La Chromatographie Liquide

8/17/2019 La Chromatographie Liquide

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La chromatographie liquide

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I. Généralités sur la chromatographie

1. Description

2. Paramètres intervenant dans la

séparation

3. Tableau résumé des diff érents types

de chromatographie

4. Les supports ou matrices pour phases

stationnaires

II. Chromatographie d'échange d'ions

1. Les diff érents types d'échangeurs

d'ions

2. Principe

III. Chromatographie d'exclusion ou

filtration sur gel

1. Remarque préliminaire

2. Principe

3. Détermination de la masse molaire

d'une molécule

IV. Chromatographie d'affinité

1. Principe et applications

2. Structure de gels d'affinité -

Activation du gel pour le couplage du ligand

- Bras espaceurs

V. Interactions hydrophobes

V.A. Chromatographie à polarité de

phase inversée ou en phase reverse

1. Structure du gel de silice

2. Principe de l'adsorption et de la

désorption en phase reverse

3. Exemples d'application

V.B. Chromatographie d'interactions

hydrophobes

1. Principe

2. Quelques particularités de la

chromatographie d'interactions

hydrophobes

VI. Chromatographie de partage etchromatographie d'adsorption

VII. Avantages et inconvénients des

diff érents types de chromatographie

liquide / solide

VIII. Liens Internet et réf érences

bibliographiques

I. Généralités sur la chromatographie

1. Description

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Structure%20du%20gel%20de%20silice.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe%20de%20l'adsorption%20et%20de%20la%20d%C3%A9sorption%20en%20phase%20reversehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Exemples%20d'applicationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Quelques%20particularit%C3%A9shttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VI.%20Chromatographie%20de%20partage%20et%20chromatographie%20d'adsorptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VII.%20Avantages%20et%20inconv%C3%A9nientshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#Lienshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Structure%20du%20gel%20de%20silice.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe%20de%20l'adsorption%20et%20de%20la%20d%C3%A9sorption%20en%20phase%20reversehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Exemples%20d'applicationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Quelques%20particularit%C3%A9shttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VI.%20Chromatographie%20de%20partage%20et%20chromatographie%20d'adsorptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VII.%20Avantages%20et%20inconv%C3%A9nientshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#Liens


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La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un

mélange ;

• les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que

l'on appelle la phase mobile.

• elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice)

fie (un solide ou un liquide fié) que l'on appelle la phase stationnaire ! il y a donc

une distribution ou partition des composants entre ces deu types de phase.

• le flu du fluide vecteur étant continu" c'est la rétention plus ou moins longue des

différentes molécules sur le support fie" qui va les séparer les unes des autres.

#istoriquement" c'est au russe $i%ha&l emenovivch sett (*+,- */*/) que l'on doit lapremi0re pu1lication (*/23) de travau de chromatographie" ayant utilisé cette technique

pour séparer les pigments d'épinard (voir historique 1 et historique 2 de la

chromatographie). Le mot chromatographie vient du grec 4kroma 4 (couleur) et

4 graphein 4 (écrire).

2. Paramtres inter!enant dans la séparation

Les param0tres physicochimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont !

param0tres type de chromatographie domaine d'application

la charge électrique échange d'ions

• protéines

• polypeptides

• acides aminés

• acides nucléiques

• sucres

http://www.123bio.net/cours/chromato/tswett.htmlhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htmhttp://www.123bio.net/cours/chromato/tswett.htmlhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htm


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la taille et la forme (en fait, levolume)

exclusion ou gel defiltration

• protéines

• polypeptides


• sucres

• lipides

l'existence de structures

particulières qui permettent

d'établir des liaisons spécifiques

affinité • protéines

la polarité

et/ou

l'hydrophobicité

polarité de phase inversée

ou phase reverse

• protéines

• polypeptides

• acides aminés


• sucres

• acides gras

interactions hydrophobes • protéines

Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-

chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres

caractéristiques.

Par exemple :

• un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau

phényl du " DOWEX ™", interagit aussi par interactions hydrophobes : ainsi pour

2 acides aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la cha î ne latérale


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influencera en second lieu la séparation de ces molécules.

• un gel de filtration ""ephade#™" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les

protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le dextran.

