Appréciation de la densité parasitaire réelle et de la ...

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DES ENSEIGNEMENTS SUPERIEURS

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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Département : Génie de Biologie Humaine

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Option : Analyses Biomédicales

RAPPORT DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE

LICENCE PROFESSIONNELLE

Réalisé par :

Bayo Didier DJOSSOU

Sous la supervision de :

Tuteur : Superviseur :

Mme Aurelle A. ADJILE, Inspectrice

d’actions Sanitaires au CHU-MEL.

Docteur Pascal S. ATCHADE, PhD

Parasitologie mycologie -physiopathologie-

Médecine tropicale -Maître-Assistant des

Universités (CAMES)

ANNEE ACADEMIQUE 2014-2015

8ème promotion de License Professionnelle

Appréciation de la densité parasitaire réelle et

de la densité parasitaire standard au cours du

paludisme chez les patients consultant le Centre

Hospitalier Universitaire de la Mère et de

l’Enfant Lagune (CHU-MEL).

Appréciation de la densité parasitaire standard et de la densité parasitaire

réelle au cours du paludisme chez les patients consultant le CHU-MEL.

Réalisé et soutenu par Bayo Didier DJOSSOU

ii

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET

DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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Composition de Jury :

Présidente :

Pr YEHOUENOU A. PAZOU Elisabeth,

Maître de Conférences des Universités (C.A.M.E.S),

Enseignante chercheure,

EPAC/UAC.

Examinateur :

Dr Casmir AKPOVI,

Maître-Assistant des Universités (C.A.M.E.S),

Enseignant chercheur,

EPAC/UAC.

Superviseur :

Dr Pascal S. ATCHADE,

Maître-Assistant des Universités (C.A.M.E.S),

Enseignant chercheur,

EPAC/UAC.




iii

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET

DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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DIRECTEUR :

Prof. Mohamed M. SOUMANOU

CHEF DE DEPARTEMENT :

Dr. Casmir AKPOVI

DIRECTEUR ADJOINT :

Prof. Clément BONOU




iv

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

Années Académiques : 2012-2015

Enseignants permanents

N° Prénoms et Noms Matières

01 Cyrille ADISSODA Anglais

02 Angèle Théodora AHOYO Microbiologie Générale et Microbiologie Médicale

03 Casimir D. AKPOVI Physiologie Humaine, Biologie Cellulaire, Biochimie

métabolique

04 Eugénie ANAGO Biochimie Structurale, Biochimie Métabolique,

Biologie Moléculaire

05 Sylvère ANAGONOU Education Physique et Sportive

06 Guy Alain ALITONOU Chimie Générale et Chimie Organique

07 Pascal ATCHADE Parasitologie

08 Honoré BANKOLE Microbiologie Générale, Bactériologie Appliquée

09 Noël DESSOUASSI Biophysiques des solutions

10 Cyriaque DOSSOU Technique d’Expression et Méthodes de

Communication

11 Hubert HOUNSOSSOU Anatomie, Biométrie, Biostatistique

12 Frédéric LOKO Biochimie Générale et Biochimie Clinique

13 Evelyne LOZES Immunologie Générale et Equipements Biomédicaux

14 Hospice SECLONDE Esprit de Leadership, Immuno-Hématologie et

Transfusion Sanguine

15 Julien A. G. SEGBO Biochimie Métabolique et Biologie Moléculaire et

Biochimie Clinique

16 Adolphe TOPANOU Hématologie et Hémostase

17 Gabriel YANDJOU Techniques d’Expression et Méthodes de

Communication I et II

18 Kokou Paulin YOVO Pharmacologie et Toxicologie

Liste des enseignants permanents et vacataires




v

Enseignants vacataires

N° Noms et prénoms Matières

01 Sylvestre ABLEY Déontologie Médicale

02 Christian AKOWANOU Physique

03 Clément AGBANGLA Génétique Moléculaire et Génie Génétique

04 Jean AGOUA Informatique

05 Gilles AGOSSOU Législation et Droit de Travail

06 Martin AKOGBETO Entomologie Médicale

07 Claude César

BINAZON

Soins Infirmiers

08 Aristide KOFFI Anglais

09 Raphael DARBOUX Histologie Appliquée

10 Lordson DOSSEVI Techniques Instrumentales

11 Léonard FOURN Santé Publique

12 Vincent

MASSOULOKONON

Histologie Générale

13 Maximin SENOU Histologie Appliquée

14 Victorien T. DOUGNON Méthodologie de recherche

15 Hyppolite HOUNNOU Mathématiques




vi

Dédicace

DEDICACE

*

*

*

A DIEU Tout Puissant,

Qui m’a inspiré, qui m’a guidé dans le bon chemin.

Louanges et remerciements pour votre clémence et miséricorde.

*

*

*

*




vii

Remerciements

La réalisation du présent travail a été rendue possible grâce à la volonté,

l’initiative et l’appui constant des personnes physiques et morales, auxquelles je

voudrais adresser mes sincères remerciements. Plus particulièrement :

Θ A mon père Pascal K. DJOSSOU, de qui j’ai hérité ce que je suis.

La graine que vous avez semée et arrosée, a germé, a fleuri, fructifiera et

ombragera.

Θ A ma mère Marie M. MIDOGNI, de qui j’ai hérité qui je suis.

Vous m’avez soutenu depuis toujours dans mes engagements.

Θ A mon frère Sourou Barnabé, Je veux être ton modèle préféré

Les mots seuls ne sauraient exprimer tout l’attachement, l’amour et l’affection

que je porte pour toi.

Θ A mon oncle MIDOGNI A. Daniel,

Une personne à qui je raconterais notre réalité trouverait surement que vous avez

sacrifié pleine de choses pour que je sois à cette étape de la vie. Que le Seigneur

Tout Puissant vous comble de sa grâce et puisse vous accorder une longue vie

pour que vous jouissiez des fruits de vos efforts.

Θ A mon tuteur METONOU A. Albert et AHISSOU Victoire son épouse

infiniment merci ; vous avez été pour moi durant mes trois années de formation

une boussole.

Θ A ma famille,

Aucun mot ne saurait décrire mon immense amour, ma gratitude et ma profonde

reconnaissance pour tous les sacrifices que vous avez consentis à mon égard. Pour

tous vos encouragements tout au long de mes années d’étude, merci infiniment.

Θ A tous mes amis dont je tais le nom, soyez assurés de ma grande sympathie.

Remerciements




viii

Nous remercions très sincèrement :

Mme Prudencia HOUKPONOU HOUNSOU, Directrice du CHU-

MEL.

Mon séjour au CHU-MEL a été possible grâce à vous. Recevez Madame la

Directrice l’expression de toute ma reconnaissance.

Professeur Aurore HOUNTO, Médecin chef du laboratoire et

Madame Bibiane BANKOLE BIOKOU, surveillante au laboratoire

du CHU-MEL.

Pour votre sympathie et vos conseils.

Ma tutrice Aurelle A. ADJILE, chef section Hématologie-

parasitologie- hémostase et à tous les chefs secteurs du laboratoire

du CHU-MEL.

Votre dévouement et vos sages conseils m’ont émerveillé.

Mme Monique N’DAH, technicienne au laboratoire du CHU-MEL.

Pour votre implication dans ce travail, vos conseils et votre amabilité.

M. SANNI Ramanou, M. CAKPO Jérôme, AGBO-DOFFON

Rogatien, et M. ASSOGBA Maxime, techniciens au laboratoire du

CHU-MEL.

Pour l’aide que vous m’avez apportée dans ce travail.

Tout le personnel du laboratoire du CHU-MEL

Pour votre implication active à ma formation.

Professeur Pascal ATCHADE

Vous avez toujours été disponible pour répondre à mes préoccupations.

Merci pour votre contribution dans la réalisation de ce travail.

Toutes les autorités de l’EPAC en particulier les professeurs du

département de Génie de Biologie Humaine

Pour la qualité de la formation.

Tous ceux et à toutes celles qui de près ou de loin ont contribué à la

réalisation de ce travail. Soyez-en remerciés.




ix

Hommages

A SON EXCELLENCE LE PRESIDENT DU JURY

Vous nous faites un grand honneur en acceptant de présider notre jury malgré vos

multiples occupations. Veuillez agréer monsieur le président, l’expression de

notre profonde gratitude.

AUX HONORABLES MEMBRES DU JURY

Nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de juger

ce travail. Recevez nos vives considérations.

Hommages




x

Liste des abréviations et sigles

ANOFEL : Association Française des Enseignants de Parasitologie et

Mycologie.

CHU-MEL : Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de

l’Enfant Lagune.

DP : Densité Parasitaire.

DPS : Densité Parasitaire Standard.

DPR : Densité Parasitaire Réelle.

EIQ : Étendu Interquartile.

EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi.

FS : Frottis Sanguin.

GE : Goutte Epaisse.

GE/DP : Goutte Epaisse/ Densité Parasitaire.

GE/DP + : Goutte Epaisse/ Densité Parasitaire positive.

GE/DP - : Goutte Epaisse/ Densité Parasitaire négative.

IP : Indice Plasmodique.

N° : Numéro.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

p/mm3 de sang: Parasites par millimètre cube de sang.

P.falciparum : Plasmodium falciparum.

