Bacillus cereus isolée du sol - univ-tlemcen.dz

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE de TLEMCEN

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers

Département de Biologie

LAMABE

MEMOIRE

En vue de l’obtention du

Diplôme de MASTER : En biologie

Option : Microbiologie et contrôle de qualité

Thème

Caractérisation du potentiel PGP de la flore

Bacillus cereus isolée du sol

Présenté par

GHITRI Imane

Soutenu le 04/07/2018, devant le jury composé de :

Présidente Mme BENSALEHF. M.C.B Université de Tlemcen

Encadreur Mme MALEK F. M.C.A Université de Tlemcen

Examinatrice Mme KHOLKHAL W. M.C.B Université de Tlemcen

Année universitaire 2017-2018

Dédicaces

C’est avec une profonde émotion que je dédie ce

mémoire :

A mes chers parents, pour tous leurs sacrifices, leur

amour, leur tendresse, leur soutien et leurs prières tout au

long de mes études,

A mes chères sœurs zineb et wassila pour leurs

encouragements permanents, et leur soutien moral,

A mon chers frères, karim pour leur appui et leur

encouragement,

A toute ma famille pour leur soutien tout au long de

mon parcours universitaire,

Que ce travail soit l’accomplissement de vos vœux tant

allégués, et le fuit de votre soutien infaillible,

Merci d’être toujours là pour moi.

Imane.

Remerciements

En préambule à ce mémoire nous remerciant ALLAH qui nous

aide et nous donne la patience et le courage durant ces langues années

d’étude.

La première personne que nous tenons à remercier est notre

encadrant Mme. MALEK Fadila maitre de conférences A à la Faculté

de SNV / STU (Université de Tlemcen) pour l’orientation, la confiance,

la patience qui ont constitué un apport considérable sans lequel ce

travail n’aurait pas pu être mené au bon port. Qu’elle trouve dans ce

travail un hommage vivant à sa haute personnalité.

On remercie chaleureusement Mme. BENSALAH Fatima,

Maître de conférences classe B, Département de Biologie, de nous

avoir fait l’honneur de présider le jury de ce mémoire. On la remercie

pour sa compréhension. Trouvez ici l’expression de notre profonde

gratitude.

Mon sincères remerciements vont également à Mme. Kholkhal

Wahiba Maitre de conférences classe B au département de Biologie à

l’Université de Tlemcen, d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Nous souhaitant adresser nos remerciements les plus sincères

aux personnes qui nous ont apporté leur aide et qui ont contribué à

l’élaboration de ce mémoire ainsi qu’à la réussite de cette formidable

année universitaire, en particulier l’ingénieur du laboratoire

pédagogique N ° 02 Mr YAZID Amine.

Merci pour une autre fois.

Table des matières

1. Introduction générale 01

Synthèse bibliographique

Partie 01 : microflore rhizosphériques 03

1. Caractéristiques du sol 03

2. Présence microbienne dans le sol 03

3. La rhizosphère 04

3.1. Les interactions rhizosphérique 04

Partie 02 : L’effet bénéfique des bactéries du sol et de la rhizosphère 05

1. Introduction 05

2. l’effet phytostimulateur : mécanisme direct 05

2.1. La fixation de l’azote 05

2.2. La solubilisation du phosphate 06

2.3. La solubilisation du potassium 07

2.4. La solubilisation du Zinc 07

2.5. La production de phytohormone 08

2.5.1. L’acide indole acétique 08

2.5.2. Gibbérellines 08

2.5.3. Les cytokinines 09

2.5.4. L’éthylène 09

2.5.4.1. Les interactions de l’éthylène avec autre phytohormones 09

2.5.4.2. L’enzyme 1-aminocycloprone-1-carboxylate (ACC) désaminase 10

2.6. La production de sidérophores 10

2.7. Protection contre le stress abiotique et stress salin 11

3. L’effet phytoprotecteur : mécanismes indirects 11

3.1. Production d’enzymes lytique par les PGPR : chitinase et glucanase 12

3.2. L’antibiose 12

3.3. La compétition 13

3.4. Prédation et parasitisme 13

3.5. Production de cyanure d’hydrogène 13

3.6. L’induction de la résistance de la plante 13

4. La formation de biofilm 14

5. Les PGPR une approche biotechnologique durable 15

Partie 03 : Etude d’une bactérie PGPR Bacillus cereus 16

1. Les principaux caractères phénotypiques du groupe B. cereus 16

2.Taxonomie B. cereus 17

3. Les sept groupes phénotypiques du groupe B. cereus 17

4. cycle de vie B. cereus 19

Matériel et méthodes

1. l’échantillonnage 20

2. Détermination du pH du sol 21

3.1. L’isolement des bactéries du sol

3.2. L’isolement à partir des racines végétales

21

21

4. Les tests d’identification au genre Bacillus 21

4.1. La coloration de Gram 21

4.2. Le teste de la catalase 22

4.3. La mobilité 22

5. L’identification au groupe B. cereus 22

5.1. Croissance sur Chapman 22

5.2. Vérification de l’activité hémolytique 22

5.3. L’identification par galerie Api 20 E 23

6. Etude du pouvoir PGP in vitro 23

6.1. La production d’enzymes 23

6.1.1. Détermination de l’activité protéolytique 23

6.1.2. Détermination de l’activité amylolytique 23

6.2. La production de l’acide indole acétique 23

6.3. La solubilisation du phosphate 24

6.4. L’activité antagoniste 24

6.4.1. L’activité antifongique 24

6.4.2. L’activité antibactérienne 25

6.5. La formation de biofilm 25

6.5.1. La formation de biofilm sur microplaque de titration 25

6.5.1.1. Lecture des microplaques sur lecteur ELISA 25

6.5.2. La formation de biofilm sur des feuilles végétal autoclavé 26

6.5.3. La formation de biofilm sur des feuilles traitées par un désinfectant 26

6.6. Mesure de l’hydrophobicité des spores de B. cereus 26

6.6.1. Préparation des suspension sporales 26

6.6.2. La technique MATH 27

7. Détermination du pouvoir PGP in planta 28

7.1. La culture des graines de persille 28

7.1.1. Matériel végétal 28

7.1.2. L’inoculation du sol des pots 28

7.2. Test du pouvoir antagoniste 28

7.2.1 Préparation de l’inoculum de la souche B. cereus antagoniste 29

7.2.2. Préparation de la suspension de spores de Rhisopus 29

7.2.3. Mode de l’inoculation 29

Résultats et Discussions

1. Caractéristique du sol 30

2. Isolement et identification de Bacillus 30

3. Identification au genre Bacillus 32

4. Identification au groupe B. cereus 32

4.1. Détermination du biotype 34

5.1. La production d’enzymes : L’activité amylolytique et protéolytique 34

5.2. La production de l’acide indole acétique et solubilisation du phosphate 35

5.3. L’activité antagoniste 37

5.4. La formation de biofilm 38

5.5. L’hydrophobicité de surface des spores B. cereus 40

6. Résultats des tests in planta 41

Conclusion 44

Référence bibliographiques 46

Annexe

Liste des abréviations

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylate désaminase.

°C : Degré Celsius

EPS : exopolysacharides.

Fe3+ : Fer ferrique

GA : gibbérellines.

g : Gramme.

HCN : cyanure d’hydrogène

IRS : résistance systémique induit.

K : potassium

KSB : bactérie solubilisatrice de potassium

MATH : L’adhésion microbienne au solvant

N2 : Nitrogène

PGPR : plant growthpromotingrhizobactéria

pH : Potentiel d’Hydrogène

TIAC : toxi-infections alimentaire collectives

QS : qurom sensing

Listes des figures

Figure 1 : une représentation de la rhizosphère et leurs interactions. 04

Figure 2 : représentation du cycle d’azote selon Johann Dréo,2006. 06

Figure 3 : Rôle des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes. 07

Figure 4 : interactions d’exsudats racinaire des plantes, PGPR contre le

pathogène.

14

Figure 5 : observation de B. cereus au microscope optique, et au

microscope environnemental.

16

Figure 6 : les stades de germination de B. cereus. 19

Figure 7 : les sites d’échantillonnages au niveau du jardin cultivés. 20

Figure 8 : les sites d’échantillonnages au niveau de la montagne. 20

Figure 09 : les microplaques colorées au cristal violet et remplit de

solvants d’extraction.

25

Figure 10 : Aspect des colonies de Bacillus sur gélose au sang (A) et sur

milieu TSA (B et C).

31

Figure 11 : observation macroscopique de la souche racinaire du romarin

(Sr2) (swarming mobilité).

31

Figure 12 : observation microscopique des souches après une coloration

de Gram (G=10x 100).

32

Figure 13 : Mise en évidence de la production de lécithinases sur milieu

Chapman à l’émulsion de jaune d’œuf.

33

Figure 14 : Mise en évidence de l’activité hémolytique des souches testé

(A : gélose au sang neuf).

34

Figure 15 : Résultats d’identification par galerie Api 20E, (1 : S13E3, 2 :

SrE2).

34

Figure 16 : l’activité amynolytique (A et B) et protéolytique (C) des

souches.

35

Figure 17 : la production de AIA et la solubilisation du phosphate par B.

cereus.

35

Figure 18 : Antagonisme de B. cereus à l’égard de souches de

Pseudomonas (A : control positif ; B : une colonisation ; C : inhibition).

37

Figure 19 : Antagonisme antifongique de la souche B. cereus SR1, contre

Rhizopus (1témoin positif et 2 témoin négative).

37

Figure 20 : la formation de biofilm sur microplaque de titration. 38

Figure 21 : Formation de biofilm in-vivo sur des feuilles de plante. 40

Liste des tableaux

Tableau 1 : échelle d’interprétation de l’acidité du sol 33

Tableau 2 : résultats de la mesure du pH du sol 31

Tableau 3 : Résultats d’identification au genre Bacillus isoler à partir

du sol cultivé et non cultivé.

33

Tableau 4 : les résultats d’identification par galerie Api 20E 34

Tableau 5 : Propriétés stimulatrice de la croissance des plantes des

souches isolées.

36

Tableau 6 : Résultats de l’antagonisme antibactérien 37

Tableau 7 : lecture qualitative de la formation de biofilm 39

Tableau 8 : lecture des microplaques de titration 40

Tableau 9 : résultat de l’hydrophobicité des souches 41

Introduction

Introduction

1

Introduction

Le sol est un système vivant, complexe et un réservoir de microorganismes. Il contient

tous les types microbiens, eucaryotes (champignons, algues et protozoaires), et procaryotes

(bactéries et cyanobactéries). En termes de diversité et de densité, sol est un milieu riche et il

n’est pas simplement le support dans lequel les plantes s’enracinent et puisent les éléments

nutritifs indispensables à leur développement.

La rhizosphère est la région du sol située sous les racines des plantes. De nombreuses

interactions sont observées entre la plante, le sol et les microorganismes au niveau des

racines. Parmi les micro-organismes bénéfiques aux plantes, la flore PGPR (plant growth

promoting rhizobacteria) exerce de nombreuses fonctions, améliorant la croissance des

plantes que ce soit directement, par l’augmentation de la fertilité du sol, ou indirectement on

lui conférant une meilleure résistance aux agents pathogènes ainsi qu’aux stress

environnementales (Souza et al., 2015a). Parmi les groupes microbiens du sol qui influant sur

la croissance des plantes, on peut citer : Rhizobium, Pseudomonas, Alcaligenes, Azospirillum,

Klebsiella, Burkholderia, Enterobacter et Azotobacter sp, Serratia aussi que la flore

bactérienne aérobie sporulée qui est largement répandue dans la nature telle que le genre

Bacillus(Kumar et al., 2012).

Le groupe Bacillus cereus, est parmi les bactéries cultivables les plus abondantes du

sol. Ce sont des bactéries à Gram positif (+), sous forme des bâtonnets, et qui forment des

endospores(Dromigny, 2008). Elle présente des capacités remarquables, peuvent synthétiser

une vaste gamme de substances bénéfiques (Stein, 2005), est sont caractérisées par une

grande capacité de formation de biofilm. B. cereus et les autre espèce du genre Bacillus

stimulant la croissance végétale par différents processus tels que la production d'IAA, la

solubilisation du phosphate, fixation de l'azote, et les attributs de la lutte biologique comme la

production de HCN, sidérophore, enzymes hydrolytiques et les antibiotiques (Kumar, et

al.,2009). Ces bactéries présentant de ce fait, un potentiel stimulateur de la croissance des

plantes ou potentiel PGP intéressant pouvant être exploité pour l’amélioration des culture

végétales.

