Assemblage des protéines de réserve des graines ... · Assemblage des protéines de réserve :...
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De la graine au modèle acellulaire
Assemblage des protéines de réserve des graines :corpuscules protéiques et vésicules de stockage
INRA Nantes
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Prepro-protein
Mature storage protein complex
Biosynthesis
Assembly
TranscriptionDNA
mRNATranslation
Post-translationalModifications
Folding
Oligomerization
Pro-protein
N-terminal signal cleavage
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Protein subunits
Mature protein complex
Assembly GeneticsEcophysiology?
Wheat
protein network
dough rheology
Rapeseed Pea
millingproperties
grain fractionation
food/feed properties
endosperm texture
molecular farming
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Les Prolamines
protéines de réserve du grain de blé
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type y 650 res.
1 or 3 SS intertype x 800 res.
1Dx 5 827 res2 or 4 SS inter
.
LMW 250 - 300 res 2 SS inter
.
γ type 250 - 300 res 4 SS intra
α type 250 - 270 res 3 SS intra
ω type 340-420 res 0 S
HMW gluteninsgliadins
Q G P
Q P
Q P
Q P
Q P
Q G P
Q G P
S-ri
chH
MW
S-p
oor
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Low concentration2 µg /mL
High concentration200 µg /mL
STM images of γ-gliadinThomson et al., 1992
Masci et al., 1998
9 x3 nm
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1 nm Parchment et al., 2001
Computer modelling ofHMW glutenin subunit
and detail of therepetitive domain
Kasarda, 1994
50 x 2 nm
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100 nm 450 nm
Humphris et al., 2000
AFM of reduced and alkylated subunit 1Dx5.
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LMW
x-type
y-type
1Dx5
LMW
y-type
LMW
LMW x-type
x-type
HMW?
y-type
y-type
?
Hypothetical structure of wheat glutenin polymers
Shewry et al., 2002
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McMaster et al., 2000
A-gliadin fibrilsAFM images of gliadins
1:1 blend of α-and ω−gliadins
McMaster et al., 1999
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Les protéines de réserve
des graines de dicotylédones
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Asn Gln6360 000Globulines11S
Asn Gln3160 000Globulines
7S
Gln Pro1 ou 21250014500
Albumines2S
AASUMM
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Post-translational cleavage of pea legumin and vicilin
H2N COOH 60 000
40 00020 000
SS
α + β
αβ
H2N COOH50 000
α + β + γ
α + β
γ
αβ
33 000
19 000
16 00013 500
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Polymorphisme des 12S
980 spotsImmunoblotting et Spectrométrie de Masse
3 10 57 spots correspondantaux polypeptides alpha
15 spots correspondantaux polypeptides béta
Forte variabilité despolypeptides alpha
6 fois plus de polypeptidesque de gènes
Nombreuses modificationspost traductionnelles
10 gènes identifiés portés par 4chromosomes
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9.5 nm
4 nm
11S soybean globulin hexamer
Adachi M. et al.,2001, 2003
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alpha chain beta chain
2S rapeseed albumin
s 1 2 3 4 5 6 7 8
Rh ~ 2nm
alpha beta
hydrophobic aa
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Formation des organitesde stockage dans les graines
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Matsuoka and Bednarek, 1998
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Location of zein components in maize protein bodyColeman and Larkins, 1999
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Accumulation of modified 10Kd Zein in transgenic tobacco leavesRandall et al., 2000
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PBs in Maturing α,α’-Conglycinin-Cosuppressing Soybeans.OB, oil body; PB, protein body; PSV, protein storage vacuole; V, vacuole.