$. %ableau résumé des différents t&pes de chromatographie

phase

stationnair

e

principe de

séparation

catatéristiques de

la phase stationnaire

principe de la fixation

et de l'élution

liquide partageliquide fixé sur un support

inerte (papier, silice...)

distribution des composants du

mélange à séparer dans les

deux phases liquides selon leur

coefficient de partage

solide

adsorption adsorbant solide polaire

phénomène de surface :

formation de liaisons

spécifiques entre les

composants et la surface

adsorbante

adsorption

(phase

inverse)

molécules hydrophobes

greff ées sur de la silice

interactions hydrophobes et

élution par diminution de la

polarité de la phase mobile

échange

d'ions

résine (polymères d'oses)

porteuse de groupements

chargés négativement ou

positivement

interactions électrostatiques

avec les composants de charge

opposée

exclusion

(filtration

sur gel)

solide poreux les composants de diamètre

supérieur à celui des billes du

support sont "exclus" et ceux

de diamètre inf érieur y

diffusent et sont freinés

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htm


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affinité

support sur lequel est greff ée

une molécule (le ligand)

spécifiquement reconnue par

un des composants de

l'échantillon à analyser

déplacement de l'équilibre de

liaison [molécule - ligand

greff é] en faveur de l'équilibre

[molécule - tierce molécule]

'. Les supports ou matrices pour phases stationnaires

Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de

résine.

Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme

irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de diff érents types de molécules,

par exemple :

• de st&rne ( di!in&lben)ne pour certaines résines d'échange d'ions

• de pol&holosides pour les gels de filtration

• de silice pour la chromatographie en phase reverse

Diff érents traitements ou modifications de ces diff érentes résines permettent d'obtenir tel

type de phase stationnaire ou tel autre type.

II. *hromatographie d+échange d+ions

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htm


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1. Les différents t&pes d+échangeurs d+ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la

charge est :

positi!e : résines échangeuses d'anions

qui fixent des molécules chargées négativement :

---R+...M

-

négati!e : résines échangeuses de

cations

qui fixent des molécules chargées

positivement : ---R-...M

+

nature de la fonction ionisable : ---R+

nature de la fonction ionisable :

---R-

base forte base faible acide fort acide faible

ammonium

quaternaire : ---NR3+

exemple :

triméthylammonium

---N(CH3)3+

forme protonnée d'une amine

I, II ou III :

---NHR2+

exemple :

diéthylaminoéthylammonium

exemple :

sulfonate

---SO3-

exemple :

carboxyméthyl

---O-CH2-CO2-

2. Principe.

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le

groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

• dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du

groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement

diéthylaminoéthylammonium est 9,5)


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• dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du

groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4)

Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de

leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :

• négative : le pI de l'albumine de sérum bo!in est 4,9, cette protéine est chargée

négativement à pH 7

• nulle

• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à

pH 7

,oir un e#emple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH

Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

• En modifiant le p- de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont

chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que

l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les

molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.

• En aoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion

de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre (ion.

L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est

le suivant :

• cations monovalents : Li+

< H+


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1. /emarque préliminaire

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou

tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première

approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des

molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur ra&on de "tokes. Mais cette

relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines

dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Diff érents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la

détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

• la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, lacalmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.

• les modifications post(traductionnelles : par exemple, les longues cha î nes d'oses

modifient fortement la géomètrie des protéines gl&cos&lées et les rend plus denses ;

à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.

• la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ...

2. Principe.

La phase stationnaire est constituée de billes de pol&saccharides (type ""ephade#™" ou

""epharose™") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

• le !olume des billes est très finement calibré ;

• ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y

pénétrer et sont éluées rapidement ;

• en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent

et y subissent des frottements qui les retardent.

En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un

mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/1ModPostTrad.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/8Glycosylation/1Glycosylation.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/1ModPostTrad.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/8Glycosylation/1Glycosylation.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htm


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domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y

a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (!oir un

e#emple).

$. Détermination de la masse molaire d+une molécule.

Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé

par chromatographie de filtration sur gel (voir un e#emple de séparation) :

• chaque molécule est éluée avec un volume d'élution ,e.

• par ailleurs, le volume d'e#clusion du gel (V0) est le volume d'élution d'une

molécule non retardée par le gel, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu de#tran,

polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 106 Da.

• enfin, le volume total du gel (,t) est la somme du volume des billes et du volume

externe aux billes : il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse

totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.