L’objectif de ce travail est d’isoler des souches sporulante à partir de la rhizosphère

d’un sol cultivé, et la rhizosphère de sol a couvert végétal naturel et de les caractérisé par

rapport à leurs propriétés de stimulation de la croissance des plantes en vue de les utiliser in

vivo ; puis l’identifié au groupe B. cereus ; et enfin le conservé.

Introduction

2

La démarche expérimentale suivi comprend :

❖ L’échantillonnage à partir des parcelles des sols étudiées.

❖ Isolement de la flore bactérienne sporulée sur des milieux de culture appropriée.

❖ Identification phénotypique des isolas au genre Bacillus et au groupe B. cereus.

❖ Evaluation du potentiel PGP des souches isolées par l’étude de :

❖ La production de l’acide indole acétique(AIA),

❖ La solubilisation du phosphate,

❖ La phytoprotection par la production des enzymes (amylase et protéase) ; l’activité

antibactérienne et antifongique,

❖ La formation de biofilm, et caractérisation des propriétés de surface des spores.

Pour valoriser l’efficacité de ces biofertilisants nous avons réalisé des tests in planta,

via des cultures en pot de deux légumes : le persille et la tomate.

Synthèse

bibliographique


3

Partie 01 : microflores rhizosphériques

1. Caractéristiques du sol

Un sol est un ensemble organisé en différents horizons, évolutif, ou la vie est présente

et dont le matériau est la terre. Il est le lieu de transferts de flux : eau, air, énergie et vie. Le

sol est le milieu d’interactions entre les différentes sphère conceptuelles constituant le globe

terrestre (Girard et al., 2011). La texture du sol se définit par ses proportions relatives en

argile, limon, sable fin, sable grossier. La texture du sol se définit par ses proportions

relatives en argile, limon, sable fin, sable grossier. Le pH, notion importante, mesure l’acidité

ou l’alcalinité du sol. Dans une échelle de 1 à 14, un milieu est neutre quand son pH est de 7.

En dessous, il est acide, au-dessus, il est basique ou alcalin. Les sols calcaires sont en général

basiques, alors que les sols sableux ou très riches en matière organique que s’assoit végétal ou

animale ou microorganismes(Calvet, 2013).

2. Présence microbienne dans le sol

Les microorganismes représentent une biomasse de 1%à 4% de la masse du carbone

organique du sol et de 75% à 90% de la biomasse vivante, cette proportion étant souvent plus

grande pour les sols prairie que pour les sols cultivés. La biodiversité microbienne des sols est

décrite à l’aide de plusieurs méthodes, que ce soient par les méthodes classiques (l’isolement

et l’identification), ou par les méthodes récemment développées (l’extraction quantitative de

l’ADN) (Girard et al., 2011).

L’abondance des microorganismes diminue avec la profondeur, surtout pour les

bactéries, et se diffèrent selon leur localisation. Dans le sol, une grande partie des

microorganismes se trouve au voisinage des racines, dans la rhizosphère, ou les substances

nutritives sont abondantes (Girardet al., 2011). Les bactéries sont les plus abondante d’où un

gramme de sol forestier contient en moyenne environ 4 x 10⁷ bactéries, tandis qu’un gramme

de prairie ou le sol cultivé en contient selon les estimations 2 x 10⁹ bactéries (Prescott et

al.,2013).

Les bactéries représentant plus de 1000 espèces, sont responsables de nombreux

processus : libération des éléments nutritifs à partir de la matière organique et des minéraux

du sol. Oxydation de l’ammonium en nitrates (nitrification - bactéries nitrosomonas et

nitrobacters). Production d’hormones de croissance qui favorisent le développement des


4

racines. Compétition avec les micro-organismes pathogènes limitant ainsi les risques de

maladie (symbiotech.over-blog.com, 2017).

3. La rhizosphère

La rhizosphère est le volume de terre directement soumis à l’action des racines. Elle

correspond aux surfaces d’échanges entre les racines et les minéraux de la terre ainsi qu’entre

les racines et les microorganismes, c’est une zone où les relations entre plantes et micro-

organismes sont particulièrement actives (figure 1). Elle constitue une continuité entre le

milieu biologique et le milieu physique (Vacheron et al., 2013a).

3.1. Les interactions rhizosphériques

Dans la rhizosphère on distingue trois zones : l'endorhizosphère, le rhizoplan et le

ectorhizosphère. Dans cet environnement, il y a des interactions entre les racines des plantes,

les microbes, et le sol. Les propriétés physiques et chimiques du sol, peuvent modifient la

population microbienne dans la rhizosphère (Huang et al., 2014).

Figure 1 : une représentation de la rhizosphère et leurs interactions (Badri et al., 2009).

Les interactions de la rhizosphère sont souvent affectées par de nombreux signaux

régulateurs différents de nature chimiques, Communication moléculaire entre l'hôte et

pathogènes, ou la rhizoremediation (la dégradation des polluants par l'augmentation de

nombreux activité métaboliques des microorganismes rhizosphèriques) (Kuiper et al., 2004).

Ces signaux sont très dynamiques et peuvent être modifié. Les interactions entre les racines et

les microorganismes du sol sont souvent spécialisés, et jouent un rôle important dans un

certain nombre de processus écosystémiques vitaux, tels que la séquestration du carbone et les

cycles des éléments nutritifs. Les microorganismes en particulier les bactéries ont un effet

bénéfique sur la croissance des plantes (Badri et al., 2009).


5

Partie 02 : l’effet bénéfique des bactéries du sol et de la rhizosphère

1. Introduction

Les rhizobactéries stimulatrices de la croissance des plantes (PGPR : Plant growth-

promoting rhizobacteria) : sont les bactéries du sol qui colonisent les racines des plantes et

améliorent leur croissance directement ou indirectement ; et à leur tour les racines des plantes

sécrètent des métabolites qui peuvent être utilisés comme éléments nutritifs. La stimulation

directe peut inclure la fixation de l'azote atmosphérique, synthèse de diverses phytohormones

et des enzymes, ainsi que la solubilisation des minéraux du sol. Tandis que la stimulation

indirecte qui comprend l'inhibition des phytopathogènes via trois types d'interactions, la

compétition, l’antagonisme et l’induction de la défense de la plante (la résistance systémique

induit : IRS)(Gopalakrishnanet al., 2012; Huang et al., 2014; Osman et al., 2017).

Parmi les groupes microbiens du sol qui s’influx sur la croissance des plantes, on peut

citer : Rhizobium, Pseudomonas, Alcaligenes, Azospirillum, Klebsiella, Burkholderia,

Enterobacter et Azotobacter sp, Serratia, et en particulier le genre Bacillus qui forme des

spores qui lui donne une certaine résistance à la température, et à la concentrations élevées

des produits chimiques, impliquant un potentiel PGPR particulier (Kumar et al., 2012;

Osman et al., 2017).

Le genre Bacillus présente des capacités remarquables, peut synthétiser une vaste

gamme de substances bénéfiques (Stein, 2005). Le genre Bacillus stimule la croissance

végétale par différant processus tels que la production d'IAA, la solubilisation du phosphate,

fixation de l'azote, et les attributs de la lutte biologique comme la production de HCN,

sidérophore, enzymes hydrolytiques et les antibiotiques (Kumar et al., 2009).

2. L’effet phytostimulateur : mécanismes directs

2.1. La fixation de l’azote

L'azote est un élément chimique très disponible dans la nature et indispensable pour le

fonctionnement des organismes. L'atmosphère est constituée d'environ 80% de gaz N2. Mais

la plupart des végétaux ne peuvent l'utiliser sous cette forme inerte. Les plantes absorbent

seulement les formes ioniques solubles dans l'eau qui se trouvent sous les formes nitriques ou

nitrates (NO3-) et ammoniacales ou ammonium (NH4+), au niveau des racines (bio en

ligne.com). Il existe plusieurs types de bactéries fixatrice de l’azote (les bactéries

associatives, symbiotes et libres, vivant dans la rhizosphère) ; mais toutes les bactéries


6

fixatrices d’azote comme Azospirillum, Burkholderia, Gluconacetobacter et

Pseudomonasutilisent forme un complexe enzymatique appelé la nitrogénase. Et donc la

fixation associative de l’azote et la promotion de la croissance végétale par les rhizobactéries

se fait sur des organes végétaux spéciaux appelés nodules de racine ou de tige (figure 2). Les

rhizobactéries fixatrice de l’azote sont importantes pour une bonne fertilisation du sol et un

système agricole durable (Pereg et McMillan, 2015; Wdowiak-Wróbel et al., 2017).

Figure 2 : représentation du cycle d’azote selon Johann Dréo,2006.

2.2. La solubilisation du phosphate

Le phosphore est le deuxième élément nutritif le plus important pour les plantes, après

l’azote, et il représente environ 0,2% du poids sec d'une plante. Le phosphate existe dans le

sol sous forme de sels minéraux ou incorporé dans des composés organiques. Bien que ces

composés du phosphore soient abondants dans les sols agricoles, la majorité d'entre eux se

présente sous une forme insoluble ( Oteino et al., 2015;Alori et al., 2017).

Les bactéries solubilisatrices du phosphate comme Rhizobium, Enterbacter, Serratia,

Citrobacter, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas, ou encore Bacillus jouent un rôle pour la

nutrition des plantes puisqu’elles ont la capacité à convertir P insoluble au P soluble en

produisant des acides organiques, la chélation et l'échange d'ions ce qui augmente la fertilité

du sol. De plus, les sols contiennent des acides organiques de bas poids moléculaire avec un

ou plusieurs groupes carboxyliques et certains acides. Le rôle des acides organiques dans la

solubilisation du P dépend fortement du sol (Gupta et al., 2012; Panhwar et al., 2013).


7

2.3. La solubilisation du potassium

Le potassium (K) fait partie des trois éléments majeurs nécessaires à la croissance des

plantes avec l’azote et le phosphore. Il joue un rôle important dans le métabolisme de l’azote

et la fabrication des protéines et contribue à la résistance aux maladies et à la sécheresse

(Faucher, 2017). Le potassium est disponible sous quatre formes dans le sol, et certains

microorganismes du sol (bactéries, champignons), comme les Enterobacter et Bacillus sont

capables de dissoudre le potassium insoluble (KSB) car elles produisent de l'acide oxalique et

des acides citriques et des enzymes ; parce que la plus grande partie du potassium n'est pas

disponible pour l'absorption par les plantes. L'efficacité de la solubilisation du potassium par

différentes bactéries varie selon la nature des minéraux porteurs de potassium et les conditions

aérobies (Parmar etSindhu, 2013; Setiawati et Mutmainnah, 2016).

2.4. La solubilisation du Zinc

Le zinc est un élément métallique ou métalloïdes dits « traces » car il est présent en

faible concentration dans la croûte terrestre ou les organismes vivants. Il désigne un oligo-

élément indispensable aux processus biologiques, mais toxiques à des teneurs élevées même

dans des concentrations relativement faibles. Le zinc est requis par de nombreuses enzymes

en quantités infime(Habibi et Karimi, 2014). Le zinc est tout jour associé au phosphate pour

être utile par la plante, et les PGPR ont la capacité de le solubiliser (Kumar et al., 2012). La

figure 3 représentent les différents mécanismes de stimulation de la croissance des plantes.

Figure 3 : Rôle des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (Gouda et al.,

2018a).


8

2.5. La production de phytohormones

Les plantes sont soumises à divers stress abiotiques, tels que la sécheresse, la

température extrême, la salinité et les métaux lourds. Les phytohormones sont parmi les

régulateurs de croissance les plus importants ; ils sont connus pour avoir un impact important

sur le métabolisme et la croissance des plantes, et en outre, ils jouent un rôle essentiel dans la

stimulation des mécanismes de réponse de la défense des plantes contre les

stress(Egamberdieva et al., 2017).