A. J. Kinney, R. Jung, and E. M. Herman, 2001SOJA
glycinin labelled PBs
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Accumulation of pea legumin in transgenic wheat endosperm
Stöger et al., 2001
500 nm 100 nm
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Systèmeacellulaire
SystèmebiomimétiqueGraine
BléBléBléPois
Structures moléculaires etsupra moléculaires
Blé ColzaPoisComposition
Organisation des entitésparticulaires
BléMécanismesphysicochimiques
BléBléDomaines structurauximpliqués
Interactions entremacromolécules
BléBlé ColzaPoisMécanismes biologiques
BléLocalisation des différentsconstituants
Questions et approchesPolym
orphisme génétique
Modifications post-traductionnelles
Environnement cellulaire
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Assemblage des protéines deréserve : étude de graines
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Assemblage des protéines de réserve : approchesur graines in vivo
Analyse des graines en cours de développement
Ultrastructure, localisation, co-localisation(immunomarquage)
Isolement et caractérisation de corpuscules protéiquespar fractionnement subcellulaire
Obtention de CP pour caractérisation fine, analyseprotéomique
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Analyse des grains en cours de développement
Variété RécitalCulture menée sous serre (Inra Rennes, Le Rheu)Etiquetage des épis à la date de floraison
Approche menée sur blé
Triboï et al., J. Exp. Bot., 54 (2003) 1731-1742
Collection de grains à différents stades de développement :de 35°C. j à 770 °C. j soit 1 à 45 DAP
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Immunolocalisation des prolamines au MET
158°C. j (X 10 000) 245 °C. j (X 10 000)
Identification de corpuscules protéiques à partir de91°Cj - 158 °Cj soit 4-8 JAF
Diamètre des CP : 0.5 à 2.5 µm
Coupes de grains en développementImmunolocalisation spécifique des différentes prolamines
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Co-localisation : présence de Gliadines et Gluténines dans lesmêmes CP ?
Informations sur le passage CP - matrice protéique ?
Projets
Immunolocalisation des prolamines au MET
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Isolement et caractérisation de corpuscules protéiques
Approches menées sur blé (2004) , pois (2005)
Etude directe des fractions
imagerie par microscopie (MET)
autres imageries ? Spectroscopie ?
Enrichissement en protéines de réserve pouranalyses immunochimiques ou biochimiques
Protéomique des CP
Caractérisation physico-chimique du contenu (état depolymérisation des prolamines par SE-HPLC)
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Grain de blé en coursde développement
Broyage au mortier dans un milieu refroidi à 4°Ccontenant un osmoticum (saccharose 10%) pour
préserver l'intégrité des CP
Elimination des gros débris par filtration sur gaze
Dépôt sur gradient de densité (NycodenzTM) et ultracentrifugation
(18 heures, 275 000 g)
Différentes fractionscontenant descorpuscules
protéiques isolés
Principe du fractionnement subcellulaire
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Enrichissement des fractions en prolamines
Solubilisation des prolamines : 70% EtOH, 1% β-mercaptoéthanol, 60°C
(destruction des CP)
Différentes fractions contenant descorpuscules protéiques isolés
Centrifugation (3000g, 20 min)
Elimination du culot
Précipitation des prolamines ( 0.3M NaCl, 4°C)
Fractions enrichies enprolamines solubilisées
Fractions enrichies enprolamines précipitées
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0
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0F ra c t io n s
Act
ivité
enz
ymat
ique
(UA
Fractionnement subcellulaire sur blé (19 DAA)
St Ext. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SU Gluténines HPM
Gliadines
SU Gluténines FPM
Activité enzymatique de laNADH-cytochrome Creductase (marqueur du RE)
Fractions enrichies en prolamines
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Gliadins distribution at 31 DAA
0
10
20
30
40
50
60
70
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
Fractions
Prot
ein
dist
ribu
tion
(%) Alpha/Beta Gliadins
Gamma Gliadins
Omega Gliadins
Analyse immunochimique de la composition enprolamines : gliadines
Gamma Gliadins
0
100
200
300
400
500
600
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
Fractions
Prot
ein
accu
mul
atio
n (µ
g)
10 DAA19 DAA31 DAA
Suivi de l'accumulation desprotéines de réserve aucours du développementdu grain
Distribution équivalente desdifférents types de gliadinesdans les fractions
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Synthèse : Corpuscules Protéiques isolés
- CP riches en gliadines :
fraction F2 (~ 20% Nycodenz)
Protéines ~ 100 µg/mL
- CP contenant des gluténines HPM :
fraction F7 (~ 40% Nycodenz)
Protéines < 50 µg/mL Présence de gliadines?