Liste des abréviations et sigles




xi

Liste des tableaux

Tableau I : Les activités réalisées dans les différents services du laboratoire.....20

Tableau II : Répartition des patients suivant la tranche d’âge et le sexe……….32

Tableau III : Prévalence globale du portage parasitaire………………………..32

Tableau IV : Prévalence du portage plasmodial suivant le sexe..................…...32

Tableau V : Prévalence du portage plasmodial suivant la tranche d’âge………33

Tableau VI : Caractéristique du taux réel de leucocytes……………………….34

Tableau VII : Caractéristique comparatives des parasitémie obtenues par les

deux méthodes de calcul (DPS et DPR)………………………………………..35

Tableau VIII : Caractéristique des différentes espèces plasmodiales…………49

Liste des tableaux




xii

Liste des figures

Figure 1: Anophèle (vecteur du paludisme) [8]……………………………….6

Figure 2 : l’hématopoïèse des globules blancs [15]………………………….. 13

Figure 3: Confection de la goutte épaisse et du frottis sanguin mince sur une

lame (Didier DJOSSOU).............................................................................…...25

Figure 4 : Prévalence du portage plasmodial selon la provenance ................... 33

Figure 5 : Répartition du taux réel de leucocyte par rapport à la valeur standard

(6000) fixé par l’OMS. ...................................................................................... 34

Figure 6 : Répartition du taux réel des leucocytes suivant les tranches

d’âges........................ ………………………………………………………….35

Figure 7 : Proportion de concordance et de discordance des DP calculées par la

méthode standard et celle du compte des blancs. .............................................. 36

Figure 8 : Proportion des DP sous-estimées et surestimées au sein des

discordants…………………………………………………………………….. 36

Figure 9: Plasmodium falciparum à différents stade en frottis mince et en goutte

épaisse colorés au Giemsa [4] ............................................................................36

Figure 10 : Plasmodium malariae à différents stade en frottis mince et en goutte


Figure 11 : Plasmodium ovale à différents stade en frottis mince et en goutte


Figure 12 : Plasmodium vivax à différents stade en frottis mince et en goutte


Figure 13 : Cycle de vie du parasite du paludisme [4] …...................................50

Liste des figures




xiii

Résume/Abstract

RESUME

Le comptage des globules blancs est un socle dans l'estimation de la densité parasitaire pour la

prise en charge des cas de paludisme. L’objectif général de cette étude est d’apprécier

l’utilisation de la valeur standard et de la valeur réelle de leucocytes pour l’établissement de la

densité parasitaire au cours du paludisme à Plasmodium falciparum chez les patients consultant

le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’Enfant Lagune (CHU-MEL). Cette étude

a été réalisée sur une population de 482 patients, dans la période de Mai à Août 2015. Au terme

de notre étude, 40,66% des patients sont porteurs de plasmodium. La médiane du taux réel de

leucocytes est de 10920 et la médiane géométrique des densités parasitaires étaient de 7775.5

pour la densité parasitaire standard et de 12510,5 pour la densité parasitaire réelle. 81 ,54% des

densités parasitaires étaient surestimées contre 18,46% sous-estimées. La différence entre les

deux densités parasitaires a été considérée comme statistiquement significative (p<0 ,005).

L’utilisation du coefficient 6000 dans l’estimation de la parasitémie pourrait entraîner une sous-

estimation significative de la charge parasitaire et n’est pas adapté à la réalité du CHUMEL.

Mots clés : Densité parasitaire réelle, Densité parasitaire standard, hématozoaire, frottis

sanguin, goutte épaisse.

ABSTRACT

White blood cell count depend on malaria management with density parasite estimation. The

main objective is to assess real value using leukocytes standard value to establish parasite

density of Plasmodium falciparum malaria in patients consulting at Hospital University of

Mother and Child Lagoon (CHU-MEL). This study was conducted on a population of 482

patients from May to August 2015. Results shown At the end that, 40.66% of patients are

carriers of Plasmodium. The median real rate of leukocytes is 10920 and the geometric median

parasite densities were 7775.5 standard for parasite density and 12510.5 for real. 81.54%

parasite densities were overestimated against 18.46% underestimated. The difference between

the two parasite densities was considered statistically significant (p <0 .005). The parasitaemia

estimation with a coefficient of 6000 could lead to a significant underestimation of parasitic

load and were not adapted to the reality of CHUMEL.

Keywords: real parasite density, standard density parasite, parasite, blood smear, thick drop

Résumé/Abstract




xiv

Sommaire

Introduction ......................................................................................................... 1

1ère partie : Synthèse bibliographique ................................................................ 3

1 Paludisme ......................................................................................................... 4

2 Globules blancs .............................................................................................. 12

2ème partie : Matériel et méthodes d’étude ...................................................... 15

1 Cadre ............................................................................................................... 16

2 Matériel et Méthodes ...................................................................................... 22

3ème Partie : Résultats et discussion ................................................................. 31

1 Résultats ......................................................................................................... 32

2 Discussion ....................................................................................................... 37

Conclusion ......................................................................................................... 39

Suggestions ........................................................................................................ 40

Références bibliographiques ............................................................................. 41

Annexe .............................................................................................................. 44

Table des matières ..............................................................................................53

Sommaire




1

Introduction

Le paludisme est un véritable problème de santé publique dans le monde et en

Afrique subsaharienne en particulier [1]. Dans les zones d’endémie palustre, cette

affection reste l’une des principales causes de morbidité et de mortalité chez

l’enfant [2]. On estime que, sur les 1,7 à 2,7 millions de décès annuels liés au

paludisme, environ 70 à 80 % surviennent chez les enfants de moins de 5 ans

vivant en Afrique subsaharienne [3].

Au Bénin, selon l’annuaire des statistiques sanitaires généré par le SNIDGS

(Système National d’Information et de Gestion Sanitaire) du Ministère de la santé

du Bénin en 2011, le paludisme constitue la première cause de consultation et

représente 41,7% de tous les cas enregistrés dans les formations sanitaires et

47,6% des cas chez les enfants âgés de moins de 5 ans [4]. Il constitue de ce fait,

un défi majeur pour le système de santé et pour le développement [4].

La confirmation biologique systématique des cas suspects de paludisme avant

tout traitement constitue la base essentielle de la politique nationale de prise en

charge du paludisme [4 ; 5]. Les moyens diagnostiques de certitude

habituellement utilisés sont le frottis sanguin (FS) et la goutte épaisse (GE) avec

le calcul de la densité parasitaire (DP) établie à partir du nombre standard de

leucocytes par microlitre de sang, habituellement fixé à 6 000 leucocytes/μL de

sang ou avec le nombre de globules blancs réel du patient lorsqu’il est connu [4 ;

5 ; 6].

Au cours de notre stage au CHU-MEL, dans le secteur hémato- parasitologie,

nous avons remarqué que la densité parasitaire de certains patients se calcule

exclusivement par le nombre de globules blancs standard (6 000leucocytes/μL)

qui parfois est différent du nombre de globules blancs réel du patient lorsque la

Introduction




2

numération leucocytaire est faite. Nous nous sommes donc demandés, si la valeur

6000 n’impactait pas sur le résultat de densité parasitaire des patients ?

Ainsi, notre travail a pour but de s’assurer que l’estimation de la parasitémie par

le calcul de la densité parasitaire avec la méthode de calcul utilisant le coefficient

6000 leucocytes/μL n’introduit pas de biais (surestimation ou sous-estimation)

chez les patients consultants le CHU-MEL. En effet, un tel biais pourrait avoir

des répercussions importantes, pour les études qui font un lien entre symptômes

et densité parasitaire, d’une part et densité parasitaire et efficacité du traitement

d’autre part.

Le présent travail a eu alors pour objectif général d’apprécier l’utilisation de la

valeur standard et de la valeur réelle de leucocytes pour l’établissement de la

densité parasitaire au cours du paludisme à Plasmodium falciparum chez les

patients consultant le CHU-MEL.

Spécifiquement il s’est agi de :

1. réaliser la numération des globules blancs pour les patients suspects de

paludisme ;

2. calculer la Densité Parasitaire de deux manières ;

3. Apprécier les résultats des deux types de calcul de la DP.

Le présent document comporte dans une première partie la synthèse

bibliographique sur le paludisme. La deuxième partie prend en compte la

méthodologie. Enfin, la dernière partie présente les résultats obtenus et le

commentaire suscité.




3

1ère partie : Synthèse bibliographique

1ère partie : Synthèse bibliographique




4

1 Paludisme

Historique du paludisme

Le paludisme est connu par ses manifestations cliniques depuis l’ère antique. Les

termes italiens Mal’aria « mauvais air » ou encore latin paludis, « marais » furent

décrits, entre autres, par Hippocrate (460-377 av JC), qui établit d’ailleurs une

relation pertinente entre la date et le lieu où les malades vivent lorsqu’ils

succombent.