On définit le coefficient de partition :

Ve - V0

KD = -----------

Vt - V0

• on trace la droite étalon : log 0masse molaire f 03D (ou masse molaire = f (KD)

sur une échelle semi-logarithmique)

• on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les m4mes conditions de

chromatographie que pour le mélange des standards

• on reporte le KD de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi

on détermine sa masse molaire

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htm


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I,. *hromatographie d+affinité

1. Principe et applications

C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un

facteur 103 à 104 en une seule fois.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une

molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le

ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :

•

l'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la

résine est effectuée dans des

conditions physico-chimiques

(pH, force ionique, concentration

de la molécule à adsorber...)

fa!orables ˆ la liaison molécule -

ligand

• dans ces conditions, les molécules

du mélange à séparer qui n'ontpas (ou peu) d'affinité pour le

ligand sont éluées au fur et à

mesure qu'on le fait passer sur la

résine

• on désorbe ensuite les molécules

spécifiquement fixées au ligand

en modifiant les conditions

physico-chimiques de telle sorte

que la liaison molécule - ligandsoit rompue : le plus souvent, on

ajoute une tierce molécule qui

entre en compétition avec le

ligand greff é pour la molécule à

séparer.


11/21

En d'autres termes, on déplace l+équilibre de liaison molécule - [ligand greff é] en faveur de

l'équilibre molécule - [tierce molécule]. Cette tierce molécule peut-être :

• le ligand greff é lui-même (sous forme libre) à une concentration plus éle!ée que

celle du ligand greff é

• une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greff é mais pour

laquelle la molécule a plus d'affinité

L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de

protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples :

ligand exemples de molécules isolées

•protéine 5 (recombinante) : protéine deStaphylococcus aureus à haute affinité

pour le fragment Fc des anticorps de type

IgG ;

• protéine G (recombinante) : protéine de

surface des streptocoques du groupe G,

recepteur de type III du fragment Fc des

anticorrs de type IgG.

• IgG de mammif ères

• exonucléases

• concana!aline 5 (les lectines en général) :

protéines qui se fixent sur des résidus

spécifiques de la partie osidique des

glycoprotéines et qui ont des propriétés

agglutinantes (exemple : érythrocytes).

• fixation sur des résidus -D-

mannopyranosylou -D-

glucopyranosyl terminaux des

gl&coprotéines

• 5D6 natif ou dénaturé de thymus de veau

• pol&merases (ADN, ARN)

• exonucléases

• l&sine

• plasminogne

• 5/6 ribosomal

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htm


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• iminodiacétate : chélateur de métaux

• boronate

• métalloprotéines

• protéines à groupements cis-

diol

• colorants de l'industrie textile (exemple :

bleu de procion ou "Cibacron blue®") : les

enzymes qui fixent les mono- ou

dinucléotides puriques interagissent avec

les cycles portés par les colorants dont la

structure est très proche de celle du 65D7.

!oir l+e#emple du 89leu 5™"

• désh&drogénases à NAD(P)+

• kinases dépendantes de l'ATP

• pol&0: (acide polyuridylique)

• 5/6 messagers par hybridation

à leur queue poly(A)

• protéines se liant au poly (U)

(interf éron, transcriptase

inverse)

2. "tructure de gels d+affinité ( 5cti!ation du gel pour le couplage du ligand ( 9rasespaceurs

Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des

billes d'agarose ("Sepharose™", Pharmacia®), de polyacrylamide d'agarose, de verre

poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...

L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement acti!é, c'est-

à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons

covalentes. Parmi les di!erses méthodes d+acti!ation, on peut citer :

• l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le

bromure de c&anogne dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3).

Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des

ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la cha î ne

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/1AffinCOLORANT/11AFFcolor.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/3ActivCouplage/11ActivCOUP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/1AffinCOLORANT/11AFFcolor.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/3ActivCouplage/11ActivCOUP.htm


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latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués

par action de l'éthanolamine ou la glycine.

• les groupes hydroyles du support peuvent 5tre activés par le carbon&l di(imida)ole.

• l'activation du support peut 5tre faite avec le gtutaraldéh&de qui se polymérise et

forme des chaînes à 6 car1ones qui constituent des points de fiation à une

certaine distance de la matrice.

• une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tos&le et elle permet le

couplage de molécules qui poss0dent un groupement aminé" thiol ou phénol.

7our rendre certains ligands accessi1les au site de fiation sur la molécule avec laquelle

ils interagissent" il est nécessaire d'augmenter la longueur de la chaîne car1onée àl'etrémité de laquelle se situe le groupement activé. 8ette chaîne additive s'appelle un

bras espaceur.

La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélecti!e. 8ependant" c'est aussi la

plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions

epérimentales idoines pour o1tenir un gel correctement activé !

