ADIPOA = ADIPose stem cells-based therapy for OA

ADIPOA, essai clinique

> 6 w 0 w 1 w 60 w 12 w

18 Patients (end-stage knee OA)

Primary endpoint: Safety and tolerability Secondary Endpoints: efficacy - Patient global assessment, ROM, laboratory investigations - X-ray/MRI (dGEMRIC-MRI) - WOMAC-, KOOS- VAS- SF36- score - Synovia Analysis

- Immunomonitoring

Harvest of ASCs

2 w

Intraarticular injection of ASCs

4 w

Knee joint replacement

2.106 n = 6

10 .106 n = 6

50 .106 n = 6 Adverse Events (AE, SAE) monitoring

Procédure clinique – injection des cellules souches

ADIPOA, essai clinique - Résultats

Diminution de la douleur et amélioration de la

fonction.

Pas de pose de prothèse (11/12 patients)

Augmentation du contenu en PG et épaisseur du cartilage (3/6 patients)

11/26/2015

CD25hCD127loFoxP3+ in CD4+ CD14++CD16- classical monocytes

0 7 30 90 Controls

0

2

4

6

8

10

Days

* P= 0.0151

** P= 0.0054

ADIPOA, essai clinique - Résultats

Augmentation des lymphocytes T régulateurs

Diminution des monocytes inflammatoires

Pers YM et al., Stem Cells Translational Medicine, en révision.

ADIPOA 2

Objectif scientifique: Efficacité d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou.

Design de l’étude: Etude multicentrique à l’aveugle de phase II (10 centres)

Buts : Efficacité de l’injection d’ASC comparée à un placebo

Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec

une arthrose modérée/sévère du genou

Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage

Nombre de patients: 150 patients (50/dose)

Doses: 2 – 10 x106 ASC IA ou placebo

http://adipoa2.eu/

Remerciements

Inserm U1183 – Equipe 1 Montpellier Biologie de la cellule souche mésenchymateuse et

thérapies du cartilage Christian Jorgensen

Danièle Noël Karine Toupet Marie Maumus Maxime Ruiz Claire Bony

Stella Cosenza Guillaume Fonteneau

Alexandre Maria Philippe Guilpain Yves-Marie Pers

Sanofi-Aventis, Montpellier Gautier Roussignol

Isabelle Bentz Régis Steinberg

Géraldine Penarier

Laboratorio di Immunoreumatologia e Rigenerazione Tissutale, Bologna,

Italy Andrea Facchini

Gina Lisignoli Cristina Manferdini

A. Piacentini Elena Gabusi

Stromalab, Toulouse Louis Casteilla Philippe Bourin Roxane Blattes

Yannick Jeanson Julie-Anne Peyrafite

Cellules souches multipotentes

Cellules souches embryonniques Pluripotentes

(ES)

Cellules souches pluripotentes induites

(iPS)

Cellules spécialisées

Cellules souches totipotentes

Les différents types de cellules souches

Biologie de la réparation de l'os et du cartilage ... · Médecine régénératrice La médecine...

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