En 1880 Alphonse Laveran [7], médecin militaire français, observe en Algérie des

éléments cellulaires intra-érythrocytaires n’appartenant à aucune lignée

hématologique ; l’hématozoaire du paludisme est découvert. En 1897, le

britannique Sir Ronald Ross, médecin de l’armée des Indes prouve le rôle des

moustiques dans la transmission du paludisme aviaire, et Giovanni-Battista

Grassi, en 1898 en Italie, démontre que l’anophèle est le vecteur du paludisme

humain. La phase de division dans le foie ne sera identifiée que bien plus tard en

1948 par Short et Garnham. Ils permettent ainsi de compléter la connaissance du

cycle du parasite et d’expliquer les rechutes de la maladie observées dans certains

cas. La seconde guerre mondiale empêchant l’accès aux plantations indonésiennes

de quinquina ouvrait la voie du développement et de l’utilisation des premiers

antimalariques de synthèse (amino-4- quinoléines). La lutte contre le vecteur

devenait possible grâce à la découverte des insecticides à action rémanente qui

permirent l’éradication de l’affection dans des régions d’Europe encore atteintes,

et dans certaines îles. Les résistances devaient apparaître rapidement, ruinant les

espérances d’éradication du paludisme [7].

Définition

Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria (mauvais air) est une

affection parasitaire fébrile, grave due à la multiplication dans les hématies d'un




5

hématozoaire du genre Plasmodium, transmis à l'homme par la piqûre d'un

moustique, l'Anophèle femelle infestée. [8, 9]

Epidémiologie

En 2009, le paludisme reste la première endémie parasitaire mondiale. On estime

que près de la moitié de la population mondiale vit en zone d’endémie. De nos

jours, le nombre d’accès palustres survenant chaque année à travers le monde

semble diminuer [8], il est estimé entre 250 à 500 millions, entraînant la mort

d'environ 750.000 à 1 million de personnes, parmi lesquelles une majorité de

jeunes enfants vivant en Afrique sub-saharienne [8].

Agents pathogènes

Le paludisme est transmis par un protozoaire appartenant au genre Plasmodium.

Il existe de très nombreuses espèces de Plasmodium (plus de 140), qui infectent

diverses espèces animales ; mais seulement cinq de ces espèces sont retrouvées

en pathologie humaine [8,10]. Il s’agit de :

Plasmodium falciparum ;

Plasmodium vivax ;

Plasmodium ovale ;

Plasmodium malariae et

Plasmodium knowlesi, parasite habituel des singes (macaques)

d'Asie qui vient de passer récemment chez l'homme.

Les cinq espèces diffèrent par des critères biologiques, cliniques, par leur

répartition géographique et par leur capacité à développer des résistances aux

antipaludiques. D’emblée, il faut différencier P. falciparum des autres espèces. En

effet P.falciparum est celui qui est le plus largement répandu à travers le monde,

qui développe des résistances aux antipaludiques et qui est responsable des formes

cliniques potentiellement mortelles.




6

Vecteur

Le paludisme est transmis à l’homme par la piqûre d’un moustique culicidé du

genre Anophèles au moment de son repas sanguin. Seule la femelle, hématophage,

transmet la maladie. Elle ne pique qu’à partir du coucher du soleil avec un

maximum d’activité entre 23 heures et 6 heures [8].

Figure 1: Anophèle (vecteur du paludisme) [8]

Mode de transmission

Les modes de transmission sont variés [9]

La contamination par piqûre de l'anophèle femelle: c'est le mode habituel

de transmission de paludisme. La chaîne épidémiologique est constituée du

plasmodium, de l'anophèle et des êtres humains récepteurs ;

La contamination par voie transplacentaire ou materno-fœtale ou

congénitale ;

Le paludisme post-transfusionnel.




7

Cycle biologique des Plasmodies

Le cycle se déroule successivement chez l’homme (phase asexuée et début

de la gamétogenèse) et chez l’anophèle (phase sexuée chez l’hôte définitif). Chez

l’homme on distingue 2 phases [9]:

la phase hépatique ou pré-érythrocytaire : elle correspond à la phase

d’incubation cliniquement asymptomatique ;

la phase sanguine ou érythrocytaire : elle correspond à la phase clinique de

la maladie.

1.3.4.1 Schizogonie pré-érythrocytaire

Beaucoup de sporozoïtes inoculés par l’anophèle femelle lors de son repas

sanguin sont détruits par les macrophages mais certains parviennent à gagner les

hépatocytes. Ils se transforment en schizontes pré-érythrocytaires ou «corps bleus

» (formes multinucléées) qui, après quelques jours (sept jours pour P.falciparum

; dix jours pour P.vivax) de maturation, éclatent et libèrent des milliers de

mérozoïtes dans le sang (10 000 à 30 000 mérozoïtes en fonction des espèces).

La schizogonie hépatique est unique dans le cycle, la cellule hépatique ne peut

être infectée que par des sporozoïtes. Dans les infections à P. vivax et P. ovale,

une schizogonie hépatique retardée peut entraîner la libération dans le sang, de

mérozoïtes (hypnozoïtes) plusieurs mois après la piqûre du moustique, expliquant

ainsi les reviviscences tardives observées avec ces 2 espèces. Les hypnozoïtes

n’existent pas dans l’infection à P. falciparum (évolution d’un seul tenant) et ils

n’ont pas été mis en évidence non plus dans l’infection à P. malariae ou à P.

knowlesi.

1.3.4.2 Schizogonie érythrocytaire

Très rapidement les mérozoïtes, issus de l’éclatement des corps bleu,

pénètrent dans les globules rouges. La pénétration du mérozoïte dans l’érythrocyte




8

et sa maturation en trophozoïte puis en schizonte prend 48 ou 72 heures (en

fonction de l’espèce) et conduit à la destruction du globule rouge hôte et à la

libération de 8 (P. malariae) à 32 (P.falciparum ) nouveaux mérozoïtes. Ces

mérozoïtes pénètrent dans de nouveaux globules rouges et débutent un nouveau

cycle de réplication. Cette partie du cycle correspond à la phase clinique : la

parasitémie s’élève, le sujet devient fébrile, c’est l’accès palustre.

En l’absence de traitement, tous les parasites évoluent progressivement au

même rythme : (on dit qu’ils deviennent synchrones). Tous les schizontes

érythrocytaires arrivent à maturation au même moment, entraînant la destruction

d’un grand nombre de globules rouges de manière périodique, toutes les 24 heures

(pour P. knowlesi), 48 heures (fièvre tierce de P. falciparum, P. vivax ou P. ovale)

ou toutes les 72heures (fièvre quarte de P. malariae). En pratique on observe que

la fièvre tierce due à P. falciparum est rarement synchrone [8]. Après un certain

nombre de cycles érythrocytaires, certains mérozoïtes subissent une maturation

d’une dizaine de jours, accompagnée d’une différenciation sexuée. Ils se

transforment en gamétocytes mâles et femelles.

1.3.4.3 Sporogonie chez l'anophèle femelle

Les gamétocytes, ingérés par le moustique lors d’un repas sanguin sur un

sujet infecté, se transforment en gamètes mâles et femelles qui fusionnent en un

œuf libre, mobile appelé ookinète. Cet ookinète quitte la lumière du tube digestif,

se fixe ensuite à la paroi externe de l’estomac et se transforme en oocyste. Les

cellules parasitaires se multiplient à l’intérieur de cet oocyste, produisant des

centaines de sporozoïtes qui migrent ensuite vers les glandes salivaires du

moustique. Ces sporozoïtes sont les formes infestantes prêtes à être inoculées avec

la salive du moustique, lors d’un nouveau repas sanguin sur un hôte vertébré. La

durée du développement sporogonique des Plasmodies varie en fonction des

conditions climatiques : entre 9 et 20 jours pour P. falciparum (entre,




9

respectivement, 30°C et 20°C), un peu plus rapide pour P. vivax à températures

équivalentes, plus long pour P. malariae. (annexe 3)

Diagnostic biologique du paludisme

Le paludisme est une urgence parasitologique dont la prise en charge

nécessite un diagnostic rapide, précis et sûr afin de mettre en place un traitement

adapté [11].

Le type de diagnostic précis et plus utilisé s'effectue sur deux préparations :

le frottis sanguin et la goutte épaisse. Cet examen consiste à recueillir quelques

gouttes de sang sur une lame porte objet dégraissée, par piqûre avec un

vaccinostyle au niveau de la pulpe du doigt, du lobule de l'oreille ou au talon chez

l'enfant après désinfection [9].

Le frottis sanguin est la méthode de référence pour l’étude morphologique

des hématozoaires et pour le diagnostic différentiel entre les espèces

plasmodiales. C'est un étalement mince de sang et est coloré selon la méthode de

May-Grünwald-Giemsa (MGG) après fixation à l’alcool.

L’examen du frottis sanguin doit permettre de reconnaître l’hématozoaire,

d’en préciser l’espèce et le stade de développement.

Les critères d’identification de l’espèce en cause sont regroupés en

annexe2.

Les avantages de cette technique sont sa rapidité et la mise en évidence de

l’espèce plasmodiale en cause. Cependant, le frottis mince ne permet pas de

détecter les faibles parasitémies.

La goutte épaisse: c'est une technique de concentration des plasmodies 10

à 20 fois plus sensible que le frottis. La goutte est étalée sur un centimètre carré

environ, pour sa défibrination puis, elle est séchée, ensuite déshémoglobinisée par




10

de l'eau neutre. Cette goutte est enfin colorée par le May-Grunwald-Giemsa, de

même que le frottis.