Les microorganismes associés aux racines, y compris les microorganismes libres,

symbiotiques ou endophytes, peuvent produire divers types de phytohormones ; par exemple

des isolats bactériens provenant de la rhizosphère d'un légume appartenant aux genres

Bacillus, Klebsiella, Leifsoniaet Enterobacter montre une capacité à produire de l'IAA et

d'améliorer la croissance du maïs dans le sol contaminé (Egamberdieva et al., 2017).

2.5.1. L’acide indole acétique

La biosynthèse de l’acide indole acétique « IAA : Indole-3-acetic acid » a été corrélée

avec la stimulation et la prolifération racinaire par les bactéries de la rhizosphère, ce qui a

amélioré l'assimilation des nutriments par les plantes associées (Malik et Sindhu, 2011). Le

groupe B. cereus est également capable de produire des quantités physiologiquement actives

d'auxines (IAA)(M. Usha Rani, 2011). Les bactériens producteurs d'IAA comme les

Enterobacter taylorae, Klebsiella planticola, Alcaligenes faecalis, Xanthomonas maltophila,

Pseudomonas sp. et Flavobacteriumsp ont le potentiel d'interférer avec n'importe lequel de

ces processus en introduisant l'IAA dans le pool d'auxine de la plante (Leveau ,

Lindow,2005).On a constaté que l'effet de l'AIA dépend de la concentration, c'est-à-dire que

de faibles concentrations d'AIA exogènes peuvent favoriser la croissance des racines, tandis

que des concentrations élevées peuvent l’inhiber (Malik et Sindhu, 2011).

2.5.2. Gibbérellines

Gibbérellines sont diterpénoïdes, régulant la croissance des plantes. Elles sont

couramment utilisées dans l'agriculture moderne. Les hormones végétales gibbérellines sont

nécessaires à la germination des graines. Les voies de signalisation de l'hormone peuvent

stimuler la germination de la graine par la libération de la dormance de l’endosperme et

l’expansion de la cellule embryonnaire. En outre, les gibbérellines peuvent influencer la

production de protéines du stress oxydatif, et des métaux lourds(Miransari et Smith,


9

2014).Mais très peu de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) sont

connues pour produire des gibbérellines (GA)(Kang et al., 2014).

2.5.3. Les cytokinines

Les cytokinines ce sont des hormones végétales dérivées de molécule d'adénine qu’ont

la capacité d’améliorer la division cellulaire des plantes et la résistance des plantes aux

facteurs nuisibles. Ils peuvent également affecter l’activités des cellules du méristèmes dans

les racines, ainsi que la sénescence des feuilles(Chanclud, 2015). De plus, ils sont efficaces

dans la formation de nodule au cours de la mise en place de la symbiose N2-fixing et d'autres

interactions entre la plante et les microbes. Parmi les souches bactériennes productrices de

cytokinines associées aux racines Arthrobacter, Bacillus, Azospirillum et Pseudomonas, qui

peut augmenter la biomasse des racines, ainsi que la teneur en proline dans les tissus végétaux

(Miransari et Smith, 2014 ; Egamberdievaet al., 2017). Les cytokinines sont également

largement utilisées dans la bio-ingénierie et la production agricole pour des cultures

cellulaires dans des bioréacteurs, pour la micropropagation de plantes cultivées, l’obtention

des plantes transgéniques, et pour contrôler le sexe des plantes (Andrabi et al., 2018).

2.5.4. L'éthylène

L'éthylène est une phytohormone gazeuse simple avec de multiples rôles dans la

régulation du métabolisme au niveau moléculaire, cellulaire, et à l'échelle de la plante entière

(Khan et al., 2017). L'éthylène régule les réponses des plantes aux conditions de stress

abiotique, et biotique ; un faible dégagement d'éthylène déclenche des réponses adaptatives et

influence d'autres voies de signalisation hormonale qui induit la résistance des plantes

(Ravanbakhsh et al., 2018).

2.5.4.1 Les interactions de l’éthylène avec autre phytohormones

-Éthylène et Auxine : l'action de l'éthylène sur la croissance des feuilles peut être dépendante

ou indépendante de l'auxine. La coordination hormonale est un aspect important qui régule les

processus de croissance des feuilles. L'auxine induit la production d'éthylène, et de nombreux

effets des auxines exogènes sont, en fait, des réponses à l'éthylène (Iqbal et al., 2017).

-Éthylène et cytokinine : les rapports sur l'interaction entre l'éthylène et la cytokinine sont

rares. Cependant, la cytokinine peut jouer un rôle important dans l'initiation des feuilles grâce

au maintien de la S-adénosyl-méthionine (SAM) ; un métabolite immédiat pour la biosynthèse

de l'éthylène (Iqbal et al., 2017).


10

-Ethylène et gibbérellines : Gibbérellines (GA) jouent un rôle dans l'expansion des feuilles, et

l'augmentation des taux d'éthylène induira une gamme d'effets pléiotropes, tels que l'inhibition

de la croissance et la floraison tardive, en plus de la réponse cible ; et donc l’éthylène et

gibbérellines en un effet contradictoire (Iqbal et al., 2017 ; Ravanbakhsh et al., 2018).

-Ethylène et acide abscissique : ont une relation étroite, et les deux hormones ont un effet

inhibiteur de la croissance des plantes (Benschop et al., 2005).

2.5.4.2. L'enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase

Un certain nombre de PGPR contient l'enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate

(ACC) désaminase, le précurseur de cette enzyme ACC peut cliver l'usine d'éthylène, et ainsi

abaisser le niveau d'éthylène pour qui ne devient pas élevé au point où la croissance initiale

des racines est altérée, dans une plante en développement ou stressée (Penrose et Glick,

2003).

La bactérie Pseudomonas sp, et la levure Cyberlindnerasaturnus étaient les deux premiers

microorganismes signalés pour synthétiser l'ACC désaminase ; par la suite, l'activité de la

désaminase de l'ACC a été observée chez de nombreuses bactéries, à Gram positives et à

Gram négatives, avec différents types de métabolisme. Des souches appartenant au genre

Mesorhizobium, ne sont capables de produire l'enzyme que pendant la phase symbiotique,

lorsqu'elles sont localisées à l'intérieur d'un nodule racinaire (Gamalero and Glick, 2015).

2.6. La production de sidérophores

Le fer est l'un des micronutriments les plus importants pour la croissance microbienne

dans divers environnements. Bien que le fer soit présent sur terre en grande quantité, il est

insoluble. Donc les microorganismes ont développé un système efficace d'acquisition de Fe

des « sidérophores » (liaison Fe (III) de bas poids moléculaire composés (200e2000 Da), pour

acquérir des quantités suffisantes d’élément(Złoch et al., 2016). Le mécanisme du

sidérophore consiste d'abord à se lier à une forme ferrique de fer et à former un complexe de

sidérophore-fer qui pénètre dans les cellules par l'intermédiaire de récepteurs sidérophores

spécifiques présents dans la membrane cellulaire. Pour les bactéries gram-positives, le

transport du complexe sidérophore-fer est réalisé par l'implication de protéines sidérophores

irrévocables, de perméases et d'ATPases. Alors que dans les bactéries gram-négatives, le

mécanisme de transport est très différent en raison de leur structure membranaire complexe.

Ici, ils transfèrent le complexe sidérophore-fer à travers une protéine de liaison périplasmique


11

et une protéine membranaire cytoplasmique correspondant à un transporteur de cassette se

liant à l'ATP (S. kumaret al., 2017).

De nombreuses bactéries associées à des plantes et qui peuvent synthétiser des

sidérophores tel que Bradyrhizobium, Pseudomonas, Rhizobium, Streptomyces, Serratia,

Azospirillum, et Bacillus, à donner aux plantes un avantage concurrentiel dans la colonisation

des tissus végétaux en les aidant à exclure d'autres micro-organismes de la même niche

écologique, et peuvent également contribuer à la suppression de pathogènes dans la

rhizosphère. De plus, il a été montré que les bactéries productrices de sidérophores résistant

aux métaux, et jouent un rôle important dans la croissance et la survie de la plante, ainsi que

l’induction de la résistance des plantes(Pereg et McMillan, 2015; Złoch et al., 2016).

2.7. Protection contre le stress abiotique et stress salin

Le stress d'aridité causé « par la sécheresse, la température élevée, la salinité qui est

l'un des graves problèmes environnementaux qui causent le stress osmotique », sont les stress

abiotiques les plus dominant qui limitent la croissance et la productivité des plantes(Kumar

et Verma, 2018). La tolérance à ce stress est multigénique et quantifiable et comprend

l'accumulation de certains métabolites de stress, tels que les poly-sucres, la proline, la glycine-

bétaïne, l'acide abscissique et la régulation positive de la synthèse d'antioxydants

enzymatiques et non enzymatiques, comme la superoxyde dismutase (SOD), la catalase

(CAT), l'ascorbate peroxydase (APX), la glutathion réductase, l'acide ascorbique, l'α-

tocophérol et le glutathion. L'application des microorganismes producteurs de ces métabolites

tel que certains rhizobactéries stimulatrices de la croissance des plantes (PGP) et certains sont

des champignons mycorhiziens favorisent la croissance des plantes, dans de telles conditions.

Il offre un moyen économiquement fascinant et écologique de protéger les plantes contre les

conditions de stress ( Tank et Saraf, 2009 ; Gouda et al., 2018).

3. L’effet phytoprotecteur : mécanismes indirects

Contrairement aux mécanismes directs des PGPR, les mécanismes indirects se

produisant à l'extérieur du corps de la plante permettant de réduire ou arrêter les effets

nuisibles des phytopathogènes en produisant différents signaux. Les plantes répondent aux

signaux envoyés par la bactérie soit en produisant des substances antagonistes ou en induisant

une résistance aux agents pathogènes. Pour le stress biotique, les rhizobactéries jouent un rôle

dans l’induction de la résistance(Tabassum et al., 2017).


12

L'environnement rhizosphérique et antagoniste bactérien peuvent être mises en évidence

selon(Beneduzi et al., 2012), via les mécanismes suivants :

-La synthèse des enzymes hydrolytiques, telles que les chitinases, les glucanases, les

protéases, et les lipases, qui peuvent lyser les cellules fongiques pathogènes.

-la concurrence pour les nutriments et la colonisation appropriée des niches à la surface

radiculaire.

-la production de sidérophores et des antibiotiques.

3.1. Production d’enzymes lytique par PGPR : chitinase et de glucanase

L'un des principaux mécanismes utilisés par les agents de lutte biologique contre les

pathogènes du sol consiste la production d'enzymes dégradant les parois cellulaires, telles que

la β-1,3-glucanase, la chitinase, la cellulase et la protéase sécrétées par les souches de

biocontrôle de PGPR, exersant un effet inhibiteur direct sur la croissance des hyphes des

pathogènes fongiques en dégradant leur paroi cellulaire. Les agents de lutte biologique ayant

les potentiels des activités chitinolytiques, la chitine est convertie principalement en chitosan,

(RaafatandSahl, 2009), cette activité comprennent B. licheniformis, B. cereus, B. circulans,

B. subtilis et B. thuringiensis. Parmi les bactéries à Gram négatif possèdent des activités

chitinolytiques en distingue, Serratia marcescens, Enterobacter agglomerans, Pseudomonas

aeruginosaet P. fluorescens(Goswamiet al., 2016a).

3.2. L’antibiose

Les bactéries de la rhizosphères sont sous-utilisées comme des agents de lutte

biologique, sur tous les bactéries qui tuent les pathogènes par l'antagonisme, et les bactéries

qui produisent des antibiotiques, et des biosurfactants. La synthèse des antibiotiques par les

bactéries et un biocontrôle négatif par rapport à la plante (Lugtenberget Kamilova, 2009;

Mota et al., 2017). Les antibiotiques sont des toxines de bas poids moléculaire produites par

les communautés bactériennes qui peuvent tuer et / ou empoisonner d'autres microbes.

Cependant, les biosurfactants sont des composés amphiphiles qui peuvent causer une fuite des

composant cellulaire, en interagissant avec les membranes de micro-organismes nuisibles.

Plusieurs antibiotiques et des toxines ont été identifiées à partir de la population bactérienne

vivant dans la rhizosphère(Tabassum et al., 2017). Le groupe B. cereus produit les

antibiotiques zwittermicine A (aminopolyol) et kanosamine (aminoglycoside), contribuent à

la lutte biologique(Beneduzi et al., 2012).


