Biochimie des Protéines

Licence STS Biologie-Biochimie UEO26 L3

Vincent Vedel

Chap. 5 : Purification des protéines 5.1 Les différentes étapes de la purification 5.2 Planification 5.3 Essai 5.3.1 Critères 5.3.2 Détecter la présence de protéines 5.3.3 Détecter la présence d’une protéine particulière 5.3.4 Essai d’activité enzymatique

5.4 Source de matériel 5.5 Extraction 5.5.1 Généralités 5.5.2 Tampon 5.6 Séparation et enrichissement 5.6.1 Précipitation au sulfate d‘ammonium 5.6.2 Dialyse 5.6.3 Sédimentation 5.6.4 Filtration sur gel 5.6.5 Echanges d’ions 5.6.6 Interactions hydrophobes 5.6.7 Chromatographie d’affinité 5.6.7 HPLC

5.1 Les différentes étapes. Les paramètres

Paramètre Technique

Taille Filtration sur gel

Solubilité Précipitation séquentielle au sulfate d'ammonium

Charge Chromatographie d'échange d'ions

Densité Centrifugation sur gradient; ultracentrifugation

Hydrophobicité Chromatographie en phase inverse

Marqueur ajouté Chromatographie d'affinité

Etape Quantité de votre protéine (unités arbitraires)

Proportion de votre protéine

matériel brut 4000 1 : 2 000 000

1 1000 1: 500 000

2 500 1: 100 000

3 200 1: 1 000

4 10 1: 100

5 5 1: 2

5.1 Les différentes étapes. exemple

5.3 Essais 5.3.1 Les critères

Sensibilité Parce que la protéine risque d'être très diluée à certaines étapes, particulièrement les premières.

Spécificité Nous cherchons une aiguille dans une grosse boîte d'aiguilles, et comme rien ne ressemble plus à l'une d'entre elles que sa voisine, il vaut mieux que nous sachions vraiment reconnaître la nôtre.

Disponibilité des réactifs Si votre protéine n'est qu'un des facteurs impliqués dans une réaction in vitro requérant huit autres protéines purifiées, mieux vaut déjà avoir ces derniers si vous comptez utiliser un essai réactionnel. Sinon, optez pour un essai que vous pouvez vraiment effectuer.

Coût Ce facteur se présente souvent.

Temps requis Plus votre purification est rapide et mieux ce sera. Votre essai devrait donc vous permettre d'obtenir rapidement une idée de ce qui se passe avec votre purification; si vous pouvez l'effectuer à chaque étape PENDANT la purification, encore mieux.

5.3 Essais 5.3.2 Présence de protéines

5.3 Essais 5.3.2 Présence de protéines

5.3 Essais Electrofocalisation et gel 2D

5.3 Essais Western blot et Dot blot

5.3 Essais Essai d’activité enzymatique: méthode couplée

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.3 Filtration sur membrane

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.4 Sédimentation

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.5 Filtration sur gel

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.6 Echange d’ions

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.7 Interactions hydrophobes

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.8 Chromatographie

5.6 Séparation et enrichissement 5.6.8 Chromatographie