• le ligand doit 5tre orienté de mani0re optimale pour une parfaite reconnaissance

stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer

• il ne faut pas que le ligand su1isse l'action des enzymes" c'est pour celà qu'on

utilise davantage des analogues de su1strats (inhibiteurs compétitfs par eemple)que les su1strats eum5mes

• il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fiée au ligand qui préserve

sa fonction 1iologique

• en conséquence" cette méthode chromatographique est co;teuse

,. *hromatographie d+adsorption < polarité de phase in!ersée ouphase re!erse

,.5. *hromatographie < polarité de phase in!ersée ou en phase re!erse

1. "tructure du gel de silice

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htm


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Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice 0"i=2,

appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée :

• la silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme

d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins

• ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières

• à la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes

siloxanes (-O-) qui lui conf èrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent

de former des liaisons hydrogènes

• on utilise fréquemment une silice sur laquelle des cha>nes alk&lées (ou autres, voir

les différents groupes utilisés) sont greff ées au niveau des groupements silanols

2. Principe de l+adsorption et de la désorption en phase re!erse 0!oir un schéma

Les cha î nes alkylées conf ère à la silice un caractère très h&drophobe :

• si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules

hydrophobes vont établir des interactions h&drophobes avec la phase stationnaire et

ainsi être adsorbées

• on augmente alors la concentration en sol!ant organique (apolaire donc hydrophobe)

dans la phase mobile

• à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus

importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont

désorbées et éluées

La phase mobile est donc constituée d'un mélange eau ? sol!ant organique, en proportion

variable :

a. la phase aqueuse :

• l+eau est le sol!ant le plus polaire (le moins hydrophobe).

On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort

(l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/3Greffons/1TypeGREFFONS.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/1Adsoprtion/1PhenADSORP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/3Greffons/1TypeGREFFONS.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/1Adsoprtion/1PhenADSORP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htm


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ces deux composés ioniques forment des paires d+ions avec les molécules à séparer,

neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence

d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la

phase stationnaire.

b. le sol!ant organique :

• il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la siliceleur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile etle méthanol.

• le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des

molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir

d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou

une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.

• les solvants organiques ne doi!ent pas comporter d+impurétés ni avoir une forte

absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interf érer avec

les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut

ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En

conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers.

$. @#emples d+application

La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules.

C'est une méthode de chromatographie extrêmement efficace qui permet de séparer des

échantillons complexes.

Parmi les applications, on peut citer la détermination de la séquence primaire des protéines

par la dégradation de Pehr @dman :

•

la fonction -aminée de l'acide aminé en position N-terminale de la cha î nepolypeptidique d'une protéine (ou d'un polypeptide) est traitée à pH alcalin par

l'isothioc&anate de phén&le 0PI%*, appelé aussi réactif d'Edman.

• après action d'acides et de solvant organique, la liaison peptidique liant l'acide

aminé en position N-terminale est spécifiquement coupée.

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/2ACN.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/2ACN.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htm


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• l'analyse des des acides aminés libres (!oir un e#emple d+application < Aedicago

truncatula ).

Dans les deux cas, les acides aminés sont dérivés par le PITC qui incorpore un

groupement qui absorbe dans l'ultra-violet. On peut ainsi séparer, identifier et quantifierles PTH - acide aminés par chromatographie en phase re!erse avec une phase stationnaire

sur laquelle est greff ée une cha î ne alkylée en C18 (octadécyl).

,. 9. *hromatographie d+interactions h&drophobes

On peut considérer que ce type de chromatographie est une "!ariante" de lachromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des molécules sur la phase

stationnaire met en jeu le même type d'interactions. Les gels de chromatographie

d'interactions hydrophobes portent un groupement h&drophobe à l'extrémité d'une cha î ne

carbonée.

1. Principe.

Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il

en résulte un état thermodynamiquement défavorable. L+interaction h&drophobe est la

conséquence de deu# phénomnes opposés B une augmentation de l+entropie des molécules

d+eau autour du composé h&drophobe (c+est(


17/21

des protéines fixées est obtenue :

• en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi

progressivement éliminés.

• les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de

nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase mobile, c'est-à-dire que la

solubilité des protéines dans la phase mobile rede!ient ma#imale et elles sont éluées.