Elles a pour avantages de détecter des parasitémies plus faibles que le frottis

sanguin et permet de mieux quantifier les parasites en causes au cours d’une

infection à plasmodium. Cependant, elle ne permet pas le diagnostic de certitude

des espèces plasmodiales en raison de la lyse des hématies qui réduit les critères

morphologiques d’identification.

Les différentes formes de paludisme.

Formes simples

La fièvre qui est le principal symptôme de l’accès palustre simple est due à

l’éclatement des rosaces qui libèrent dans le torrent circulatoire du pigment

malarique (hémozoïne). Celui-ci se comporte comme une véritable substance

pyrogène. A la suite de l’éclatement des rosaces, il y a lyse des hématies ce qui

donne l’anémie. Le foie intervient par l’activité phagocytaire des cellules de

Kuppfer, et par la transformation de l’hémoglobine libérée en bilirubine libre,

d’où le subictère [12].

Accès pernicieux

L'accès pernicieux, dû exclusivement à Plasmodium falciparum, est

essentiellement le résultat de la séquestration des hématies parasitées dans les

vaisseaux au niveau des différents organes, en particulier du cerveau. II y a une

formation de rosettes, par adhérence des hématies parasitées entre elles et avec

des hématies saines. En effet, la présence de tubérosités (ou knobs), à la surface

des hématies ralentit la circulation par des phénomènes d'autoagglutination et de

cytoadhérence par des ligands réagissant avec des récepteurs des endothéliums

vasculaires. Ceci provoque une anoxie, entraînant une obnubilation puis un coma

fébrile. Mais d'autres phénomènes interviennent comme la production de




11

cytokines, le TNF (tumor necrosis factor) étant un marqueur de gravité du

paludisme [12].

Immunité antipalustre

Immunité innée contre le paludisme

Elle s’observe dans certaines hémoglobinopathies telles que la

drépanocytose, la thalassémie et le déficit en G6PD. Dans ces cas il y a une

inhibition du développement plasmodial. Les sujets ne présentant pas d’antigènes

Duffy sur leurs hématies (fréquent dans la race noire) sont naturellement résistants

à l’infection par P.vivax [13].

Immunité acquise

Chez les populations des régions où le paludisme est endémique, l’infection

palustre induit de fortes réponses immunes humorales, impliquant une production

à prédominance d’IgM et d’IgG mais aussi d’autres isotypes d’immunoglobuline,

notamment les sous classes d’IgG : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. Bien qu’une grande

proportion de ces immunoglobulines soit non spécifique au paludisme, reflétant

une activation polyclonale de la lignée lymphocytaire B, plus de 5% d’entre elles

sont des anticorps spécifiques qui réagissent avec une grande variété d’antigènes

des parasites.

Après plusieurs années d'infections répétées, l’homme peut acquérir une

immunité, appelée prémunition. Souvent, cette immunité n'est pas stérilisante car

il n'a jamais été démontré de façon formelle de disparition totale des parasites de

P. falciparum en l'absence de traitement, aussi elle est labile car la prémunition

disparait en l'absence de contacts fréquents entre l'être humain et le parasite (elle

disparait après 12 à 24 mois si le sujet quitte la zone d'endémie)[13].




12

2 Globules blancs

Définition

Les globules blancs, encore appelés leucocytes, sont des cellules sanguines

à l’instar des globules rouges et des plaquettes. Ce sont les seules cellules

sanguines à posséder un noyau et les organites habituels et jouent un rôle essentiel

dans la lutte de l’organisme contre les maladies. Contrairement aux globules

rouges, les globules blancs peuvent quitter la circulation sanguine par un

mécanisme appelé diapédèse. Ainsi, ils se rendent aux régions où ils instaurent la

réaction inflammatoire et immunitaire. Leur durée de vie est de quelques heures

à quelques jours [14 ;15].

Il existe 3 types de globules blancs : les polynucléaires, les lymphocytes et les

monocytes.

Hématopoïèse des globules blancs.

L’hématopoïèse des globules blancs se fait dans la moelle rouge des os plus

spécifiquement dans les os plats du tronc (omoplates) et de la ceinture (os iliaques)

ainsi que dans les épiphyses des humérus et des fémurs. Dans cette moelle rouge

se trouvent entre autres des cellules souches qui sont à l’origine des trois types de

cellules sanguines : les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes.

Ces cellules souches appelées hémocytoblastes réagissent à certaines

hormones (messagers chimiques) et se différencient par la suite pour former les

globules blancs et les autres types de cellules sanguines [15].

La figure ci-après résume l’hématopoïèse des globules blancs.




13

Figure 2 : l’hématopoïèse des globules blancs [15].

Caractéristiques et rôles des globules blancs.

Les globules blancs constituent le système immunitaire et interviennent dans

la lutte contre les infections en défendant l'organisme contre les agressions

extérieures. Certains globules blancs interviennent également au cours de la

réaction allergique. Ils sont principalement présents dans le sang, les ganglions,

la rate, les amygdales, les végétations et la lymphe. Leurs rôles sont multiples et

sont définis suivant le type de globules blancs. Les rôles de ces derniers sont les

suivants :




14

la Production d'anticorps ;

la Production de protéine ;

l’attaque des parasites de l'organisme et leurs destructions ;

l’augmentation de la perméabilité des capillaires sanguins ;

l’empêchement de la coagulation dans les vaisseaux sanguins ;

l’activation de la réaction inflammatoire ;

le déclenchement de réaction allergique ;

la destruction des cellules infectées ou mortes [15].

Numération des globules blancs.

Pour faire la numération des globules blancs on dilue une quantité précise de

sang dans une quantité précise d’un liquide de dilution qui lyse les hématies et

conserve parfaitement les cellules nucléées du sang. Il existe plusieurs types de

liquide de dilution le plus utilisé est le lazarus.

Après la dilution du sang, une goutte de cette dilution est déposée sur une

cellule ou dans une chambre en numération divisée en rectangle ou en carrée de

tel manière que le volume total de la chambre soit bien connu. Puis l’on recouvre

le liquide d’une lamelle. On compte les globules blancs au microscope à l’objectif

10 ou 40 dans 5 bandes horizontales consécutives de préférence du 3ème à la

7ème bande, puis l’on calcule le nombre de globules blancs par mm3.

Valeurs normales :

Homme : 5 à 10 mille ;

Enfant de moins d’un an : 6 à 13 mille ;

Nouveau-né : 10 à 30mille [16].




15

2ème partie : Matériel et méthodes d’étude

2ème partie : Matériel et méthodes d’étude




16

1 Cadre

Cadre institutionnel

Notre formation a été effectuée à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi

(EPAC) plus précisément dans le département de génie de biologie humaine

(GBH) de Novembre 2012 à Mars 2015.

Fruit de la coopération bénino-canadienne, le CPU entendez Collège

Polytechnique Universitaire avait ouvert ses portes aux premiers étudiants (tous

sexes confondus) en février 1977. Situé dans l’enceinte de l’Université

d’Abomey-Calavi, le CPU était un établissement public de formation scientifique

et technique supérieure orientée vers la professionnalisation. En tant que tel, il

était un maillon capital de notre système universitaire, mieux du système éducatif

béninois. Le CPU formait aussi bien des étudiants nationaux qu’étrangers.

Le 25 février 2005, le Président de la République signe un Décret (N° 2005-

078) portant création, attribution, organisation et fonctionnement de l’Ecole

Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), « une Ecole Supérieure à caractère de

Grande Ecole » en lieu et place du CPU et dépendant directement de l’Université

d’Abomey-Calavi. Elle est actuellement dirigée par le Professeur Félicien

AVLESSI.

Elle a pour missions d’assurer :

Des formations conduisant essentiellement au diplôme de Licence

Professionnelle;

Des formations conduisant essentiellement au diplôme d’Ingénieur

de Conception et à la Maîtrise Professionnelle dans les secteurs

industriel et biologique ;




17

La formation aux Diplômes d’Etudes de Troisième Cycle,

conformément aux textes en vigueur à l’Université d’Abomey-

Calavi ;

La recherche scientifique et technique ;

Le perfectionnement et la formation continue des personnels des

entreprises privées et de toutes structures étatiques qui en expriment

le besoin.

Elle regroupe deux (02) grands secteurs englobant des départements

d’étude ; ainsi nous avons :

Le secteur industriel composé des départements de :

Génie Civil (GC) ;

Génie Electrique (GE) ;

Génie Mécanique et Energétique (GME) ;

Génie Informatique et Télécommunication (GIT) ;

Génie Bio Médical (GBM).

le secteur biologique, composé des départements de :

Génie d’Imagerie Médicale et de Radiobiologie (GIMR) ;

Génie de l'Environnement (GEn) ;

Production et Santé Animales (PSA) ;

Génie de Technologie Alimentaire (GTA),

Génie de Biologie Humaine (GBH) où nous avons suivi notre

formation.




18

1.2 Cadre technique

L’étude s’est déroulée au laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire de

la Mère et de l’Enfant Lagune sur une période de 12 semaines, à Cotonou capitale

économique de la République du Bénin, plus précisément dans le 5ème

arrondissement au quartier Missèbo (TOKPA HOHO).

1.3 Description du Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de

l’enfant

Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’enfant (CHU-MEL)

est un établissement de référence de soins préventifs, curatifs, promotionnels et

réadaptatifs dans le domaine de la gynécologie, de l’obstétrique et de la pédiatrie.