Diamètre environ 1 µm
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Isolement et caractérisation de corpuscules protéiques :Projets / Perspectives
- Approche protéomique
confirmation de l'existence de différentstypes de CP
analyse / identification de protéinesmineures liées à l'assemblage (PDI, chaperones, etc…)
- Questions liées à l'organisation supra-moléculaire
Etat de polymérisation des prolamines(études biochimiques)
Organisation des CPs ???Objets possibles : CPs blé / pois
types de structures protéiques différents
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Systèmes biomimétiques
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Les protéines de réserve suivent les voies de sécrétionvia le RE.
Comment se mettent en place les interactions entre lesdifférentes prolamines (protéines de réserve du blé) en amont,au moment de leur synthèse dans le RE?
Quel est le degré d'organisation des prolamines dans le REet/ou à la sortie de ce compartiment (vésicules ou corpusculesprotéiques)?
Cette organisation est-elle remise en cause dans lescompartiments post-RE?
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Mécanisme de formation des vésicules au niveau du RE
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Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences
Lederkremer, Gerardo Z. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10704-10709
Possible models for the assembly of Sec23p/24p and Sec13p/31p to form a COPII coat
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Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences
Matsuoka, Ken et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 13705-13709
Sec13/31p shed from the coat
Sec13/31pSec23/24p
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Les protéines COP sont-elles responsables de laformulation des vésicules contenant les prolamines?
Si oui, peut-on formuler dans un système biologique,des vésicules contenant des protéines de réserveblé?
Quelles sont les spécificités qui fondentles interactions entre les différentes prolamines?Domaines fonctionnels?
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Conservation de la machinerie de confection de vésicules et du trafic vésiculaire à travers l ’arbre de la vie.
Banques ESTs TIGR & Génoplante (blé)
Genes trapping
Confection de banques partielles de cDNAs
Stratégie pour un modèle biomimétique
Complémentation fonctionnellede mutants de S. cerevisiae
Identification fonctionnelle des acteurs dutrafic vésiculaire des protéines de réserve
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Genes regulating vesicle trafic
A. thaliana C. elegans Human source
Genome size 108 108 3 x 109 1, 2
Syntaxins (target membrane SNAREs) 24 10 14 1, 2
VAMPs (vesicle SNARES) 14 10 15 1, 2
Total SNARES 53 23 32 1, 2
Sec 1s (syntaxin binding) 6 6 7 1, 2
Rab GTPases (docking and fusion) 60 29 60 2
ARF GTPases (vesicle budding) 45 27 55 3
1: Sanderfoot et al. (2000) Plant Physiol. 124: 1558.2: Bock et al. (2001) Nature 409: 839.3: Venter et al. (2001) Science 291: 1304; The A. Genome initiative (2000) Nature 408: 796
From Assaad FF (2001) Current Op. Plant Biol. 4: 478
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Double hybride (Levure et bactérien)
Identification des partenaires manquants spécifiquesdu végétal (ou du blé) par interactions spécifiques
OFFOFF
ON NO
O
NON
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Mise en place d ’une machinerie de confection de vésicules chez la levure
Co-expression des gènes spécifiant la machinerieprotéique de confection des vésicules COPII contenantdifférentes familles de prolamines de blé
Caractérisation structurale
Etude du devenir de ces vésiculesdans les compartiments post-RE
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Modèles acellulaires pour l’étudede l’agrégation,
de la condensationet de la micro-compartimentation
de protéines de réserve
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Démarche générale
Approche mécanistique des processus d'agrégation ou d'assemblage aux différentes échelles d'observation
- échelle moléculaire :UV-Vis, IRTF, DC, fluorescence
- échelle colloïdale: diffusion du rayonnement
- échelle macroscopique: diagramme d’états, microscopie
Approche cinétique des processus d'agrégation/condensation et de micro-compartimentation
Étude des interactions
- ITC, calorimétrie haute sensibilité, résonance plasmonique de surface,IRTF
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Caractéristiques des CP à prendre en compte
Densité : 1.268 g/cm3 (blé; mi-maturation) —> 95% protéines (pression osmotique pour maintenir l'intégrité des CP ?)
