Travaux pratiques de -...

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (HEADSPACE)

TRAVAUX PRATIQUES : Mise en route et acquisition de données

E.T.S.L. TP de CPG Headspace (C.SAUNIER & L.GODIN) Licence Pro ICP Option « APC » et « DM » Page (1)

Licence Professionnelle des Industries Chimiques et Pharmaceutiques

Option APC & DM

Travaux pratiques de Chromatographie en Phase Gazeuse

avec HeadSpace

Logiciel CompassCDS 3.0

Version 2014-2015




SOMMAIRE 1 - MISE EN ROUTE p. 3 1.1 Mise en circulation des gaz p. 3 1.2 Allumage des appareils p. 3 2 - ACTIVATION DU CHROMATOGRAPHE ET DU COMBI PAL p. 3 3 - CREATION DE METHODES D'ANALYSE p. 10 3.0 Exemple de programmation du chrimatographe p. 11 3.1 Exemple de programmation du Headspace p. 11 3.2 Sauvegarde des modifications p. 12 4 - CREATION DE SEQUENCES D'ANALYSE p. 13 5 - TRAITEMENT DES CHROMATOGRAMMES (IDENTIFICATION, INTEGRATION, ...) p. 16

TRAVAUX PRATIQUES : Procedure d'Etalonnage Interne 1 - RENSEIGNEMENT DES PARAMETRES D'ETALONNAGE INTERNE A PARTIR DE LA METHODE GLOBALE p. 1 2 - RETRAITEMENT DES CHROMATOGRAMMES p. 2 3 - OBTENTION DE LA COURBE DE CALIBRATION ET RESULTATS p. 4 4 - OBTENTION DES RESULTATS DE QUANTIFICATION POUR LES INCONNUES p. 3




1 MISE EN ROUTE

1.1 Mise en circulation des gaz

u Le compresseur d’air et le générateur d’hydrogène doivent être en fonctionnement avant tout allumage d’appareils chromatographiques. u Pour cela, cf. notice de mise en route du compresseur d’air et du générateur d’hydrogène.

1.2 Allumage des apparei ls

u Allumer l’ordinateur u Allumer le « Combi Pal » u Allumer le chromatographe (Varian CP 3800)

2 ACTIVATION DU CHROMATOGRAPHE ET DU COMBI PAL

u Cliquer sur l’icône « CompassCDS » (Figure 2.1) :

F igure 2.1 : Activation du log iciel




u Dans la fenêtre qui apparaît (Figure 2.2), entrer le nom d’utilisateur APC ou DM, le groupe doit être ETSL, et le projet TPHEADSPACE. Valider en cliquant sur « OK » :

u Dans la fenêtre qui s’ouvre (Figure 2.3), sélectionner l’onglet « Systems » :

Figure 2.2 : Activation de l 'uti l isateur

F igure 2.3 : Activation de l 'onglet « Systems »




u Cocher la case « CP 3800 » (Figure 2.4) pour que l’ordinateur contrôle le chromatographe et le Combi Pal : Les instruments s’initialisent (Figure 2.5) :

F igure 2.4 : Pi lotage des instruments

F igure 2.5 : Init ia l isation




u Aller dans le menu « File », sous menu « Open... » et sélectionner « Open Method... » (Figure 2.6) :

u Dans l’écran qui apparaît (Figure 2.7), sélectionner (si ce n’est déjà fait) la méthode « TP HEADSPACE.METH » et cliquer sur « Open » :

F igure 2.6 : Ouverture d 'une méthode

Figure 2.7 : Activation de la méthode




F igure 2.8 : Accès aux modif icat ions des conditions




u En cliquant sur l’icône , on accède à la programmation du chromatographe ou aux modifications des conditions chromatographiques (Figure 2.10).

F igure 2.10 : Paramètres chromatographiques

F igure 2.9 : Descript ion des icônes

Accès aux modifications ou à la programmation Des conditions chromatographiques

Accès aux modifications ou à la programmation Des conditions Headspace




u Par exemple en cliquant sur « Injectors » on voit (Figure 2.11) que l’injecteur est programmé à une température de 140°C et est en mode « Split » avec un taux de split de « 5 ».

u En cliquant sur l’icône , on accède à la programmation du Combi Pal et aux modifications des conditions « headspace » (Figure 2.12).

3 CREATION DE METHODES D’ANALYSE Dans les manipulations abordées dans cette partie du TP, les paramètres chromatographiques employés sont :

u La température du gradient de température. u Le split de l’injecteur. u Le débit.