13

3.3. La compétition

La compétition est l'interaction indirecte dans laquelle les pathogènes présents dans la

rhizosphère sont en concurrence les uns avec les autres pour la nourriture et pour l’occupation

physique du site. L’environnement de la rhizosphère est souvent limité en nutriments, et pour

que les microbes réussissent à coloniser et à survivre, ils occupent les sites où l'eau et les

nutriments sont assimilables, et contenant du carbone facilement disponible. Ainsi, pour que

les microbes puissent survivre dans un tel environnement, ils sécrètent des sidérophores qui

ont une forte affinité avec le fer et rendent moins disponible aux pathogènes et inhibent leur

croissance dans la rhizosphère (Tabassum et al., 2017).

3.4. Prédation et parasitisme

La prédation et le parasitisme, le mécanisme majeur de biocontrôle utilisé par certaines

espèces (fongiques) de Trichoderma, mais ce mécanisme existe actuellement chez les

bactéries (Lugtenberg et Kamilova, 2009).

3.5. Production de cyanure d'hydrogène

Les micro-organismes phytopathogènes constituent une menace majeure et chronique

pour l'agriculture durable et la stabilité des écosystèmes dans le monde entier. Le cyanure

d'hydrogène (HCN) est le composé volatil le plus puissant produit par de nombreuses

rhizobactéries favorisant la croissance des plantes, et possédant une activité contre les

phytopathogènes. Le cyanure d'hydrogène est généralement produit par le genre Bacillus, y

compris B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. sphaericus, et B.

subtilis(Ahemad et Kibret, 2014a).

3.6. L’induction de la résistance de la plante

Les PGPR fournissent une stratégie alternative pour protéger la plante contre les

maladies via la résistance systématique induite (ISR). Le processus par lequel le traitement

des plantes par PGPR déclenche la défense de l'hôte se traduisent par la réduction de la

sévérité ou l'incidence de la maladie causée par des pathogènes qui sont séparés dans l'espace

est appelé ISR (Goswami et al., 2016b). Cette « immunisation » de la plante, ne provoquant

pas de symptômes visibles de maladie. L’ISR s'est avérée être induite par des

microorganismes variés et plus particulièrement par des rhizobactéries. Celles-ci incluent des

bactéries Gram+ comme Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloquefaciens et

Bacillus thuringiensis ou des bactéries Gram- qui sont les plus étudiées dans le contexte de


14

l'ISR, bien que des entérobactéries. Ainsi, l'induction des rhizobactéries produisent un signal

qui se propage de façon systémique à l'intérieur de la plante et augmente la défense, et la

capacité des tissus d’éloigner l'infection causer par les agents pathogènes (figure 04),

(Jourdan et al, 2008 ; Benhamou etRey, 2012).

Figure 4 : Interaction d’exsudats racinaires des plante, PGPR, contre le pathogènes, d’après

(Dutta et Podile, 2010).

4. La formation de biofilm

La compétition et la capacité à coloniser les racines des plantes pendant la transition

du style de vie libre vers le mode de vie associé aux racines est très important pour un

potentiel PGP (Souza et al., 2015a). Les PGPR sont efficaces pour la racine de la plante

lorsqu’ils se multiplient en microcolonies et / ou produisent un biofilm à la suite d'une

interaction plante-microbe. Les biofilms associés aux plantes sont hautement capables de

fournir une protection contre le stress externe. Le biofilm agit comme une barrière protectrice

qui empêche la pénétration du pathogènes, et sécrète également diverses enzymes (Gupta et

al., 2017a), en diminuant la compétition microbienne et en conférant des effets protecteurs à

la plante hôte, ce qui favorise la croissance, le rendement et la qualité des cultures (Kasim et

al., 2016).

La PGP associative et endophytique réagissent aux exsudats végétaux par la

modulation de l'expression de plusieurs gènes, tels que ceux associés à la biosynthèse des

exopolysaccharides (EPS) et à la formation de biofilms. Les biofilms sont des populations

microbiennes adhérentes à la surface généralement incorporées dans un matériau matriciel


15

autoproduit(Souza et al., 2015a).La plupart des espèces bactériennes utilisent la détection du

quorum pour coordonner leur expression du gène selon la densité locale de leur population

(QS), (Seneviratne et al., 2010). Cette communication moléculaire intense entourant les

racines fournit une large gamme d'interactions microbe-microbe, rendant cet environnement

hautement compétitif parmi les bactéries du sol. La compétition microbienne et les activités

comprennent, par exemple, la motilité, l'attachement, la croissance, la résistance au stress, la

production de métabolites secondaires, et la détection du quorum (Souza et al., 2015b).

5. Les PGPR : une approche biotechnologique durable

Les PGPR en été classer selon leurs activités fonctionnelles comme des biofertilisants

(augmentation de la disponibilité des nutriments pour la plante), des phytostimulateurs

(promotion de la croissance des plantes), des rhizorémédiateurs, et les biopesticides (contrôle

des maladies, principalement par la production d'antibiotiques et de métabolites

antifongiques) (Ahemad et Kibret, 2014).

Les Biostimulants végétaux, parfois appelés biostimulants agricoles, sont une

classification diverse des substances qui peut être ajouté à l'environnement autour d’une

plante « la rhizosphère » et ont des effets positifs sur la croissance des plantes, et aussi sur la

tolérance au stress abiotique et biotique. Les Biostimulants ne sont pas des nutriments, mais

ils facilitent l'adoption des nutriments ou contribuer de manière bénéfique à la croissance ou

la résistance au stress, c’est pour cette raison les PGPR sont utilisé dans les nouvelles

approches biotechnologiques(Van Oosten et al., 2017).

Les PGPR producteurs de biofilm sont utilisées comme des biofertilisants du sol afin

de réduire les effets néfastes du stress sur les plantes(Gupta et al., 2017b)Les produits

biologiques à base des PGPR qui forme des spores bactériennes en une durée de conservation

qui varie de 1 à 3 ans, et un inconvénient de temps de revenir au stade métabolique actif d'une

cellule végétative après leur application. Cependant, il est probable que les souches de

contrôle biologique les plus efficaces agissent via plusieurs mécanismes (Kumar et al.,

2012).


16

Partie 03 : Etude d’une bactérie PGPR : Bacillus cereus

1. Les Principaux caractères phénotypiques du groupe B. cereus

B. cereus est considérées comme une bactérie du sol, et comprend des espèces

étroitement apparentées, qui ont une très grande importance pour l’homme. B. cereus est un

groupe de bactéries à Gram positif (+), sous forme des bâtonnets assez volumineux, mesurant

de 1à1,8 µm de diamètre par 4à8 µm de long, mobile avec une ciliature péritriche, aérobies ou

aroanaérobies facultatifs, et qui forme des endospores(Dromigny, 2008). Les spores de B.

cereus ont une forme non déformante, en règle générale ovales, et en position subterminale,

ou parfois en position paracentrale à raison d'une spore par cellule. En effet les endospores et

la formation de biofilm en considéré comme des propriétés de survie et de résistance envers

les conditions défavorables. B. cereus est capable de croitre à une large gamme de

température allant de 4°C à 55°C avec une température optimale de croissance comprise entre

30°C et 40°C (Bottone, 2010; Lin et al., 2017).

Ce groupe de bactéries appartenant au genre Bacillus ayant une grande importance

économique et clinique ; c’est un contaminons fréquent des produits alimentaires, mais il peut

vivre en saprophyte dans le sol(Jensen et al., 2003). Le groupe B. cereus est un groupe de

microorganisme très homogène, réuni sous le nom de « B. cereus sensu lato » (Malek et al.,

2013)qui se diffère des autres Bacille de morphologie similaire, par l’activité hémolytique, et

la production de lécithinase sur milieu Mossel, ainsi l'incapacité à fermenter le mannitol,

selon la norme AFNOR (2005).

Figure 5 : observation de B. cereus au microscope optique, et au microscope électronique

environnemental.


17

2. Taxonomie du groupe B. cereus selon (Dromigny, 2008).

Domène des eubactéries

Phylum des firmicutes

La classe des Bacilli

L’ordre des bacillales

La famille des Bacillaceae

Le genre Bacillus

Le groupe B. cereus

3. Les sept groupes phylogénétiques du groupe B. cereus

Le groupe B. cereus comprend six espèces qui ne sont pas considérées comme des

espèces génomiques distinctes: B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B.

pseudomycoides et B. weihenstephanensi, et une nouvel espèce Bacillus cytotoxicus(Jensen et

al., 2003),et répartis entre sept groupes phylogénétiques selon la classification de

(Guinebertière et al.,2008).

Le groupe I regroupe les souches de l'espèce pseudomycoides, dont la température de

croissance est comprise entre 10°C et 43°C. Les souches psychrotrophes de B. cereus et B.

thuringiensis du groupe II ne présentent pas de croissance en dessous de 7°C et peuvent

croître jusqu'à 40°C. Les groupes III, IV et V regroupent les souches de B. cereus sensu

stricto et B. thuringiensis, les plus mésophiles du groupe B. cereus. Le caractère mésophile est

de plus en plus marqué du groupe V vers le groupe III qui regroupe les souches de B.

anthracis. Le groupe VI contient les souches psychrotrophes de B. weihenstephanensis et B.

mycoides qui sont capables de croître dès 5°C mais sont incapables de croître au-delà de

37°C. Le groupe VII contient les souches les plus thermophiles, dont la température de

croissance varie de 20°C à 50°C ( Malek et al., 2013; Brillard et al., 2015).

B. cereus sensu stricto : est fréquemment isolée à partir du sol, de plantes et de

l'intestin de différents animaux, et elle est capable de coloniser différents habitats. Elle est

capable de synthétiser des enzymes extracellulaires d'intérêt industriel, des toxines et des

antibiotiques. B. cereus est un agent de TIAC (toxi-infections alimentaires collectives), sa

pathogénicité provient de sa capacité à produire plusieurs facteurs de virulence tels que des

phospholipases, des entérotoxines et des toxines émétiques (céreulides) entrainant des toxi-

infections alimentaires (Granum etLund, 1997; Kotiranta et al., 2000).


18

Bacillus thuringiensis : est utilisées dans la lutte biologique au sa qualité de

biopesticides. Les bactéries synthétisent des toxines cristallines actives contre diverses

espèces d'insectes nuisibles des ordres Lepidoptera, Coleoptera et Diptera. De plus, les

insecticides contenant des spores et des cristaux de B. thuringiensis révèlent une activité pour

les hémocytes des insectes (Cinar et al., 2007).

Bacillus anthtacis: est constituée de grands bacilles à germes Gram positif aérobie, et

le seul pathogène obligatoire du genre Bacillus, le responsable de l’anthrax, et qui tire son

nom du mot grec charbon. B anthracis, en raison de sa capacité à provoquer des escarres

cutanées noires semblables au charbon. Bien que B.anthracis a été signalé comme sensibles à

un nombre limité d'agents antimicrobiens, elle est caractérisée par la résistance à la

pénicilline, l'érythromycine et les quinolones a été noté(Koehler, 2009; Lin et al., 2017).

Bacillus mycoides et pseudomycoides: est un nombre de B.cereus le moins étudié car il

est le moins nocif pour homme, par rapport à B. anthracis et B. cereus ou l’agent insecticide

B. thuringiensis. B. mycoides a été étudié pour la première fois par le naturaliste russe Gause

(1939), qui étudie la genèse des colonies typiques de ces bacilles, dont la croissance sur

milieu gélosé forme une forme rhizoïdale ressemblant aux hyphes fongiques, groupés en

faisceaux courbes à droite ou à gauche(Turchi et al., 2012). B. mycoides a montré une

capacité à produire des biosurfactants (Composé actif biologique des détergents qui met en

solution ou en suspension les souillures adhérentes à des surfaces. Il favorise l'humidification,

la solubilisation et l'émulsion de composés organiques), dans une gamme de pH de 5 à 9 et à

des températures variables de 20°C à 50 ° C, qui lui donne un grand intérêt biotechnologique

(Romanowska et al., 2015).