C’est un centre public à caractère social, doté de la personnalité morale et d’une

semi-autonomie financière.

1.3.1 Situation géographique

Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’Enfant Lagune

(CHU-MEL) est situé au bord de la lagune de Cotonou, voie d’eau reliant le lac

Nokoué à l’Océan Atlantique.

1.3.2 Historique

Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’enfant (CHU-MEL)

est créé le 17 Mars 1958. Il est resté la seule maternité de référence jusqu’en 1978,

année de création de la Clinique Universitaire de Gynécologie et d’Obstétrique

(CUGO).

Il fait partie de l’espace hospitalier universitaire depuis le 03 août 1998. A

ce titre, il constitue un cadre de formation du personnel de la santé et de la

protection sociale et de recherche en matière de santé.




19

Anciennement appelé Maternité Lagune de Cotonou, par décret n° 2002 -

423 du 07 octobre 2002, le centre est devenu Hôpital de la Mère et de l’Enfant-

Lagune à la suite de sa fusion au Centre de Santé Maternelle et Infantile de

Cotonou, une formation sanitaire située de façon contiguë sur un même espace

géographique.

Il est actuellement la 2ème maternité de référence après la CUGO au plan

national. Son importance est incontestable.

En effet, Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’enfant

(CHU-MEL) enregistre 30 % de l’activité obstétricale de la ville de Cotonou.

Elle reçoit également des patientes d’autres départements du pays et même

d’autres pays de la sous-région.

Pour faire face aux besoins d’une demande sans cesse croissante, de

nombreux efforts sont fournis depuis 1988 afin d’agrandir la capacité hospitalière

qui atteint actuellement 260 lits et berceaux, et de fournir un personnel de plus en

plus compétent et suffisant.

1.3.3 Présentation du laboratoire

Le laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’Enfant

Lagune est un laboratoire pluridisciplinaire et de grande renommée. Il est dirigé

par Pr. Aurore OGOUYEMI HOUNTO qui, en sa qualité de responsable

coordonne la bonne marche des différentes activités du laboratoire. Il comprend

une salle de prélèvement, des salles de garde et 04 grandes sections à savoir : la

section Sérologie, la section Biochimie, la section Parasitologie-Hématologie-

Hémostase et la section de Bactériologie.

Les différentes activités réalisées dans ce laboratoire sont regroupées dans

le tableau ci-après :




20




21

2 Matériel et Méthodes

2.1 Matériel

2.1.1 Matériel de prélèvement

Le matériel de prélèvement comprend :

un plateau de prélèvement ;

du coton hydrophile ;

une pissette d’alcool ;

des aiguilles ;

des vaccinostyles ;

des lames porte-objet ;

des lamelles couvre-objet ;

un marqueur ;

un stylo ;

des gants ;

des tubes EDTA.

2.1.2 Matériel pour la réalisation des examens :

2.1.2.1 Réalisation de la goutte épaisse et du frottis mince

Nous avons le matériel ci- après :

un bac de coloration ;

un râtelier à lame ;

une minuterie ;

du méthanol ;

une solution de Giemsa ;

un microscope électrique binoculaire ;




22

un compteur manuel ;

un flacon d’huile à immersion ;

des Compresses ;

du Sang veineux ou capillaire.

2.1.2.2 Matériel pour la numération des globules blancs

Il est composé de :

sang veineux sur EDTA ;

liquide de dilution ;

cellule de Malassez ;

tubes à hémolyse ;

micropipettes ;

gants ;

lamelles couvre objet ;

compteur mécanique ;

microscope biloculaire.

Méthode d’étude

2.2.1 Type d’étude et période

Il s’est agi d’une étude prospective qui s’est déroulée de mai 2015 à Août

2015.

2.2.2 Population d’étude

Notre enquête a porté sur 482 patients admis au laboratoire du CHU-MEL

et répondant aux critères d’inclusion ci-après.

2.2.3 Critères d’inclusion

Sont inclus dans notre étude :




23

tous les patients suspectés du paludisme et ayant sur leur bulletin

d’examen GE/DP ou FS-DP sans distinction d’âge de sexe ni de

nationalité.

2.2.4 Critères de non inclusion

Les patients suspects de paludisme sous traitement.

2.3 Échantillonnage

2.3.1 Variables étudiées

Pour déterminer l’impact du taux réel de leucocyte dans le calcul de la

densité parasitaire, plusieurs variables ont été étudiés à savoir:

le sexe ;

l’âge ;

la provenance ;

le résultat de la densité parasitaire.

2.3.2 Collecte des données

Une fiche d’enquête a été réalisée pour la collecte chez les patients, des

informations entrant dans le cadre de l’étude. (Annexe 1).

2.4 Réalisation des analyses

Phase pré-analytique

Cette étape regroupe toutes les conditions à remplir avant les manipulations

au laboratoire. Elle consiste à :

porter une blouse blanche et propre ;

se laver les mains ;

porter les Gants ;

regrouper le matériel de travail.




24

Phase analytique

Cette phase concerne les différents examens de l’étude tels que la goutte

épaisse, le frottis sanguin et la numération leucocytaire.

2.4.1 Le frottis sanguin et la goutte épaisse

2.4.1.1 Technique de confection

Des frottis sanguin et goutte épaisse ont été confectionnés et colorés selon

la technique suivante préconisée par la procédure de standardisation du diagnostic

biologique du paludisme :

homogénéiser en retournant délicatement le tube de prélèvement (si

prélèvement veineux) ;

prélever les gouttes à l’aide d’une pipette Pasteur, d’une micropipette

ou de l’une des extrémités de la lame rodée ou de la lamelle ;

déposer la goutte (environ 2 à 5µl) de sang qui doit servir à la

réalisation du FS au milieu de la lame ;

déposer celle de la GE (environ 4 à 10µl) a environ 1 cm du bord de

la lame et à 1 cm de la goutte du frottis ;

poser la lame portant les gouttes sur une surface plane.

utiliser une lame à bord rodé propre ou une lamelle pour étaler ;

incliner la lame à bord rodé ou la lamelle à 45° au contact de la

première goutte de sang déposé au milieu de la lame (ne pas attendre

que le sang se répartisse entièrement sur toute la largeur de la lame

rodée ou de la lamelle servant à l’étalement) ;

tirer d’un geste uniforme et continu le frottis jusqu’à épuisement de

la goutte de sang.




25

Pour la Goutte Epaisse :

utiliser le coin de la lame ou de la lamelle qui a servi à confectionner

le FS ;

étaler en partant du milieu de la deuxième goutte de sang par au plus

six (06) mouvements circulaires continus en spirale pour obtenir une

couche épaisse et uniforme ayant à peu près 1 cm de diamètre.

laisser la lame confectionnée à plat, horizontalement sur la paillasse

ou sur un plateau à lames ou sur un râtelier pour permettre un séchage

uniforme ;

identifier la lame en inscrivant sur la base du FS séché les initiales

ou le code du malade ainsi que la date.

Figure 3 : Confection de la goutte épaisse et du frottis sanguin

mince sur une lame (Didier DJOSSOU)

2.4.1.2 Technique de coloration

Plonger deux à trois fois le frottis mince dans un bocal contenant le

méthanol en évitant son contact avec la GE ;

retirer le frottis ;

disposer la lame sur un râtelier avec le frottis orienté vers le bas ;

laisser sécher a la température du laboratoire.

déshémoglobiniser la GE en trempant la partir de la lame portant la

GE dans l’eau distillée pendant 2 à 3 minutes ;




26

retirer la lame ;

égoutter la lame ;

laisser sécher la lame à la température du laboratoire.

mettre les lames dos à dos sur le portoir à lame en veillant à ce que

toutes les GE soient du même côté ;

remplir le bac de coloration avec la quantité nécessaire de colorant

de Giemsa dilué à 10% ;

plonger le portoir à lames dans le bac jusqu’à immersion totale des

lames ;

mettre la minuterie en marche ;

laisser agir pendant 10 à 15 minutes ;

retirer le portoir à lames ;

rincer les lames en immergeant délicatement le portoir à lames dans

un bac rempli d’eau propre ;

rincer une seconde fois de la même façon ;

enlever les lames une à une du portoir avec une pince ;

placer les lames sur l’égouttoir, la GE orientée vers le haut ;

laisser sécher à la température du laboratoire.

2.4.1.3 Technique de lecture des lames

Mettre la lame sur la platine ;

faire la mise au point à l’objectif ×10 ;

rechercher toujours à l’objectif×10, une partie bien colorée de la lame

de GE et FS, sans dépôt de colorant et riche en cellule séparées les

unes à côté des autres ;

déposer une goutte d’huile à immersion sur l’étalement ;

faire la mise au point ;

parcourir la lame suivant la méthode de Rampart ;




27

procéder à l’identification correcte de l’espèce plasmodiale sur le FS

si la GE est positive ;

rechercher une hématie parasitée ;

comparer le trophozoïtes observé aux espèces plasmodiale.