Il existe d'autres moyens d'éluer les protéines fixées :

• ajouter un ion aux propriétés chaotropiques qui induit une diminution de

l+organisation des molécules d'eau (donc une augmentation de leur entropie) : la force

des interactions hydrophobes est ainsi diminuée

• ajouter un détergent /

augmenter le pH /

diminuer la température puisque la forcedes interactions hydrophobes diminue avec celle -ci

2. Cuelques particularités de la chromatographie d+interactions h&drophobes.

Le choix de la matrice :

• la densité du ligand fixé sur les matrices utilisées pour la chromatographie

d'interactions hydrophobes est moindre que celle des supports de phase reverse.

• le profil d'hydrophobicité d'une protéine dépend essentiellement de la présence et

de la répartition des acides aminés : Ile, Leu, Val et Phe. Donc pour une protéine

donnée, on ne peut déterminer le support de chromatographie d'interactions

hydrophobes le mieux adapté qu'en testant diff érents types de gels.

• cependant, le meilleur choix pour commencer est un gel avec un groupement

phényl. En effet, ce groupement est d'hydrophobicité intermédiaire entre le n -butyl et le n - pentyl. Par ailleurs, les protéines très hydrophobes ne sont pas

facilement éluées des gels contenant le groupement octyl.

Les listes suivantes présentent certains anions et cations dans un ordre de moins en moins

favorable à la formation d'interactions hydrophobes :

http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htm


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19/21

C2

K = --------(relation 1)

C1

C2 = 3 . C1n (avec n

inf érieur ou égal à 1)

ou bien encore :

K C2

------------ =

--------

C11-n

C1

• K est le coefficient de partage entre les deux phases et il dépend de la

température ;

• C1 est la concentration du composant C dans le solvant S1 ;

• C2 est la concentration du composant C dans la phase stationnaire : soit le solvant

S2 (partage), soit le solide (adsorption).

En fait, la chromatographie de partage et la chromatographie l'adsorption peuvent être

rapprochés :

• en effet, la solubilité et l'adsorption sont deux phénomènes liés aux forces de Van

der Waals et aux affinités respectives du composant C dans chacune des deux

phases ;

• par ailleurs, la relation 1 n'est qu'un cas particulier de la loi de Freundlich.

,II. 5!antages et incon!énients des différents t&pes de chromatographie liquide ? solide

caractéristiques échange d'ionsfiltration

sur gelaffinité

phase

reverse

interactions

hydrophobes


20/21

résolution de laséparation

moyenne à

éle!ée

moyenne à

éle!ée

e#ceptionnelle

élevée pour

les

protéines et

les

polypeptide

s de faible

masse

molaire

moyenne

concentration

de la molécule

d'intérêt à

l'issue de la

chromatographi

e

augmentée souvent

diminuée augmentée augmentée augmentée

recouvrement

de l'activité

enzymatique

bon bon bon

la phasemobile

organique

peut

dénaturer

les enzymes

bon

capacité de

rétention

(fixation) du gel

éle!ée moyenne éle!ée moyenne éle!ée

régéneration du

gel

supporte l+action

d+une base forte

domainesd+application

trsnombreu#

ne supportepas les

agents

chimiques

agressifs

ne supportepas les

agents

chimiques

agressifs

supporte l+action

d+une base forte

autres

domainesd+application trs

nombreu#

-------

domaines

d'applicatio

n restreints

domainesd+application

trsnombreu#

domaines

d'application

restreints

nécessité de

"dessaler"l'échantillon à

l'issue de la

chromatographi

e

permet ledessalage

d+échantillons

nécessité de

coupler le

ligand d'où

un coût

élevé du gel

-------

nécessité de

"dessaler"l'échantillon à

l'issue de la

chromatographi

e


21/21

,III. Liens Internet et références bibliographiques

ikipédia B portail 8*hromatograph& 8 0!ersion anglaise plus complte quela !ersion farnEaise.

"ite

"ite trés complet sur la chromatographie et d+autres techniques.

%echniques de

l+Ingénieur

"ociété Waters "ite

8@n)&mes B catal&seurs du monde !i!ant 8 ean Pelmont 01H Presses :ni!ersitaires deGrenoble ( I"96 B 2(JK1(KHH(J

8Principes de 9iochimie8 -orton Aoran =chs /aMn et "crimgeour 01' @d. De9oeck:ni!ersités ( I"96 B 2(NK'1(1HJN(O

8L@5 Database8 5ller au site
http://en.wikipedia.org/wiki/Category%3AChromatographyhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5KJJZ2http://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.phphttp://en.wikipedia.org/wiki/Category%3AChromatographyhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5KJJZ2http://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.php

La Chromatographie Liquide

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