Bacillus weihenstephanensis : se distingue par sa capacité à croître à 7 ° C mais pas à

43 ° C, et à différant pH, et aussi des séquences de signatures spécifiques de Bacillus

weihenstephanensis ont été trouvées dans certaines souches de B. cereus et de B. mycoides

suggérant une psychotolérance. Elle peut produire une toxine émétique (cereulide). Cette

toxine est stable à la chaleur et aux acides qui provoque une intoxication alimentaire

accompagnée de vomissements ( Soufiane et Côté, 2013; Guérin et al., 2017).

Bacillus cytotoxicus : une nouvelle espèce qu’a été placé dans le groupe phylogénique

VII, et caractérisé par sa toxicité élevée, sa thermotolérance particulier (croissance à 50 ° C),

et son apparition relativement rare in (Malek et al., 2013).


19

4. Cycle de vie B. cereus

B. cereus l’espèce saprophyte du sol est capable de produire des spores qui peuvent

survivre pendant des années dans leur état de dormance dans le sol. Les spores dormantes

retour à leur cycle de croissance végétative dans un procédé comprenant la germination et

l'excroissance qui convertit la spore germée dans une cellule en croissance (figure 6). Il existe

un certain nombre de types différents d'agents qui déclenchent la germination des spores. Les

spores germées ont une résistance à la chaleur inférieure au spores dormantes et peuvent être

inactivées à des températures plus basses (LøVdal et al., 2011; Setlow, 2014).

Figure 6 : les stades de germination de B. cereus.

Matériel et

méthodes


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Cette étude expérimentale a été réalisé au niveau du laboratoire de pédagogie N°2 du

département de biologie, faculté SNV-STU université de Tlemcen.

1. L’échantillonnage

Les échantillons de sol sont prélevés dans la région de Ain el Houtz, les sites de

prélèvements sont divisés en deux grands types de sol : le sol d’un jardin cultivé, et le sol

d’une montagne recouvert d’une végétation naturelle.

Deux échantillons sont prélevés à partir du jardin au niveau de la rhizosphère d’un

citronnier quatre saison arrosé par l’eau de rinçage des fruits et des légumes domestiques, et à

partir de la rhizosphère d’un romarin traité par des cendres d’origine végétale) (figure7).

Trois autres échantillons ont été prélevés à partir du sol de montagne au niveau de la

rhizosphère d’un sapin associé à une plante aromatique du genre Thymus, et au niveau de la

rhizosphère des mauvaises herbes au-dessous d’un arbre ainsi que de celle d’un amandier)

(figure8). Les prélèvements ont été réalisés à l’aide d’une cuillère préalablement stérilisée, la

technique consiste à enfoncer verticalement la cuillère dans le sol au niveau de la rhizosphère

des végétaux, à une profondeur de 10 à 20 cm. Les échantillons sont placés dans des boites de

pétri recouvertes avec du papier aluminium et conservées à 4°C.

Figure 07 : Les sites d’échantillonnage au niveau du jardin cultivés (Ain El Houtz 2018).

Figure 08 : Les sites d’échantillonnage au niveau de la montagne (Ain El Houtz 2018).


21

2. Détermination du pH du sol

Le pH du sol a été déterminé à l’aide d’un pH-mètre. On fait dissoudre 10g de sol dans

25ml de l’eau distillée, ce mélange doit être homogénéisé par un agitateur magnétique

pendant 3-5 min, laissé décanter puis le pH du surnageant est mesuré. La lecture des résultats

se fait par comparaison aux valeurs de référence (Baize, 2000).

3.1. L’isolement des bactéries du sol

L’isolement des bactéries du sol a été réalisé sur gélose au sang et sur milieu TSA

(Tryptone-soja-agar), après avoir fait un traitement thermique (80°C pendant 10min) pour

détruire les formes végétatives et sélectionner les endospores. Une série de dilution (de la

solution mère 1g dans 9 ml de l’eau physiologique, jusqu’ à la dilution 10-³) a été réalisée,

puis 100µl de l’inoculum sont ensemencés sur gélose au sang, ou bien TSA par étalement à

l’aide d’un râteau.

3.2. L’isolement à partir des racines végétales

-Les racines sont lavées trois fois avec de l’eau distillée stérile, séchées devant un bec

bunsen puis prélevées à l’aide d’une pince stérile et déposée sur milieu TSA.

4. les tests d’identifications au genre Bacillus

Les quatre critères recherchés, et jugés suffisants selon Gordon et al., (1973) et Claus

et Berkely, (1986) in (Bouali et al., 2016) sont vérifiées pour affirmer l’appartenance au

genre Bacillus :

- Réaction positive à la coloration de Gram

- formation de l’endospore par observation microscopique, grâce à sa réfringence à la lumière,

- la mobilité à l’état vital

- La catalase positive

4.1. La coloration de Gram

Des frottis de culture jeune sont réalisés et soumis à la coloration de Gram classique.

Les frottis colorés sont observés au microscope optique au grossissement x1000.


22

4.2. Le test de catalase

La catalase est une enzyme antioxydante qui convertit le peroxyde d’hydrogène en eau

et molécule d’oxygène.

H2O2 H2O + ½ O2

La technique de mise en évidence l’enzyme « catalase », qui caractérise les aérobies et les

aéro-anaérobies facultatives consiste à déposer une goutte de l’eau oxygénée a 10 volume sur

une petite quantité d’une culture bactérienne jeune. Le résultat positif se traduit par un

dégagement de gaz.

4.3. La mobilité

Le milieu mannitol mobilité, est utilisé pour tester la mobilité des souches. La mobilité

est un caractère morphologique du genre Bacillus. L’ensemencement du milieu a été effectué

par une piqûre centrale à l’aide d’une pipette pasteur, l’incubation se fait à 30°C pendant 24h.

La mobilité se traduit par une culture envahissante du milieu, alors que les souches immobiles

ne se développent qu’au niveau de la piqure.

5. Identification au groupe B. cereus

5.1. Croissance sur Chapman

La mise en évidence de l’absence de fermentation du mannitol et la présence de

l’enzyme lécithinase ont été réalisées sur milieux Chapman additionné d’émulsion de jaune

d’œuf, en remplacement du milieu Mossel. Le milieu Chapman permet en outre la mise en

évidence de l’halotolérance.

Le groupe B. cereus est caractérisé par l’absence de fermentation du mannitol, et la

production de lécithinase, pour tester les souches isolées, on réalise un ensemencement par

strie sur milieu Chapman supplémenté d’une émulation de jaune d’œuf. L’incubation à 30°C

pondant 24h et 72h. La croissance sur Chapman se traduit par la présence des colonies, et la

production de lécithinase se traduit par la formation d’un halo clair tous autour de la strie.

5.2. Vérification de l’activité hémolytique

La vérification de l’activité hémolytique a été réalisée sur gélose au sang par

ensemencement d’une strie, pour tester l’activité hémolytique des souches racinaires, et les

souches isolées sur TSA.


23

5.3. L’identification par galerie Api 20E

L’identification du groupe B. cereus par galerie Api 20E concerne que les douze

premiers caractères. Le mode d’inoculation de la galerie Api est comme suit :

-Préparation de la galerie

-préparation de l’inoculum : à l’aide d’une pipette pasteur, on prend une ou deux colonies à

partir d’une boite gélosée de 24h, et on prépare des suspensions dans 5 ml de l’eau

physiologique stérile, dont la DO est comprise entre 0.6 et 0.8.

-l’inoculation de la galerie selon le protocole galerie Api 20E.

6. Etude du pouvoir PGP in vitro

Les propriétés stimulatrices de la croissance des plantes étudiées comprennent la

production d’enzymes extracellulaires (proétases, et amylases), la prodcution d’hormone de

croissance (acide indole acétique), la solubilisation du phosphate, l’activité antagoniste et le

pouvoir de colonisation du système racinaire par l’évaluation de la formation de biofilm.

6.1. La production d’enzymes

6.1.1. Détermination de l’activité protéolytique

L’activité protéolytique a été a été étudiée sur gélose nutritive contenant 5% de lait

écrémé. Après 48 heures d’incubation à 30°C, la présence de cette activité est détectée par un

halo clair autour de la strie indiquant l’hydrolyse de la caséine, par contre un résultat négatif

ne montre aucune zone d’hydrolyse autour de la culture (Marchand et al., 2009).

6.1.2. Détermination de l’activité amylolytique

La mise en évidence l’activité amylolytique est réalisée sur gélose nutritif contenant

1% de l’amidon soluble. L’ensemencement par strie a été réalisé, puis l’incubation à 30°C.

Après l’obtention d’une bonne culture la gélose a été recouverte d’une solution de Lugol.

L’hydrolyse de l’amidon se traduit par l’apparition d’une zone claire autour de la colonie, par

contre un résultat négatif se traduit par une couleur brune autour de la culture (Gupta et al.,

2004).

6.2. La production de l’acide indole acétique

La production de l’acide indole acétique est mise en évidence sur milieu TSB

additionné de 1g/l du tryptophane comme seule source de carbone, selon la technique de


24

(Etesami et al., 2015). Le milieu est inoculé par 100µl d’une culture bactérienne de 24h et

incubé pendant 72h à 30°C. Après incubation, les cultures sont centrifugées à 5000 rpm/

20min. Un volume de 1ml de surnageant est mélangé à 1ml du réactif de Salkowski (50 ml,

35% de l’acide sulfurique H₂SO₄, 1 ml de la solution du chlorure férique 0.5 M FeCl₃). La

présence de l’acide indole acétique est indiquée par l’apparition de la couleur rose (Goswami

et al., 2014).

6.3. La solubilisation du phosphate

La capacité de solubilisation des phosphates est réalisée selon la technique décrite

par(Beneduzi et al., 2008) sur milieu glucose TGEA (tryptone glucose extractagare). Les

deux autres solutions ont été préparées séparément ; On dissout d'abord 5 g de K2HP04 dans

50 ml d'eau distillée et ensuite 10 g de CaCl2 dans 100 ml d'eau distillée. Ces deux solutions

ont été ajoutées à 1 L de TGEA. Un volume de 10μl de chaque culture bactérienne de 24h est

déposé à la surface du milieu puis incubé à 30°C pendant 5 à 7 jours, la solubilisation des

phosphates se traduit par un halo clair autour de la colonie(Bouali et al., 2016).

6.4. L’activité antagoniste

6.4.1. L’activité antifongique

L’activité antifongique est testée sur milieu PDA (Potato-Dextrose- Agar), et sur

milieu TSA. Les agents pathogènes (champignon), sont isolées : à partir d’une feuille d’un

citronnier ayant une apparence de brûlée. Le champignon responsable de cette altération, est

identifié par un examen macroscopique(Souza et al., 2017).

Le test de l’antagonisme est réalisé comme suit :

-La souche de B. cereus est ensemencée par une strie centrale sur milieu PDA ou TSA, et

incubée à 30°C pendant 48h.

-A l’issue de ce délai, on dépose à une distance de 2,5 cm, un disque de champignon mature

de 7 jours ; puis on ré-incube à 30°C pendant 7à 10 jours.

Une boite témoin est ensemencée par le disque de champignon seul sans la strie de l’agent

antagoniste.


25

6.4.2. L’activité antibactérienne

L’activité antibactérienne est également un des caractères PGP phyto-protecteur, le

test est réalisé sur milieu TSA, et vérifié sur milieu Muller Hinton, par ensemencement d’une

strie centrale de la souche antagoniste et, incubation à 30°C pondant 24h. Après incubation on

ensemence par strie les 3 souches (Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa),

obtenus par Mr. Belyagoubi, et on réincube à 30°C pondant 24h. Le résultat positif se traduit

par l’apparition d’une zone d’inhibition.

6.5. La formation de biofilm

6.5.1. La formation de biofilm sur microplaque de titration : 96 puits

La formation de biofilm a été réalisée selon la technique d’O’toole (O’Toole, 2011)

-sur milieu TSB on prépare une culture bactérienne à partir d’un milieu gélosé, incubation à

30°Cpendant 24h. Après incubation on mesure la DO qui doit être entre 0,6-0,8.

-les puits sont remplit avec 150µl de l’inoculum, puis incuber pendant 24h, à quatre

température différente 4°C, 30°C, 37°C et 42°C.