Arrangement des sous-unités au sein du CP (maïs) (rôle des interactions intra- et intermoléculaires entre SU ?)
Dépôt des protéines sous forme solubles ou agrégées (ex. blé) (mécanismes de rétention/d'agrégation ? Reconnaissance ?)
Taille : 0.5 – 1.5 mm (origine de la diversité de tailles :génétique , écophysiologique?)
Identification d’autres composés : phospholipides membranaires, protéines membranaires, chaperones, glutathion (rôle dans le repliement et/ou les associations ?)
Ions, type d'ions, force ionique ? (existence d'interactions à courte distance ?)
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Les objets d’étude : les gliadines
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
I/I0
q (nm-1)
L=16; d=3.6 nm 2a=22; 2b=3.8 nm
Solubilité :Eau/éthanol > acide acétiqueStructure :Cylindre L=16nm, d=3.6nmComportement en T :UCSTPolymorphisme :Miscibilité totale (γ−ω et γ-LMWG)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
T
ΦA/ΦB
2 phases
1 phase
0.1 1
0.01
0.1
1
10
EtOD/D2O 62/38
I/C (g
-1.c
m2)
q (nm-1)
γ-gliadine ω-gliadine ω - γ 1:1 ω - γ 1:3 ω - γ 3:1 L=18.5 nm; d=3.5 nm
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Approche cinétique des processus d’agrégation / condensation :mauvais solvant et/ou choc osmotique
«Solution»de
Gliadines(10 mg/ml)EtOH:H2O
48:52
1
2
3interneexterne
Mauvais solvantETOH:H2O 45:55
35:65 25:75
Choc osmotiquePEG 35000 ≠ Conc.EtOH:H2O 48:52
Mauvais solvant+ choc osmotique
1 2+
Objectifs : création de particules denses mimant lescorpuscules protéiques – approche cinétique desphénomènes d’agrégation/précipitation
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Précipitation(mauvais solvant)
Concentration(choc osmotiqueen bon solvant)
Précipitation etconcentration
(choc osmotiqueen mauvais solvant)
0 5 10 15 20 25 300
5
10
15
20
25
30
35
40
2
3
1
Cgl
iadi
nes (
g.l-1
)
temps (h)
Précipité amorphePas de précipitation contre PEG en bon solvant
Approche cinétique des processus d’agrégation / condensation :mauvais solvant et/ou choc osmotique
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t = 7h (taille : 3-4.6 µm)t = 1h (taille < 1 µm)
t = 71h (taille : 1.5-6 µm)
Approche cinétique des processusd’agrégation / condensation :
mauvais solvant et/ou choc osmotique
Cinétique de croissancedes particules :processus auto-limitant ?
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Coa
cerv
at m
ultiv
ésic
ulai
reet
réar
rang
emen
t int
erne
Inte
ract
ions
(coa
lesc
ence
par
tielle
)et
répu
lsio
n
Inte
ract
ions
et c
oale
scen
ce
Fusion de vésiculesMCBL double marquage
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Étude des interactions
10 20 30 40 50-1
0
1
2
3
Hea
t flo
w (m
W)
Temperature (°C)
5.6 10-4mM 5.6 10-3
5.6 10-2
2.8 10-1
4.2 10-1
5.6 10-1
Interaction DMPC – gliadine par micro-DSC
Pré-transition Transitiongel-cristal liquide
Pas ou peu de variation sur les T pré-transition et transitionBaisse de ∆H consécutive à une baisse des interactions hydrophobesentre chaînes acyles des phospholipides (interaction avec gliadine ?)