F igure 2.12 : Paramètres du headspace

F igure 2.11 : Conditions d’ injection




3.0 Exemple de programmation du chromatographe (Figure 3.1)

Si ce n’est déjà fait, activer la programmation du chromatographe, en cliquant sur l’icône , on accède à la programmation du chromatographe ou aux modifications des conditions chromatographiques (Figure 2.10). Les facteurs qui influencent la technique d’injection « Headspace » :

u La température d’incubation. u Le temps d’incubation. u La vitesse d’agitation pendant l’incubation. u Le volume de solution dans le vial d’injection. u Le volume de prélèvement de la seringue.

Pour le mélange analysé, les conditions chromatographiques doivent évoluer selon les indications en démarrant de la méthode « TP HEADSPACE.METH ».

3.1 Exemple de programmation du headspace (Figure 3.1)

Si ce n’est déjà fait, activer la programmation du Combi Pal en cliquant sur l’icône , on accède à et aux modifications des conditions du « headspace » (Figure 2.12). Dans la partie « Incubation », changer la valeur de la température et du temps d’incubation :

u double cliquer dans la rubrique « Sample Temperature » et introduire par exemple « 40 » ; u double cliquer dans la rubrique « Incubation Time » et introduire par exemple « 0:10:00 »

Dans la partie « Syringe Temperature », changer la valeur de la température de la seringue (elle est en général de 5 degrés au dessus de celle du vial. Si par exemple « Sample Temperature = 40°C » alors en double cliquant dans la rubrique « Syringe Temperature » introduire la valeur « 45 ».

F igure 3.1 : Condit ions d’ injection




3.2 Sauvegarde des modif ications Modifier s’il y a lieu d’autres paramètres et enregistrer la méthode sous un nom parlant (par exemple « Incubation 40°C »). Pour cela, aller dans le menu « File » puis dans « Save As » puis dans « Save Method As... ». Dans la fenêtre qui apparaît (Figure 3.2), donner un nom à la méthode (par exemple « Incubation 40°C »). Créer, de la même manière, au cours des manipulations d’autres méthodes par exemple avec une température d’incubation de 60°C (sauvegardée sous « Incubation 60°C ») et une température d’incubation de 80°C (sauvegardée sous « Incubation 80°C »).

Figure 3.2 : Modif ication des paramètres headspace

F igure 3.3 : Sauvegarde de la méthode modif iée




4.0 CREATION DE SEQUENCES D’ANALYSE Une fois la méthode créée et enregistrée, il faut créer une séquence d’analyse. Comme le montre la Figure 4.1, aller dans le menu « File » puis dans « New... » et choisir « New Sequence... ». Dans la fenêtre qui apparaît cliquer sur le bouton « + » pour ajouter autant de lignes que d’analyses (Figure 4.2).

Figure 4.1 : Création d 'une séquence

F igure 4.2 : Fenêtre de programmat ion des séquences et a jout de l ignes




F Dans la colonne « Method » (Figure 4.3), cliquer sur la flèche. Toutes les méthodes créées auparavant s’affichent (Figure 4.3 (a)). Choisir la méthode d’analyse du vial « 1 », par exemple « Incubation 40°C.METH » (Figure 4.3 (b)). Faire de même pour les autres lignes (Figure 4.3 (c)). F Dans la colonne « RunName (prefix) », mettre un nom de fichier parlant (ce sera sous ce nom que sera stocké le chromatogramme correspondant par exemple à l’essai 1) de préférence identique à celui de la méthode. Faire de même pour les autres lignes. Si le nom est répétitif, placer le pointeur de la souris à l’extrémité gauche de la cellule à dupliquer (celui-ci doit changer de sens) (Figure 4.4 (a)). Dérouler le nombre de cellule voulu en maintenant le clic appuyé (Figure 4.4 (b)). Puis faire un clic droit et cliquer sur Fill Block (Figure 4.4 (c)) et tout se remplit !

Figure 4.4 (a) : Sélection des l ignes de séquence

Figure 4.3 : Remplissage de la colonne « Method »




Figure 4.4 (b) : Duplication (par exemple) du nom de la méthode

Figure 4.4 (c) : Remplissage de la colonne F La colonne RunID (suffix), doit être impérativement remplie et incrémentée.