-Après incubation, les puits sont vidés, et rincés 3 fois à l’eau pour éliminer les cellules libres

ou faiblement attachées. Les microplaques sont ensuite, séchées en position renversée puis

colorées avec une solution de cristal violet à 0,1% pendant 30 mn, puis lavées avec de l’eau

pour éliminer les résidus du colorant.

6.5.1.1. Lecture des microplaques sur lecteur ELISA

La lecture des microplaques a pour but de quantifier la formation de biofilm ; pour

réaliser cette lecture, on remplit les puits avec de l’acide acétique à 33%.

Figure 9 : les microplaques colorées au cristal violet et rempli du solvant d’extraction.

30°C 37 °C 45 ° C


26

6.5.2. La formation de biofilm sur des feuilles végétales autoclavées

- Des feuilles d’un oranger sain sont envelopper dans du papier d’aluminium, et autoclavées

pour les stériliser.

-Les feuilles ainsi stérilisées sont placées dans des boites de pétri ; puis inoculées par 150µl

d’une pré-culture de 18h dans le milieu TSB, après avoir délimité la zone de l’inoculum.

-Les feuilles bactérisées sont incubées à 30°C pendant 24h. Après incubation, les feuilles sont

lavées laver les feuilles avec de l’EDS, puis écouvillonnées. L’écouvillon contaminé est

plongé dans un bouillon nutritif, bien vortexé pour détacher les bactéries de l’écouvillon ; puis

prendre 150µl du BN et ensemencer une gélose nutritive par étalement à l’aide d’un râteau ; et

incuber à 30°C pendant 24h.

6.5.3. La formation de biofilm sur feuilles traitées par un désinfectant

Pour former le biofilm sur un tissu végétal le protocole suivant est adopté :

-couper les feuilles en carré de 2cm², et plonger les dans un premier temps dans un bécher qui

contient de l’alcool, pour les désinfecter, puis dans l’eau distillé stérile, pour les rincer.

-récupérer les feuilles à l’aide d’une pince stérile, les mettre dans une boite de pétri, et les

laisser séchés devant un bec bunsen.

-les feuilles sont ensemencées avec 100µl de l’inoculum de 24h, ajusté à une DO comprise

entre 06-08, puis elles sont incubées à 30°C pondent 20h.

-écouvillonner les feuilles, puis plonger l’écouvillon dans un bouillon nutritif, bien agiter au

vortex pour détacher les bactéries de l’écouvillon ; prendre 100µl du bouillon nutritif et

ensemencer une gélose nutritive par étalement à l’aide d’un râteau, et enfin incuber à 30°C

pendant 24h.

6.6. Mesure de l’hydrophobicité des spores de B. cereus

6.6.1. Préparation des suspensions sporales

L’hydrophobicité est une propriété importante de la surface des spores de B. cereus,

qui a une relation étroite avec leur pouvoir d’adhésion aux surfaces inertes (Malek et al.,

2013). Pour cela des suspensions sporales sont préparées dans l’eau distillée stérile. Les

souches testées sont d’abord ensemencées sur gélose nutritive par des stries serrées, pour

avoir un tapis microbien dense et homogène. L’incubation se fait à 30°C jusqu’à ce que le


27

taux de sporulation atteigne les 90% (le temps d’incubation se varie de 5 à 7

jours)(Simmonds et al., 2003). Le taux de sporulation est vérifié par un examen

microscopique de frottis colorés à la fushine. La récupération des spores se fait comme suit :

devant un bec bunsen, inonder la boite de pétri avec de l’eau distiller stérile, racler la culture

bactérienne à l’aide d’un râteau et récupérer la suspension dans un bécher stérile, puis verser

le contenu dans un tube stérile.

Les suspensions sporales ainsi obtenues sont centrifugées trois fois à 2000 g pendant

20 min, le surnageant est remplacé à chaque fois avec de l’eau distillé stérile. Ces opérations

sont terminées par un traitement thermique à 80°C pendant 10min, qui permet d’éliminer les

formes végétatives. Les suspensions sporales sont conservées à 4 °C jusqu’à leur utilisation.

6.6.2. La technique MATH

L’adhésion microbienne au solvant ou technique MATH : microbial adhesion to

solvent(Faille et al., 2002), a pour but de déterminer l’hydrophobicité de la surface des

cellules bactériennes, par mesure de leur affinité à l’hexadécane. Le protocole utilisé pour

mesure cette propriété de surface chez les spores des souches de B. cereus, est décrit dans

Malek (2013).

-dans un tube à hémolyse : prendre 2ml de la suspension sporale dont la DO à 590 nm est

comprise entre 0.6-0.8 et lui rajouter 400µl du solvant apolaire l’hexadécane.

-le mélange est vortexé, pendant de 30 secondes, pour obtenir une émulsion.

-Le mélange subit une décantation pendant 15 min pour l'obtention de deux phases séparées,

et une mesure de la densité optique de la phase aqueuse est réalisée dans un colorimètre à

590nm.

-Le pourcentage d'adhésion au solvant est alors donné par la relation suivante :

A (%) = (Di-Df) / fDi x 100

Di: représente la densité optique initiale,

Df: représente la densité optique de la phase aqueuse après décantation finale,

A(%) : 20˂hydrophyle˂40-60 hydrophobe˃60˂ hautement hydrophobe.


28

7. Détermination du pouvoir PGP in planta

La détermination du potentiel PGP chez les souches de B. cereus isolés, a permis de

choisir les souches les plus actives pour les essais in-vivo, sur des cultures en pot (la souche

isolée à partir de l’échantillon 3 « S11E3 », et la souche isolée à partir de l’échantillon 5 «

S23E5 »). Le persil a été choisi comme matériel végétal à tester.

7.1. La culture des graines de persil

7.1.1. Matériel végétal

Les graines de persil sont désinfectées et semées selon la technique décrite par

Daayf,1993, avec quelques modifications. Les graines sont lavées à l’hydrochlorite de sodium

à 15% pendant 30 secondes, puis elles sont placées dans les suspensions sporales des souches

à tester (une souche productrice de l’acide indole acétique, et une souche qui solubilise le

phosphate). Les graines ainsi contaminées sont placées dans des pots contenant de la terre

tamisée et stérilisée à 120°C pendant 1 heure, deux fois à 24 heures d’intervalle. La

croissance se fait à la température ambiante. Un témoin négatif consiste en l’utilisation de la

même culture dans les conditions de croissance normale.

7.1.2. L’inoculation du sol des pots

Les pots semés ont été arrosés par une culture de 3 jours de B. cereus dans le milieu

TSB contenant de tryptophane à 1g/L.

7.2. Test du pouvoir antagoniste

L’antagonisme a été étudié chez une souche de B. cereus isolés des racines de la

citronnier (Sr01), contre une souche fongique appartenant au genre Rhizopus isolé au niveau

des feuilles de la même arbre.

7.2.1. Matériel végétal

Les graines de tomate sont désinfectées pendant 30 secondes avec de l’hydrochlorite

de sodium à 15%, semées dans le sol stérile, et la croissance se fait à la température ambiante,

(Daayf, 1993) in Bensaleh.


29

7.2.2. Préparation de l’inoculum de la souche B. cereus antagoniste

La souche de B. cereus est ensemencée dans le milieu TSB pour avoir une culture jeune de 24

h. la charge microbienne est déterminée par un colorimètre et la densité optique à 590 nm est

ajustée à 0.8 (Aleysinghe,2007).

7.2.3. Préparation de la suspension de spores de Rhisopus

La suspension est récupérée selon la technique décrite par Essalmani et Lahloo, 2003,

avec des modifications adaptées. La suspension des spores est obtenue après grattage de la

surface de la culture du champignon de 15 jours sur milieu PDA, et mélangé à l’eau distillé.

Après agitation, le mélange est filtré sur papier filtre.

7.2.4. Mode de l’inoculation

Après apparition des quatre premières feuilles vraies, la jeune plantule est

délicatement déterrée puis trempées pendant 30 minutes dans une suspension de Bacillus

selon Stall et walter (1966) ; elle est ensuite repiquée dans son pot. Après 48h, la plantule

traitées et trempée dans une suspension de Rhisopus pendant 30minutes. Une plantule témoin

positif trempée dans l’inoculum pathogène sans la bactérisassions bénéfique de la souche de

B. cereus. Une plantule témoin négatif trempée dans de l’eau distillé

Résultats et

discussions

Résultats et discussion

30

1. Caractéristiques du sol

Le pH du sol est une propriété chimique qui influe sur les microorganismes. Les

résultats de la mesure du pH des sols étudiés sont donnés dans le tableau 2. Les valeurs de pH

des sol cultivés et non cultivés varient entre 8 et 8,33 à l’exception du sol de l’échantillon de

la rhizosphère du romarin dont le pH est relativement acide (6,20) et qui a une apparence

jaunâtre et contient des cendres d’origine végétale. Les résultats obtenus ont été comparés à

un tableau de référence (tableau 1).

Tableau 1 : Echelle d’interprétation de l’acidité du sol (Baize, 2000).

PH Sol

˂3,5 Hyper acide

3,5-5 Très acide

5-6,5 Acide

6,5-7,5 Neutre

7,5-8,5 Basique

˃8,5 Très basique

Tableau 2 : Résultats de la mesure du pH du sol

L’échantillon PH Apparence Interprétation

ECJ1 8,20 Maron Basique

E R J2 6,20 Jaunâtre Relativement acide

ESTM3 8,00 Maron pale Basique

EHM4 8,30 Maron foncer Basique

EAM5 8,33 Maron foncer Basique

E : échantillon S : sapin H : herbe

C : citronnier T : Thymus A : amende

J : jardin M : montagne

2. Isolement et identification de souches Bacillus

Les techniques et les milieux de culture utilisés, le milieu TSA et la gélose au sang ont

permis l’isolement de 28 souches bactériennes à partir des sols rhizosphériques et des racines

végétales (tableau 3). Sept souches ont été isolées à partir de la rhizosphère du citronnier,


31

trois souches à partir de la rhizosphère du romarin, neuf souches à partir de la rhizosphère de

sapin, deux souches à partir de la rhizosphère des mauvaises herbes, et deux à partir de celle

de l’amandier.

Les souches se développant en biofilm sur le système racinaire, sont isolées par simple

diffusion à partir des racines végétales préalablement lavées et déposées à la surface de la

gélose TSA (figure 11 c). De chaque échantillon on a pu isoler une souche formant des

colonies dont l’aspect est homogène, miel, et envahissant (Figure 11). L’isolement des

souches sur gélose au sang permet de mettre en évidence le pouvoir hémolytique des souches

appartenant au genre Bacillus notamment le groupe B. cereus.

Figure 10 : Aspect des colonies de Bacillus sur gélose au sang (A) et sur milieu TSA (B et

C).

La souche racinaire 2 isolé du biofilm de la racine de romarin a montré, sur gélose au

sang un aspect cultural particulier, caractérisé par l’envahissement de la gélose, suggérant un

mode de mobilité de type swarmingou déplacement en groupe.

SrE02.

Figure 11 : observation macroscopique de la souche racinaire du romarin (Sr2) (swarming

mobilité).

Les bactéries sporuleés appartenant à Bacillus et au genres proches sont des

représentants importants du sol, ils font de la flore PGP (Ding et al., 2016)en particulier le

groupe B. cereus.


32

3. Identification au genre Bacillus

Les résultats des tests d’identification sont résumés dans les tableau 3, qui contient les

critères d’orientation vers le genre Bacillus à savoir une réaction positive à la coloration de

Gram, la présence des endospores, la présence de la catalase, et la mobilité.

La coloration de Gram est un test d’identification rapide, qui a permis de montrer des

bâtonnets, Grams positifs, avec différents modes de regroupement (figure 12), possédant des

endospores, et pouvant être identifiés au genre Bacillus. Les résultats du test de la catalase ont

montré que, sur vingt-huit souches testées, quatre souches sont catalase plus ou moins

négative, et les autres souches testées sont catalase positive. Concernant le caractère mobilité :

toutes les souches testées sont mobiles à part une qui s’est montrée immobile.

Figure 12 : observation microscopique des souches après une coloration de Gram (G=10x

100).