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Micro-compartimentation
Encapsulation de gliadines dans des liposomes
Thèse GDR INRA Nantes-CNRS CRPP
domaine très dilué
domaine concentré
domaine très concentréd aqueuse < 2xRg
Effet de l’insertion des protéines de réserve sur les propriétés de laphase lamellaire : modifications de la structure, déformations de lamembrane, apparition de défauts
Conséquences sur la structure et sur les propriétés dynamiques de laprotéine : effet du confinement , diffusion de la protéine, localisation dela protéine, modification de sa conformation, quantité de protéinespouvant être insérée
d aq
ueus
e
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Etudes bioinformatiques
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Analyse des données de ponts disulfures
• Démarche:– Analyser les données de ponts disulfures issues des banques
et en extraire des « connaissances » et/ou des motifsintéressants
• 2 angles d’observation :– Caractérisation des cystéines libres / liées– Caractérisation des ponts disulfures
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Mise en place d’un processus de datamining pour l’étude des ponts disulfures
Banques dedonnées
biologiques
Ponts
1010110001101000101000101010100100111110
Base dedonnées
personnelle
Donnéescibles
Donnéespréparées
Informationsextraites
Connaissances
Recensement,Récupération, Stockage
Sélection
Préparation
Règle d’Association
Data Mining
Interprétation
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Données et Banques de données
C C C C C CSignal
Préprotéine :-Peptide signal
Préprotéine :-Séquence
C C CC C C
Chaîne 1D :-Profil d’hydrophobie-Séquence
Cystéines :-Positions-Conservation
Ponts Disulfures :- Intra moléculaires- Inter moléculaires
Protéine mature :-Localisationsubcellulaire
Cystéines :-Voisinage spatial-Accessibilité au solvant
C C
C C
C C
C C
C C
C C
Protéine mature :-StructuresSecondaires-Mode d ’expression
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Règles d’association pertinentes pour caractériser les cystéines libresou impliquées dans des ponts disulfures:
If signal=yes AND conservation = 100/100 AND Number of cysteines is even
THEN Cysteine is bonded Confidence : 1 – [729/732]
IF location=Extracellular AND Number of cysteines is even
THEN Cysteine is bonded Confidence : 0.99 – [918/924]
IF signal=yes THEN cysteine is bonded Confidence : 0.97 – [1308/1349]
Quelques règles d’association
Tessier et al., 2004
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A développer
Analyse bioinformatique des domainesd’association
En cours
Prediction des ponts disulfures
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Conclusion
Assemblage des protéines de réserve:
Protéines agrégatives de caractéristiques variables+
Mécanismes biologiques et physicochimiques au sein de la cellule
Combiner les approchesBiologiquesStructurales
Physicochimiques
Systèmes protéiques concentrés organiséslimités par des membranes
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Modélisation moléculaireModélisation supramoléculaire
Simulation d’associations
Système acellulaire :contrôle total, simplification
extrême, [sorties nonbiologiques possibles]
Graine :objet d’étude
complexité extrême,nombreuses interactions
Système cellulaire :système manipulable,permet l’analyse de
mécanisme biologiques
Corpuscules
Co-localisationMédiateursValidation
Vésicules
Partenaires d’interactionMécanismesbiologiques
ParticulesInterfaces
AgrégationStructure
Interactions
In silico
Organisationaux différentes
échelles
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Graine
Jacques GuéguenColette Larré
Yves PopineauCécile Mangavel
Vanessa DevougesCéline Loussert
Système Biomimétique
Khalil Elmorjani
Bioinformatique
Dominique Tessier
PF RIO SM
Hélène Rogniaux
Système acellulaire
Denis Renard
CRPP CNRS Pessac
Laurence Navailles
Thématique Assemblage des Protéines de Réserve à l’INRA Nantes
doctorant GDR
Dicotylédone / Monocotylédone