2.4.1.4 Détermination de la densité parasitaire

Compter dans chaque champ microscopique, les parasites en même temps

que les leucocytes. Le nombre de leucocytes à compter varie entre 200 et 500

selon les cas suivants :

après avoir compté 200 leucocytes, si le nombre de parasite compté

est supérieur ou égal à 100, la lecture s’arrête et on calcule la densité

parasitaire ;

après avoir compté 200 leucocytes, si le nombre de parasite compté

est inférieur à 100, il faut continuer jusqu’à 500 leucocytes avant de

calculer la densité parasitaire ;

si aucun trophozoïte n’est trouvé, il faut parcourir 100 champs

microscopiques sur la lame de GE avant de la déclarer négative ;

lorsque le nombre de parasites est très élevé, compter les parasites

dans un quart (¼) de chaque champ microscopique en même temps

que tous les leucocytes du champ jusqu’à atteindre 100 leucocytes ;

Le nombre total de parasites est obtenu en multipliant la somme de parasites

comptés par quatre (4) ;

inscrire le résultat obtenu dans le cahier de paillasse ;

appliquer ensuite la formule de calcul de la densité parasitaire.




28

Numération des globules blancs

Elle consiste à diluer une quantité précise de sang avec une quantité précise

d’un liquide de dilution puis à monter cette dilution sur une cellule ou une

chambre en numération et à compter les globules blancs afin de calculer le nombre

de globules blancs par mm 3.

Technique de numération

Il a été procéder de la manière suivante, pour faire la numération des

globules blancs.

Dilution

La dilution se fait au 1/20. Pour cela :

disposer les tubes et les identifier ;

pipeter dans chaque tube 475µl du liquide de dilution à l’aide d’une

micropipette ;

pipeter à l’aide d’une micropipette 25ul de sang ;

essuyer le bout du cône et refouler le sang dans le liquide de dilution ;

homogénéiser et laisser reposer pendant 5min.

Montage de la cellule

Rincer correctement la cellule à numération et l’essuyer avec un

linge propre non pelucheux ;

adapter la lamelle à la cellule ;

homogénéiser à nouveau le mélange ;

remplir la cellule à numération en faisant montée la dilution par

capillarité sous la lamelle jusqu’à ce que se forme un petit bourrelet

sur les bords ;

laisser sédimenter les éléments pendant trois à cinq minutes.




29

Comptage

faire après sédimentation la mise au point à l’objectif 10 puis la

parfaire à l’objectif 40 ;

le compte des globules blancs se fait sur cinq bandes horizontales

consécutives de préférence de la 3ème à la 7ème bande puis l’on

calcule le nombre de globules blancs par mm3.

Méthodes de calcul

Calcul du nombre de globules blancs sur la cellule de malassez.

Nombre de GB /mm3 de sang = n ×1

𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛×

1

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒𝑠 5𝑏𝑎𝑛𝑑𝑒𝑠

Nombre de GB /mm3 de sang = n ×40

Calcul de la densité parasitaire (DP) sur GE

Le calcul a été fait de deux manières. La première est celle de l’OMS établie

à partir du nombre de leucocytes par microlitre de sang, fixé à 6 000/μL (DPS) et

la seconde est celle utilisant le nombre de leucocytes réel du patient (DPR).

On a donc :

Selon la méthode de l’OMS :

DPS= 𝒏𝒐𝒎𝒃𝒓𝒆 𝒅𝒆 𝒑𝒂𝒓𝒂𝒔𝒊𝒕𝒆𝒔 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒕é𝒔

𝒏𝒐𝒎𝒃𝒓𝒆 𝒅𝒆 𝒈𝒍𝒐𝒃𝒖𝒍𝒆𝒔 𝒃𝒍𝒂𝒏𝒄𝒔 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒕é𝒔𝒙 𝟔𝑶𝑶𝑶

Selon la méthode utilisant le nombre de leucocytes réel du patient

DPR = 𝒏𝒐𝒎𝒃𝒓𝒆 𝒅𝒆 𝒑𝒂𝒓𝒂𝒔𝒊𝒕𝒆𝒔 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒕é𝒔

𝒏𝒐𝒎𝒃𝒓𝒆 𝒅𝒆 𝒈𝒍𝒐𝒃𝒖𝒍𝒆𝒔 𝒃𝒍𝒂𝒏𝒄𝒔 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒕é𝒔𝒙 𝑵𝑹𝑩




30

Avec :

6000 le nombre moyen de leucocytes chez un sujet béninois normal

(PNPL).

NRB : le nombre réel de leucocytes du patient énuméré.

Traitement des données

Les informations recueillies à propos de la numération des globules blancs

et de la goutte épaisse ainsi que les résultats sont réunis dans un tableau (fiche

d’enquête en annexe1).

Les informations ont été saisies et analysées avec le tableur Excel 2010 et

les logiciels suivants :

EpiData 3.1 ;

Stata dans sa version SE/11.

Une étude analytique a permis d’établir une comparaison entre les deux

types de calcul de D.P. Les différents pourcentages ont été comparés à l’aide du

test de Student. Pour l’ensemble des tests p < 0,05 a été considéré comme

statistiquement significatif avec un intervalle de confiance égale à 95%.




31

3ème partie : Résultats et Discution

3ème partie : Résultats et Discussion




32

1 Résultats

Tableau I : Répartition des patients suivant la tranche d’âge et le sexe

L’analyse de ce tableau montre une répartition inégale de la population

d’étude en fonction de l’âge et du sexe. Les patients de sexe féminin représentent

62,24% (300/482) contre 37,76% (182/482) pour les patients de sexe masculin.

Soit un sexe ratio de 1.65 (300/182) en faveur du sexe féminin. Les enfants de

moins de cinq ans sont les plus représentés soit 52,90% (255/482).

Tableau II : Prévalence globale du portage parasitaire

Nombre de cas I.P (%)

Négatif 286 59,34%

Positif 196 40,66%

Total 482 100%

Sur les 482 GE/DP faites, 196 sont positives. L’I.P est donc de 40.66%.

Tableau III : Prévalence du portage plasmodial suivant le sexe




33

Sur les 196 cas de GE/DP+, nous avons trouvé 92 cas chez les patients de

sexe masculin et 104 cas chez Les patients de sexe féminin soit des pourcentages

respectifs de 50,55% et 34,67%.

Tableau IV: Prévalence du portage plasmodial suivant la tranche d’âge

Le Tableau V présentant la prévalence du portage plasmodial suivant la tranche

d’âge nous révèle qu'il y a une forte positivité dans la tranche d’âge des moins de

cinq ans (60,20%).

Figure 4 : Prévalence du portage plasmodial selon la provenance

L’analyse de cette figure montre une répartition inégale de la population

d’étude en fonction de la provenance. Les patients hospitalisés représentent

79,46% (383/482) contre 20,54% (99/482) pour les patients externes.

L’analyse de cette même figure révèle que sur les 196 patients impaludés,

167 étaient hospitalisés ; soit un pourcentage de 85,20 contre un pourcentage de

14,80 (29/196) externes.

Négatif Positif

Interne 216 167

Externe 70 29

216

167

7029

0255075

100125150175200225250




34

Tableau V : Caractéristique du taux réel de leucocytes

L’analyse de ce tableau montre que la médiane du taux réel de leucocytes

est de 10920 avec un écart interquartile de 10380, le taux minimal est de 2400 et

le plus élevé est de 74000.

Figure 5 : Répartition du taux réel de leucocyte par rapport à la valeur

standard (6000) fixé par l’OMS.

Légende :

Série 1 La répartition des effectifs du taux des leucocytes

Série 2 La répartition des fréquences du taux des leucocytes

L’analyse de cette figure nous permet de dire que sur les 196 taux de

leucocyte réalisé, seul un patient a un nombre de leucocyte égal à 6000 soit un

pourcentage de 0,51%.

0255075

100125150175

de 6000 6000 de 6000

moins égal a plus

Série1 36 1 159

Série2 18,38 0,5 81,12

361

159

18,380,5

81,12




35

La probabilité pour qu’un patient ait un nombre de leucocyte égal à 6000

pour notre étude est donc de 0,51.

Figure 6 : Répartition du taux réel des leucocytes suivant les tranches d’âges.

L’analyse de cette figure révèle que la tranche d’âge de moins de 5 ans est

celle contenant le plus grand nombre de patient ayant un taux de leucocyte

supérieur à 6000 (108 /196) soit un pourcentage de 67,92.

Tableau VI : Caractéristiques comparatives des parasitémies obtenues par les

deux méthodes de calcul (DPS et DPR)

L’analyse de ce tableau montre qu’il existe une différence entre les

médianes de la DPS et DPR avec des médianes respectivement égale à 7775,5 et

12510,5.

La comparaison des médianes des DPS et DPR a été réalisée avec le test de

Student. La valeur de p < 0,05 permet de dire que la différence entre les deux

densités parasitaires est considérée comme statistiquement significative.

DP standard DP réelle P value

Médiane (Leucocyte/µL) 7775.5 12510,5

EIQ [1294 - 24676,5] [2180,5 - 41573,5] 0,0029

valeurs extrêmes 34 - 591340 35 - 711010

Total 196

020406080

100120

[0 ; 5[ [5 ; 15[ [15 ; 80[

≤6000 10 10 17

> 6000 108 38 13

10 10 17

108

38

13




36

Figure 7: Proportion de concordance et de discordance des DP calculées par la

méthode standard et celle du compte des blancs.