4.Identification au groupe B. cereus

Selon la normes Afnor (2005), les critères phénotypiques d’identification au groupe B.

cereus comprennent l’absence de fermentation du mannitol par B. cereus, la présence d'une

lecithinase chez la majorité des souches de B. cereus, la présence de polymixine B à 10 mg/L,

permet une sélectivité satisfaisante, mis en évidence sur milieu Mossel complet. L’utilisation

du milieu Chapman au jaune d’œuf dans la présente étude a permis d’obtenir des colonies

rugueuses, sèches, avec un fond coloré de rose à pourpre, donc mannitol négative et entourées

d’un halo clair indiquant la production de lécithinase (figure14). L’activité hémolytique, mise

en évidence sur gélose au sang, permis de différencier le groupe B. cereus des autre Bacilles

(Figure 15). L’ensemble de ces critères permet d’identifier les souches isolées au groupe B.

cereus. En outre la croissance sur milieu Chapman, nous a permis de montrer le caractère

halotolérant des souches isolées.


33

Tableau3 : Résultats d’identification au genre Bacillus isoler à partir du sol cultivé et non

cultivé.

Type de

sol

Type des

colonies

Aspect des

colonies

Nombre de

souches

Gram et

endospore

Catalase Mobilité

Sol

cultivé

du jardin

Envahissante Verdâtre et

bombé

7 + + +

Petite Blanchâtre

Et rende

1 + - +

Envahissante

ver les

périphériques

Verdâtre et

plate

3 + + +

Envahissante Miel

irrégulière

2 + + ++

Sol non

cultivé de

la

montagne

Envahissante Verdâtre et

bembé

2 + + +

Envahissante

ver les

périphériques

Verdâtre et

plate

5 + ++ +

Ronde et

petite

Miel 2 + + ++

Irrégulière et

envahissante

Miel 3 + + ++

Envahissant Blanchâtre

3 + + +

S : souche r : racine E : échantillon

Figure 13 : Mise en évidence de la production de lécithinase sur milieu Chapman à

l’émulsion de jaune d’œuf.


34

Figure 14 : Mise en évidence de l’activité hémolytique des souches testé (A : gélose au sang

neuf).

4.1. Détermination du biotype

L’identification au sein du groupe B. cereus par la galerie Api 20 E, ne prend en

considération que les douze premiers caractères. Les résultats obtenus ont été résumé dans le

tableau 4 ; et figure15. D’après ces résultats, la souche isolée à partir du sol, (S11E3) est

identifiée comme B. thuringensis, et la souche isolée à partir de la racine du romarin (Sr2) a

été identifiée à l’espèce Enterobacter aerogènes.

Tableau 4 : les résultats d’identification par galerie Api 20E

Figure 15 : Résultats d’identification par galerie Api 20E, (1 : S13E3, 2 : SrE2).

5.1. La production d’enzyme : l’activité amylolytique et protéolytique

Les souches isolées ont montré une bonne capacité protéolytique, et amylolytique,

(figure 16), les caractéristiques des sites de prélèvement (sol 1 du jardin, arrosé par l’eau de

rinçage des fruit et légumes, le sol 2 qui contient de la matière organique, et les sols 3,4 et 5

qui contiennent les feuilles des arbres morte en décomposition, ont influencé les caractères

métaboliques des souches. Les résultats sont en conformité avec S.Umayaparvathi et al.,

(2013), qui ont trouvé que les souches B. cereus sont caractérisées par une grande activité

protéolytique.


35

Figure 16 : l’activité amynolytique (A et B) et protéolytique (C) des souches.

L’ensemble des résultats portant sur les caractères stimulateurs de la croissance des

plantes sont résumés dans le tableau 5.

5.2. La production de l’acide indole acétique et la solubilisation du phosphate

Les résultats obtenus montrent que le groupe B. cereus a la capacité de produire de

l’AIA (une phytohormone qui accélère la croissance des racines). En effet neuf souches sur

vingt-huit produisent cette phytohormone, dans des proportions différentes (figure 17).

Juniore et al., (2015) ; ont montré que le genre Bacillus a la capacité de produire l’AIA

synthétisé à partir du tryptophane. L’effet de l'IAA dépend de la concentration. A faibles

concentrations, l’IAA exogène peut favoriser la croissance des racines, tandis que de fortes

concentrations peuvent l’inhiber (Deepak,2011). La solubilisation du phosphate par les

souches B. cereus isolées se traduit par la formation d’un halo claire au tour de la culture

bactérienne, comme montré par(Maheswar et Sathiyavani, 2012). Tandis que, comme le

montre la figure 18, la production de l’AIA, se traduit par l’apparition d’une coloration rose

due à la réaction de l’acide indole acétique synthétisé par la souche avec le réactif de

Salkowski(Goswamiet al., 2014).

Figure 17 : la production de AIA et la solubilisation du phosphate par B. cereus.


36

Tableau 5 : Propriétés stimulatrice de la croissance des plantes des souches isolées.

Souches Activité

protéolytique

Activité

amylolytique

La

production

de AIA

Solubilisation

de phosphate

S1E1, S2E1 ++ + - -

S3E1 -envahissante + + -

S4E1,

S18E1

- envahissante - - -

S5E1 - ++ + -

S6E2 + + - +

S7E2 + ++ + +

S8E2,

S14E3

- - - +

S9E3 - + + +

S10E3,

S11E3

+ ++ + +

S12E3 ++ ++ - +

S13E3 + ++ + +

S15E3 + - + +

S16E3 - - ++ -

S17E1 - + - +

S19E1,

S20E4

+ + - ++

S21E4 + +++ - +

S22E5,

SrE3

++ + - +

S23E5 ++ + - +

SrE1 + +++ - +

SrE2 - + faible - -

SrE4 + - - +

SrE5 + + - -

S : souche E : échantillon r : racine 1-23 : nombre de la souche AIA : acide indole

acétique. Le symbole (+) : il y a une activité ; le symbole (-) : il n’y a pas une activité.


37

5.3. L’activité antagoniste

L’activité antagoniste (tableau 6), des souches est testée pour un effet antibactérien

(figure18), et un effet antifongique (figure19). L’effet antagoniste des souches B. cereus s’est

traduit aussi bien par un pouvoir de colonisation, au détriment des souches de staphylococcus

et Klebsiella, que par une faible inhibition à l’égard des souches de Staphylococcus. En

revanche une activité antifongique sur milieu PDA, contre le champignon Rhizopus isolé à

partir d’une feuille brulée, a été observée chez une souche isolée de la rhizosphère du même

arbre. Cette souche (Sr01), a pu inhiber ce champignon connu par sa forte pathogénicité et qui

provoque la pouriture des fruits (Nicoué et al., 2004).

Tableau 6 : Résultats de l’antagonisme antibactérien.

Souches B.

cereus

Nombres de

souches

Codes des

souches

Staphylocoqu

e

Klebsiella Pseudomonas

Zone

d’inhibition

8 S7E2, S9E3,

S11E3, S12E3,

S13E3, S20E4,

Sr2, S21E4.

8 0 0

Colonisation 7 S8E2, S10E3,

S17E1, S21E4,

S22E5.

4 3 0

S : souche E : échantillon

Figure 18 : Antagonisme de B. cereus à l’égard de souches de Pseudomonas (A : control

positif ; B : une colonisation ; C : inhibition).

Figure 19 : Antagonisme antifongique de la souche B. cereus SR1, contre Rhizopus (1témoin

positif et 2 témoin négative).


38

5.4. La formation de biofilm

La plupart des souches de B. cereus isolé du sol n’ont pas pu former un bon biofilm

dans les microplaques de titration. Ceci peut être dû à une incapacité à adhérer au polystyrène,

comme démonté par (Karunakaran and Biggs, 2011), chez des souches de B. cereus. Par

contre toutes les souches isolées du système racinaire sont caractérisées par un bon potentiel

de formation du biofilm sur les parois des puits des microplaques (figure 21). La formation de

biofilm se traduit par la présence d’un anneau à la surface du puits, après coloration au cristal

violet à 1%.

Figure 20 : la formation de biofilm sur microplaque de titration selon la technique décrit par

O’toole 2011.

La formation de biofilm est influencée par la température d’incubation, tel que montré

par la figure 21 et le tableau 7. La température s’influencer sur le rapport d’attraction des

cellules végétales et des spores (Ryu et Beuchat, 2005).

La formation de biofilm sur un tissus végétal a pour but de tester le potentiel de

colonisation du système racinaire des plantes par les PGPR en particulier B. cereus. Les

résultats ont montré que toutes les souches testées ont pu former un biofilm, que ce soit sur les

feuille désinfectées à l’alcool, ou sur les feuilles autoclavées (figure 21). La particularité de la

formation de biofilm sur les feuilles autoclavées, c’est que le milieu de culture n’a pas été

renouvelé, les souches se sont développées directement sur les feuilles, qui ont servi de source

de nutriments pour les bactéries.

4° C 30° C 37° C 45° C


39

Tableau 7 : détermination qualitative de la formation de biofilm

Souches Température

A 4°C A 30°C A 37°C A 45°C

Sr1 - ++ + Faible

Sr2 - + + +

Sr3 + +++ ++ +

Sr4 - ++ + -

Sr5 - + + ++

S1E1 - + + ++

S2E1 - - - -

S3E1 - + + Faible

S4E1 - + Faible -

S5E1 - - - -

S6E2 - - - -

S7E2 - + ++ +

S8E2 - - + -

S9E3 - - - -

S10E3 - + Faible -

S11E3 - ++ + +

S12E3 - - + -

S13E3 + ++ + -

S14E3 - - + -

S15E3 - + - -

S16E3 - ++ + Faible

S17E1 - Faible + -

S18E1 + Faible - -

S19E1 - - - -

S20E4 - - - -

S21E4 - +++ ++ -

S22E5 - ++ + +

S23E5 - - - -

Le symbole : (-)pas de formation de biofilm, (+) formation de biofilm, (++) plus au moins bon

formation de biofilm, (+++) bonne formation de biofilm.


40

Figure 21 : Formation de biofilm in-vivo sur des feuilles de plante.

La lecture des microplaques a été réalisé sur le lecteur ELISA, que pour les souches

racinaires, qui ont formées un bon biofilm (tableau 8). La densité optique à une valeur

maximal de 0,814 et une valeur minimale de 0,024. La plus pare des souches on put former un

bon biofilm à 30°C, à l’exception de la souche Sr01 leur rendement été meilleure à 45°C.

Tableau 8 : lecture des microplaques de titration

Souches

Biofilm

30°C

Biofilm

37°C

Biofilm

45°C

La mesure de la densité optique DO

Sr01 0,128 0,041 0,404

Sr02 0,054 0,079 0,040

Sr03 0,814 0,400 0,023

Sr04 0,129 0,067 0,060

Sr05 0,083 0,148 0,042

S21E04 0,084 0,089 0,076

S22E05 0,142 0,024 0,057

5.5. L’hydrophobicité de surface des spores B. cereus

L’hydrophobicité est un critère important dans la formation de biofilm (Vries et

al.,2004). L'hydrophobicité est exprimée par le pourcentage (P) d'adhérence à l'hexadécane.

Les spores sont dites très hydrophiles lorsque P <20%), hydrophiles (20> P <40%),

modérément hydrophobes (40> P <60%) et hautement hydrophobes (P> 60%)(Malek,

2016).D’après les résultats exprimés dans le tableau 9, on remarque que mis à part la souche

hydrophobes avec une valeur de 54,52%, toutes les souches analysées sont hydrophiles leurs

pourcentages d’adhésion à l’hexadécane variant entre 3,98% à 35,15%.


41

Tableau 9 : Résultat de l’hydrophobicité des souches.

Souches Hydrophobicité Critères

Sr02 17,22% Très hydrophile

S23 3,98% Très hydrophile

S18 54,52% Modéré hydrophobe

Sr01 33,04% Hydrophile

S21 35,15% Hydrophile

S04 13,94% Très hydrophile

S11 26,05% Hydrophile

Sr03 14,25% Très hydrophile

Le potentiel d'adhésion élevé des spores de B. cereus est lié à l'hydrophobicité de la

surface des spores qui repose sur des structures morphologiques, notamment l'exosporium et

les appendices (Wijmanet al., 2007). Les résultats indiquent que nos souches sont de

hydrophiles à modéré hydrophobes ; et le pH du sol mesuré est alcalin. Les spores de B.

cereus sont de nature hydrophobe, mais le stress alcalin conduisait à une diminution de

l'hydrophobicité de la surface des spores, selon (Malek, 2016).