On peut procéder comme précédemment à l’aide de l’icône ou cliquer « bouton droit » de la souris après sélection de la colonne. Suivre alors les indications de la Figure 4.5. On obtient une colonne où les numéros s’incrémentent. F Faire de même avec la colonne « Vial# », « Rack# » aura toujours comme valeur 2. F Dans la colonne « Description », indiquer les principales conditions chromatographiques et Headspace en sautant une ligne entre les deux types de conditions (Cette Description apparaîtra en tête de rapport si vous utilisez la feuille de style TPHeadspace.STYL). F Dans la colonne « Run time », il est impératif d’indiquer la valeur correspondante à la durée d’analyse qui a été programmée dans la méthode ! On obtient à la fin une séquence qui a l’allure ci-dessous (Figure 4.6) :

Figure 4.5 : Remplissage de la colonne « RunID »

F igure 4.6 : Exemple de séquence de t ravail




Enregistrer la séquence sous un nom parlant. Cochez seulement les cases correspondant à des analyses que vous voulez effectuer. Il est indispensable de décochez les cases correspondant à des analyses n’utilisant pas la même méthode comme l’exemple de la Figure 4.7.

L’analyse se lance en appuyant sur le bouton « Run » : .

5.0 TRAITEMENT DES CHROMATOGRAMMES (IDENTIFICATION, INTEGRATION, . . . ) ? Cliquer dans l’onglet Data. Lorsque le chromatogramme est acquis, il faut l’ouvrir : FILE / OPEN / OPEN CHROMATOGRAM... ? Dans le nom de fichier du chromatogramme (fenêtre en haut à gauche), cliquer sur Results, un tableau des hauteurs et aires de pics apparaît en bas à droite. ? Le tableau de résultats étant incorrects, il faut rajouter et enlever des colonnes. Pour cela, faire un clic droit dans la fenêtre de résultats et sélectionner « report properties ». Dans la colonne de gauche, s’affichent alors le détail des intitulés des colonnes du tableau de résultats et dans la colonne de droite, les intitulés des colonnes qu’il est possible de rajouter dans le tableau de résultats. Selon le cas, choisir d’ajouter « add in the table » ou de retirer les colonnes inutiles par « Remove from table ». Procéder ainsi pour rajouter les colonnes suivantes : NTP USP, Res. USP, W 60,7 % et W USP et supprimer du tableau de résultats les colonnes Area %. ? Mettre le nombre de chiffres significatifs aux résultats en cliquant droit sur la colonne de chiffres souhaitée, sélectionner « edit variable » puis cliquer sur « select format » et indiquer le nombre de décimales souhaité. Enfin, cliquer sur « apply » puis OK. (temps de rétention avec 3 décimales, NTP avec aucune, les deux W avec 4 décimales) ? Supprimer les pics inutiles en sélectionnant la ligne correspondante puis à l’aide du clic droit de la souris, faire « Delete Current Peak ». ? Pour identifier et intégrer les pics, dans le nom de fichier du chromatogramme, cliquer sur la méthode locale : method, puis, ? Dans l’onglet Data, cliquer sur « peak identification » puis faire un clic droit dans la fenêtre qui se trouve sous le chromatogramme : « initialize from chromatogram ». ? Ensuite, on indique le nom des pics connus puis on intègre de nouveau sur le chromatogramme, en cliquant sur l’icône d’intégration :

? Cliquer sur les résultats du fichier « Results » et supprimer éventuellement les pics inconnus.

Figure 4.7 : Act ivation d 'une séquence d 'analyse pi lotée par la même méthode




? Pour créer une feuille de style (vous pouvez utiliser et modifier, celle qui est déjà disponible), dans le nom de fichier du chromatogramme, cliquer sur la méthode locale : method, puis, ? Cliquer sur la méthode locale liée au chromatogramme. Dans l’onglet Data, cliquer sur « report style », dans la fenêtre ouvert " default standard ", il faut cliquer sur Edit et changer le titre en cliquant droit dessus ; une fenêtre texte s’affiche qu’il est alors possible de modifier. Pour afficher dans la partie chromatogramme, le chromatogramme obtenu et intégré, cliquer droit dans la partie chromatogramme et sélectionner « properties » ; indiquer alors des valeurs en X et en Y en tenant compte des temps de rétention de l’acétone jusqu’au dernier pic sorti (en X) et des hauteurs correspondantes (en Y). ? Faire une sauvegarde du chromatogramme : FILE / SAVE / SAVE CHROMATOGRAM. Une fenêtre s’affiche, choisir Yes et choisir No sur la deuxième qui s’affichera. ? Pour imprimer, dans le menu « file », sélectionner « print preview » et imprimer le chromatogramme intégré. ? Enfin, fermer le chromatogramme intégré, en le sélectionnant, faire un clic droit, puis FILE / CLOSE CHROMATOGRAM.

Remarque

Le chromatogramme qui s’affichera alors ne correspondra pas à votre chromatogramme. C’est tout à fait normal.

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