L’analyse de la figure révèle que sur les 196 densités parasitaires calculées,

99,5% des résultats étaient discordants contre 0,5% concordant.

Figure 8 Proportion des DP sous-estimées et surestimées au sein des discordants

L’analyse de cette figure révèle que sur les 195 densités parasitaires

Discordantes, 81,54% des résultats étaient surestimés contre 18,46% sous-

estimés.

18,46%

81,54%

DP discordant sous-estimation

DP discordantsurestimation

0

20

40

60

80

100

DP discordant DP concordant

Pourcentage 99,5 0,5

99,5

0,5




37

2 Discussion

Cette étude réalisée au Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de

L’Enfant-Lagune a eu pour objectif principal, l’appréciation de la densité

parasitaire standard et de la densité parasitaire réelle pour l’établissement de la

densité parasitaire au cours du paludisme à Plasmodium falciparum chez les

patients consultants le laboratoire du CHU-MEL.

Au terme de notre étude, il ressort que parmi les 482 GE / DP réalisées,

196 patients hébergeaient le parasite du paludisme, soit 40,66%. Parmi ces 196

cas de paludisme diagnostiqués, la tranche d’âge des moins de 5 a été la plus

touchée avec une prévalence de 60,20%. Nos résultats sont comparables à ceux

de Jain M et al. en 2005[17].

Les densités parasitaires étaient calculées d’une part avec le facteur 6000

leucocytes/μL et d’autre part avec le taux réel de leucocytes. La différence globale

observée entre les deux types de densités parasitaires était statistiquement

significative (p< 0,05). Les très fortes parasitémies trouvées dans notre étude

pourraient s’expliquer par l’âge relativement jeune (< 5 ans) des enfants inclus

dans notre étude.

La valeur médiane de 10920 leucocytes /μL de sang trouvée dans notre

étude est nettement supérieure au coefficient standard 6000 leucocytes/μL utilisé

par l’OMS. Cela s’explique d’une part par le fait que notre étude a pris en compte

en majorité les enfants et surtout les nouveaux nés et d’autre part par le fait que

le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’Enfant Lagune reçoit en

particulier les enfants et les femmes enceintes.

L’utilisation du coefficient 6 000 leucocytes/μL dans le calcul de la densité

parasitaire serait donc inadaptée à la réalité au CHU-MEL. Nos résultats

corroborent avec ceux de McKenzie et al. [18] qui avaient noté des médianes de

leucocytes plus basses que les nôtres en Thaïlande en 1998 [18] et au Pérou en




38

1999, et sont semblables à ceux de Adu-Gyasi et al. au Ghana [19], qui ont trouvé

une médiane de 10 000 leucocytes/μL. Ces auteurs ont aussi démontré que la

densité parasitaire calculée avec un coefficient de 10 000 se rapprochait plus de

celle obtenue avec le nombre réel de leucocytes du patient que l’estimation avec

la valeur de 8 000 recommandée par l’OMS. Ils contrastaient cependant avec ceux

de A.M.Dorkenoo et al. [3] en 2013 qui ont trouvé que L’utilisation du coefficient

8 000 (leucocytes/μL) dans le calcul de la densité parasitaire au cours de

l’infestation à P. falciparum était adaptée chez les enfants âgés de 6 mois à 5 ans

au Togo.

La très forte proportion de discordance des DP calculées par la méthode

standard et celle du compte des blancs obtenue et le pourcentage très élevé des

patients ayant une densité parasitaire surestimées montre que l’utilisation du

coefficient 6000 leucocytes/µl ne rend pas compte de la réalité dans notre étude,

d’autant plus que, la valeur de la densité parasitaire est un des critères de gravité

du paludisme selon l’OMS. Aussi le traitement de l’accès palustre simple n’est

pas identique à celui du paludisme grave, d’où la nécessité de précision dans la

détermination de la densité parasitaire. Nos résultats sont contraires à ceux de

Jeremiah et al. [20] au Nigéria, qui ont noté une surestimation de la densité

parasitaire obtenue avec le coefficient 8 000.




39

Conclusion

Cette étude prospective a été menée dans la période de Mai à Août 2015 sur

482 patients, venus en consultation au laboratoire du CHU-MEL pour suspicion

de paludisme. Nous y avons apprécié l’utilisation de la densité parasitaire réelle

et de la densité parasitaire standard pour l’établissement de la densité parasitaire

au cours du paludisme à Plasmodium falciparum.

Au terme de notre étude, nous avons retenu qu’il existe un écart

statistiquement significatif entre la densité parasitaire réelle et la densité

parasitaire standard p < 0,05. Le calcul de la densité parasitaire avec le coefficient

6000 introduit un biais vraiment grand dans le calcul de la densité parasitaire des

patients du CHU-MEL et n’est donc pas adapté à notre population d’étude.

Conclusion




40

Suggestions

Au vu de ces résultats,

Nous suggérons :

Aux cliniciens, d’associer systématiquement la numération des globules

blancs à la Goutte Epaisse demandée pour les patients admis en consultation pour

des cas de paludisme.

Aux autorités du CHU-MEL, de fournir au laboratoire les réactifs

nécessaires pour la réalisation des deux types d’examens GE- DP/NB.

Puisqu'il est établi l’existence d’un impact non négligeable du taux réel de

leucocytes sur le calcul de la densité parasitaire au sein de notre population, nous

suggérons des études plus approfondies, afin de mettre en évidence le lien existant

entre le paludisme et les globules blancs et le rôle des globules blancs dans la

physiopathologie du paludisme.

A l’OMS et aux autorités du Ministère de la santé, de subventionner la

réalisation de la numération des globules blancs pour la réalisation de la GE-DP

afin d’assurer aux patients une meilleure prise en charge du paludisme.

A tous les laboratoires informatisés, en particulier celui du CHU-MEL,

l’utilisation d’un logiciel appelé « Densité réelle, rapide et fiable » réalisé à cet

effet afin de faciliter au technicien le calcul de la densité parasitaire.

Suggestions




41

Références bibliographiques

[1] NKOUSSA S., Comportements de la mère et prévalence du

paludisme chez les enfants de moins de cinq ans au Cameroun. Mémoire pour

l’obtention du diplôme de master professionnel en démographie, 2012, 94.

[2] HIEN S., ANGBO K. M.A, DASSE S.R, YEBOAH Or, N'GUESSAN

K., KOUACOU A.P.V, SOMBO M.F. L’haptoglobine chez les enfants atteints

de paludisme grave a Plasmodium falciparum de 0 à 15 ans : relations avec

l’âge, la parasitémie et le taux d’hémoglobine Journal of Applied Biosciences

2014, 76: 6425-6432.

[3] DORKENOO A.M, LAYIBO Y., AGBO Y.M., MORGAH K.,

AGBÈRÈ D, Numération leucocytaire et densité parasitaire dans le

paludisme simple chez les enfants âgés de 6 mois à 5 ans en milieu urbain au

Togo. Médecine tropicale 2013, 23: 4.

[4] Programme National de Lutte contre le Paludisme /Ministère de la Santé

du BENIN : Manuel de procédures opérationnelles standardisées du

diagnostic biologique du paludisme. Cotonou 2013,65; 1-3 et 11-38.

[5] Organisation Mondiale de la Santé, Module de formation à la lutte

contre le paludisme : prise en charge du paludisme, guide du participant,

2014 Genève 27, 119; 22- 25.

[6] Organisation Mondiale de la Santé, Guide pratique pour la prise en

charge du paludisme grave, 2013 3ème édition Genève 27, 83; 11-14.

[7] DOUAMBA Z., Paludisme asymptomatique chez la Femme enceinte

au centre médical Saint Camille de Ouagadougou. Diplôme d’Etudes

Références bibliographiques




42

Approfondies en Biochimie/Biologie Moléculaire, Université de Ouagadougou,

51; 3.

[8] Association Française des Enseignants de Parasitologie et Mycologie

(ANOFEL), Parasitologie médicale. Généralités et définitions, 2014,27; 4-8.

[9] FALL D., Prévalence du paludisme et des parasitoses intestinales au

niveau du centre de sante Nabil Choucair de la patte d'oie Builders – Dakar.

Thèse pour obtenir le grade de Docteur en Pharmacie (Diplome D'etat), Présentée

et soutenue publiquement le 20 Mai 2006, 140; 31- 51 et 65-66.

[10] SIALA E., BEN ABDALLAH R., BOURATBINE A., AOUN K..,

Actualités du diagnostic biologique du Paludisme. Revue Tunisienne

d’Infectiologie 2010,4: 5-9.

[11] Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française (SPILF).Prise

en charge et prévention du paludisme d’importation à Plasmodium

falciparum : recommandation pour la pratique clinique, 2007,4.

[12] CHURCH L.W, LE T.P, BRYAN J.P., Clinical manifestations of

Plasmodium falciparum malaria experimentally induced by mosquito

challenge. J Infect Dis. 1997;175: 915–20.

[13] AUBRY P., Paludisme Actualités 2015. Médecine tropicale diplôme

de médecine tropicale des pays de l’océan indien de Mise à jour le 11/01/2015.

[14] HORDE P. Santé médecine : Globules blancs, polynucléaires et

lymphocytes[en ligne] (publié en aout 2015) disponible sur< http://www. Santé

médecine.net/> (consulté le 10 Aout 2015).