6. Résultats des tests in planta

L’étude du potentiel PGP in planta visait à évaluer le potentiel de biocontrôle des

bactéries isolées à partir de différentes espèces de plantes et de sols(Mota et al., 2017)La

lecture des résultats de la culture en pots du persils, a été réalisé en trois temps : après 10

jours, 21 jours, et 45 jours de l’inoculation des pots. La première lecture : le pot inoculé avec

la souche productrice de l’acide indole acétique été le plus haut, et dans le pot inoculé avec la

souche qui solubilise le phosphate, le maximum des graines ont germé par rapport au témoin.

L’IAA exogène contrôle le développement et la croissance des plantes : de faibles

concentrations d'IAA peuvent stimuler l'élongation primaire des racines, tandis que des

niveaux élevés d'IAA le diminuent (Vacheron et al., 2013) ; et on remarque qu’à un certain

stade les plantules inoculées avec la souche (S11E3), ont arrêté de croitre.

Les résultats de l’activité antagoniste :

La souche (Sr1) a montré une activité in vitro contre le champignon Rhizopus, elle a

pu l’inhibé dans la plante. La plantule de tomate témoin positif a été desséchée après 5 jour


42

d’incubation, puis elle est morte. Par contre la plantule traitée, a résisté au champignon. Le

genre Bacillus a montré une forte activité phytoprotectrice contre les champignon, Kumar et

al., (2012).

Conclusion

Conclusion

44

Conclusion

Les micro-organismes en particulier les bactéries rhizosphérique connus sous le terme

de PGPR, ont un grand impact dans le domaine de l’agriculture. L’objectif globale de notre

travailles été de sélectionner à partir de la rhizosphère de différentes plantes et différents sols,

des bactérien sporulé « B. cereus », et de tester leur activité stimulatrice de la croissance des

végétaux.

Ce travail nous a permis d’identifier et de caractériser 28 souches appartenant au genre

Bacillus dont des souches été identifié au groupe B.cereus selon une approche phénotypique,

morphologique et biochimique. Les activités stimulatrices de la croissance des plantes ont été

étudié chez les souches isolé sont : la production de l’acide indole acétique (AIA), et la

solubilisation du phosphate, la production d’enzymes pour une activité amylolytique et

protéolytique, l’antagonisme bactérien et anti fongique, et enfin la formation de biofilm et

hydrophobicité des spores.

Les résultats in vitro montrent que neuf souches ont la capacité de produire la

phytohormone (AIA), dix-neuf souches ont pu solubiliser le phosphate, vingt souches ont une

activité amylolytique, seize souches ont une activité protéolytique, et dont l’intensité varie

d’une souche à l’autre. Un autre aspect important est le biocontrôle des agents

phytopathogènes : les souches isolées ont montré une capacité a colonisé l’agent pathogène

Staphylococus et Klebsiella. En revanche une soule souche appartient au groupe Bacillus

cereus a pu inhiber le champignon Rhizopus.

La formation de biofilms est influencée par le type de support inerte ou vivant

(polystyrène des microplaques de titration, ou tissu végétal vivant), et la température

d’incubation. L’étude de l’hydrophobicité des spores des 8 souches de B. cereus a révélé un

caractère majoritairement hydrophile.

La culture en pot permit de tester in vivo les souches isolées. Les résultats montrent

que le groupe B. cereus a un effet bénéfique en stimulant la croissance du persille et la tomate,

ou les protégant contre les agents pathogènes.

Au terme de ce travail qui ouvre plusieurs perspectives de recherche il serait

intéressant d’approfondir les investigations sur le groupe B. cereus de la région de Ain El

Houtz. Il serait intéressant de poursuivre la caractérisation de ces souches en réalisant d’autres

tests physiologiques et surtout moléculaires, ainsi que la caractérisation d’autres propriétés

Conclusion

45

stimulatrices de la croissance végétale telle que, la fixation d’azote, l’antagonisme

phytopathogène, et l’identificationdes métabolites actifs à effet inhibiteur, tels que la

production des sidérophores, la cyanogénèse (HCN), l’activité ACC désaminase, et le mieux

comprendre le pouvoir de colonisation qu’il a un effet direct et indirect sur la croissance des

plantes.

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Chemosphere 156, 312–325.

https://www.google.dz/search?q=la+germination+du+spore+bacillus+cereus&source=lnms&t

bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiRtuW0rrfbAhVShaYKHUxnAHUQ_AUICigB&biw.

https://www.google.dz/search?q=germination+bacillus+cereus&source=lnms&tbm=isch&sa=

X&ved=0ahUKEwje2mU2ODbAhVHfywKHRjbAW4Q_AUICigB&biw=1242&bih=557#i

mgrc=d1WFhq2JykKUGM

https://www.google.dz/search?q=la+germination+du+spore+bacillus+cereus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiRtuW0rrfbAhVShaYKHUxnAHUQ_AUICigB&biw

https://www.google.dz/search?q=la+germination+du+spore+bacillus+cereus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiRtuW0rrfbAhVShaYKHUxnAHUQ_AUICigB&biw

Annexes

Annexes

Annexe 01 : les milieux de cultures

L’eau physiologique :

Na cl 9g

Eau distillé 1000 ml

1. gélose au sang (base)

Mélange de peptone 16g

Extrait de levure 2g

D-glucose 0,5g

Chlorure de sodium 7g

Agar 12g

L'eau distilée 1000Ml

pH 7,3±0,2

2. TSA (Gélose Trypticase de soja)

Trypticase 17g

Soytone 3g

Chlorure de sodium 5g

Agar 15g

Eau distillée 1000Ml

pH 7,2

3. Gélose nutritif

Beef extrait 1g/l

Least extrait 2g/l

Peptone 5g/l

Sodium chloride 5g/l

Agar 15g/l

pH 6,8±0,2

Annexes

4.TSB (Bouillon Tryptone Soja)

Peptone 20g/l

Glucose 2,5g/l

Nacl 5g/l

4. Milieu Chapman

Peptone 11g/l

Extrait de viande 1g/l

NaCl 75g/l

Mannitol 10g/l

Rouge de phénol 0,025

Agar 15g/l

pH 7,5

5. Emulsion de jaune d’œuf :

Utiliser des œufs de poule, à coquille intacte, nettoyer les œufs avec une brosse à l'aide

d'un détergent liquide. Les rincer à l'eau courante, les planter dans l'alcool à 95 °C pendant 30

s et les sécher. En opérant de façon aseptique, casser chaque œuf et séparer les jaunes des

blancs par transferts du jaune d'une demi-coquille dans l'autre.

Placer les jaunes dans une éprouvette stérile et ajouter quatre parties en volume d'eau

stérile, transférer de façon aseptique dans un flacon stérile et mélanger vigoureusement. Porter

le mélange au bain d'eau réglé 45°C pendant 2h et entreposer entre 0°C et °C pendant 18h à

24h pour permettre au préccipité.

-Recueillie aseptiquement l'émulsion surnageante.

-L'émulsion peut être conservée entre 0°C et 5°C au maximum pendant 72h.

Annexes

Annexe 02: Code des souches

Code de souches Signification

S1E1, S2E1, S3E1, S4E1, S5E1, S17E1,

S18E, S19E1, Sr1

Les souches isolées à partir de l'échantillon

1 : la rhizosphère du citronnier quatre saison

S6E2, S7E2, S8E2 Les souches isolées à partir de l'échantillon

2 : la rhizosphère du romarin

S9E3, S10E3, S11E3, S12E3, S14E3,

S15E3, S16E3

Les souches isolées à partir de l'échantillon

3 : la rhizosphère d’un sapin associé à une

plante aromatique du genre Thymus

S20E4, S21E4 Les souches isolées à partir de l'échantillon

4 : la rhizosphère des mauvaises herbes au-

dessous d’un arbre

S22E5, S23E5 Les souches isolées à partir de l'échantillon

5 : la rhizosphère d’un amandier

S : souche E : échantillon.

Résumé

La flore bactérienne de la rhizosphère ou la flore PGPR est caractérisées par ses effets bénéfiques

sur la croissance des plantes et peut être utilisé en tant que biofertilisant et biopesticide. Dans le

cadre de ce mémoire, 28 souches été isolées puis, identifier au genre Bacillus dent au groupe B.

cereus, via une approche phénotypique (morphologique et biochimique). Les propriétés PGPR

analysés dans cette étude sont : la production de la phytohormone l’acide indole acétique (AIA),

la solubilisation du phosphate, la production d’enzymes amylolytique et protéolytique,

l’antagonisme bactérien et antifongique, la formation de biofilm et l’hydrophobicité des spores.

Les résultats montrent que neuf souches sont productrices de l’AIA, dix-neuf souches solubilisent

le phosphate, la plupart ont une activité enzymatique, deuze souches ont une activité

antibactérienne, une seule souche qu’inhibe le champignon Rhizopus. L’étude de la formation de

biofilm sur les feuilles d’oranger, et sur les microplaques de titration, a montré une colonisation

importante du tissu vivant comparé au polystyrène Les résultats révélait dans PGPR intéressantes

chez les souches caractérisées, elles sont confirmées par les essais in vivo. La bactérisassions des

gaines de persilles et des plantules de tomate ont montré des effets bénéfiques sur la croissance

des plantules cultivé en pot.

Mot clé : Bacillus cereus, sol, identification, PGP, biofilm, antagonisme.

Abstract

The bacterial flora of the rhizosphereor the PGPR flora ischaracterized by itsbeneficialeffects on

plant growth and can beused as a biofertilizer and good biopesticide. In the context of thispaper,

28 strainswereisolated and thenidentifiedwith the genus Bacillus tooth B. cereus group, via a

phenotypicapproach (morphological and biochemical). The PGPR propertiesanalyzed in

thisstudyare: phytohormone production indole aceticacid (AIA), phosphate solubilization,

amylolytic and proteolytic enzyme production, bacterial and antifungalantagonism, biofilm

formation, and hydrophobicity of the spores. The results show thatninestrainsproduce AIA,

nineteenstrainssolubilize phosphate, most have enzymaticactivity, twostrains have an

antibacterialactivity, a single strainthatinhibits the fungus Rhizopus. The study of biofilm

formation on orange leaves, and on titration microplates, showed a significantcolonization of

living tissue compared to polystyrene. The resultsrevealed in PGPR of interest in the

characterizedstrains, they are confirmed by the tests in vivo. The bacterization of parsleysheaths

and tomatoseedlingsshowedbeneficialeffects on the growth of seedlingsgrown in pots. Key word :

Bacillus cereus, soil, identification, PGP, biofilm, antagonism.

ملخص

. ومبيدات حيويةالموجودة في طبقة الريزوسفير للنبات تتميز بأثارها المفيدة على نمو النباتات. يمكن استخدامها كمخصبات البكتيريا

سلالة من نوع بسيلوس من بينها نوع بسيلوس سيريوس. خصائص هذه البكتيريا تم تحليلها في هذه 28تم عزل ا العملفي سياق هذ

اذابة الفوسفات, انتاج انزيمات محللة البروتين و النشاء, العداء ضد اسيد اندول اسيتيك ,الدراسة هي قدرتها على انتاج هرمون نباتي

على انتاج سلالات اهم القدرة 9وتشكل البيوفيلم, وأخيرا كره الماء من طرف الجراثيم. اظهرت النتائج ان ’ البكتيريا و الفطريات

اهم نشاط مضاد للجراثيم الا سلالة واحدة 12انزيمي, سلالة لها القدرة على اذابة الفوسفور , الأغلبية لديهم نشاط 19الهرمون,

مضادة للفطر. دراسة تشكل البيوفيلم على أوراق البرتقال و البوليستيران أظهرت ان السلالة لها القدرة على احتلال الانسجة الحية.

الطماطم أظهرت اثار وشتلات لبقدونس عليها في الجسم الحي. البكتيريا الموضوعة في بذور ا ةالنتائج المتحصل عليها تم المصادق

مفيدة على نمو الشتلات المزروعة في الاصيص.

بسيلوس سيريوس, بيوفيلم, العداء, نمو النبات. الكلمات المفتاحية تحديد السلالات,

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