[15] LORD-DUBE H., L’ITALIEN R., Hématologie, Décarie éditeur,

Montréal et Maloine éditeur, Paris. 335.




43

[16] TOPANOU A. et KLOTOE J. R., Guide des travaux pratiques

d’hématologie, ABM/GBH/EPAC/UAC. 2010 ,53; 16-17.

[17] JAIN M, KAUR M. Comparative study of microscopic detection

methods and haematological changes in malaria. Indian J Pathol microbiol

2005 ; 48: 464-467.

[18] MCKENZIE F.E, PRUDHOMME W.A, MAGILL A.J, FORNEY J.R,

PERMPANICH B., LUCAS C., ROBERT A., GASSER J

.R.,WONGSRICHANLAI C. White blood cell counts and malaria. J Infect Dis

2005; 192: 323-330.

[19] ADU-GYASI D, ADAMS M, AMOAKO S, MAHAMA E., NSOH

M., AMENGA-ETEGO S, BAIDEN F., ASANTE P., NEWTON S. OWUSU-

AGYEI S.. Estimating malaria parasite density: assumed white blood cell

count of 10,000/μl of blood is appropriate measure Central Ghana. Malar J

2012; 11: 238.

[20] JEREMIAH ZA, Uko E.K. Comparative analysis of malaria

parasite density using actual and assumed white blood cell counts. Ann Trop

Paediatr 2007 ; 27: 75-79.




44

Annexe 1

Annexe 1

FICHE D’ENQUETE 2014-2015 (CHU-MEL)

Annexes




45

Annexe 2 : Caractères d’identification de chaque espèce plasmodiale

Caractéristiques de P. falciparum

Globules rouges parasités gardent leur taille normale (ne sont pas

agrandis) ;

Les taches de Maurer peuvent être présentes ;

Les trophozoïtes sont couramment de forme annulaire en virgule

avec une chromatine parfois dédoublée (deux points de chromatine

= forme d’écouteur ou de casque), un cytoplasme régulier et fin ;

Possibilité de polyparasitisme ;

Présence parfois des formes marginales (trophozoites aplatis, accolés

à la paroi du GR ;

Schizonte mature : 12-32 mérozoïtes, de forme ovale ou irrégulière ;

le pigment malarien est rassemblé au centre. Mais, il est inhabituel

de voir les formes en développement sur des étalements de sang

périphérique (les trophozoites âgés et les schizontes) ;

Les gamétocytes sont caractérisés par leur forme en banane, en

croissant ou faux. Le pigment malarien est rassemblé autour du

noyau central. Cependant, ils n’apparaissent pas habituellement dans

le sang pendant les quatre premières semaines de l’infection.




46

Figure 9: Plasmodium falciparum à différents stade en frottis mince et en

goutte épaisse colorés au Giemsa

Caractéristiques de P. malariae

Globules rouges parasités ronds, de petite taille.- Trophozoïte

annulaire à arrondi et compacte uninucléé (un seul point de

chromatine), parfois allongé et traversant diamétralement le GR

(forme en bande ou en drapeau) ;

Une grosse tache de chromatine ;

Pigment malarien brun foncé, rassemblé en motte dans le cytoplasme

à côté du noyau ;

Les granulations de Zieman sont rarement observées (les colorations

habituelles ne les mettent pas en évidence) ;

Schizonte mature avec 6-12 mérozoïtes disposés en périphérie du

parasite tandis que les grains de pigment malarien sont disposés au

centre (forme en marguerite)

Figure 10 : Plasmodium malariae à différents stade en frottis mince et en goutte

épaisse colorés au Giemsa




47

Caractéristiques de P. ovale

GR parasités augmentent de taille, sont déformés en ovale avec un

contour souvent crénelé ou effiloché aux pôles ;

Granulations de Schüffner : petites, rouges, abondantes ;

Trophozoïte charnu et compacte, un seul point de chromatine ;

Pigmentation épaisse noire, ou granulée, marron ;

Schizonte mature de taille moyenne avec 4-12 mérozoïtes,

compactes. Les grains de pigment malarien sont gros et concentrés

au centre du cytoplasme ;

Gamétocyte sphérique avec grains de pigment malarien disséminés

dans tout le cytoplasme.

Figure 11 : Plasmodium ovale à différents stade en frottis mince et en goutte


Caractéristiques de P. vivax




48

Globules rouges parasités augmentent de taille (sont agrandis),

ronds

Cytoplasme décoloré ;

Présence de nombreuses granulations de Schüffner : petites, rouges ;

Trophozoïtes âgés amiboïdes (forme tourmentée avec un cytoplasme

plus abondant et vacuole fragmentée ;

Schizonte de forme arrondie ou irrégulière avec 16-24 mérozoïtes ;

Grains de pigment malarien brun rassemblés au centre ;

Gamétocyte sphérique, compacte

Figure 12 : Plasmodium vivax à différents stade en frottis mince et en goutte





49

Le tableau ci-après regroupe les caractéristiques des différentes espèces

plasmodiales.

Tableau VII : Caractéristiques des différentes espèces plasmodiales.




50

Annexe 3: Cycle biologique des Plasmodies

Figure 13 : Diagramme du Cycle de vie du parasite du paludisme




51

Annexe 4: Schéma d’identification des espèces plasmodiales




52

Annexe 5: Composition du liquide de dilution

Liquide de Lazarus

- Bleu de méthylène…………………0,25g

- Acide acétique……………………..30ml

- Eau distillée q.s.p…………………100ml




53

Table des matières

Enseignants permanents ....................................................................................... iv

Enseignants vacataires ........................................................................................... v

Dédicace ............................................................................................................... vi

Remerciements .................................................................................................... vii

Hommages ............................................................................................................ ix

Liste des abréviations et sigles .............................................................................. x

Liste des tableaux ................................................................................................. xi

Liste des figures ................................................................................................... xii

Résume/Abstract ................................................................................................ xiii

Sommaire ............................................................................................................ xiv

Introduction ........................................................................................................... 1

1ère partie : Synthèse bibliographique .................................................................... 3

1 Paludisme ........................................................................................................ 4

Historique du paludisme ........................................................................... 4

Définition .................................................................................................. 4

Epidémiologie ........................................................................................... 5

Agents pathogènes .............................................................................. 5

Vecteur ............................................................................................... 6

Mode de transmission ......................................................................... 6

Cycle biologique des Plasmodies ....................................................... 7

Diagnostic biologique du paludisme .................................................. 9

Les différentes formes de paludisme. ..................................................... 10

Formes simples ................................................................................. 10

Accès pernicieux .............................................................................. 10

Immunité antipalustre ............................................................................. 11

Immunité innée contre le paludisme ................................................ 11

Table des matières




54

Immunité acquise ............................................................................. 11

2 Globules blancs ............................................................................................. 12

Définition ................................................................................................ 12

Hématopoïèse des globules blancs. ........................................................ 12

Caractéristiques et rôles des globules blancs. ........................................ 13

Numération des globules blancs. ............................................................ 14

2ème partie : Matériel et méthodes d’étude........................................................... 15

1 Cadre ............................................................................................................. 16

Cadre institutionnel ................................................................................. 16

1.2 Cadre technique .......................................................................................... 18

1.3 Description du Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l’enfant 18

1.3.1 Situation géographique ..................................................................... 18

1.3.2 Historique ......................................................................................... 18

1.3.3 Présentation du laboratoire .................................................................. 19

2 Matériel et Méthodes ................................................................................. 21

2.1 Matériel ................................................................................................... 21

2.1.1 Matériel de prélèvement ...................................................................... 21

2.1.2 Matériel pour la réalisation des examens : ....................................... 21

Méthode d’étude ..................................................................................... 22

2.2.1 Type d’étude et période ....................................................................... 22

2.2.2 Population d’étude ............................................................................... 22

2.2.3 Critères d’inclusion .............................................................................. 22

2.2.4 Critères de non inclusion ..................................................................... 23

2.3 Échantillonnage .......................................................................................... 23

2.3.1 Variables étudiées ................................................................................ 23

2.3.2 Collecte des données ............................................................................ 23

2.4 Réalisation des analyses ............................................................................. 23

2.4.1 Le frottis sanguin et la goutte épaisse .................................................. 24

2.4.1.1 Technique de confection ................................................................... 24

Numération des globules blancs ....................................................... 28




55

Méthodes de calcul ................................................................................. 29

Calcul du nombre de globules blancs sur la cellule de malassez. .... 29

Calcul de la densité parasitaire (DP) sur GE .................................... 29

Traitement des données .......................................................................... 30

3ème partie : Résultats et Discution ...................................................................... 31

1 Résultats ........................................................................................................ 32

2 Discussion ..................................................................................................... 37

Conclusion ........................................................................................................... 39

Suggestions .......................................................................................................... 40

Références bibliographiques ............................................................................... 41

Annexe 1 .............................................................................................................. 44

Annexe 2 : Caractères d’identification de chaque espèce plasmodiale .............. 45

Annexe 3: Cycle biologique des Plasmodies ...................................................... 50

Annexe 4: Schéma d’identification des espèces plasmodiales ........................... 51

Annexe 5: Composition du liquide de dilution ................................................... 52

Table des matières ............................................................................................... 53

Appréciation de la densité parasitaire réelle et de la ...

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