BIOCHIMIE, 1977, 59, 125-140. Revue

Apports de la gdn6tique la connaissance du ribosome

Michel DR WXLD~ (*), Teresa CABEZ6N, Albert HrnzoG et Alex BOLLEN ~.

Laboratoire de G~n~lique, Universit~ Libre de Bruxelles , rue des Chevaux 67, B 1650 Rhode St. Gen~se (Belgique).

baetdrien.

Summary. - - In this review, ~¢¢e have tried to describe the role of the ribosome, and particularly of the 308 subunit, in the translation of the genetic message ; ~e present the current status of the genetic kno'wledge in this field. For more extensive reviews, m,e refer the interested reader to the recent publication Ribosomes (1974) [!1].

INTROD,UCTION.

Depuis que le mot biologie s ' accompagne du terme mol~culaire, quelques m6canismes fonda- mentaux de la vie ont 6t6 61ucid6s. I1 en est ainsi pour le syst6me complexe par lequel une bact6rie, cellule simple, ut i l ise l ' ensemble des informat ions n6cessaires h sa s t ruc ture e t ~ son fonc t ionnement . Ces in format ions sent contenues dans un seul des composants de la cellule, l ' ac ide d6soxyribonucl6i- que (DNA). Le main t ien et l 'u t i l i sa t ion des don- n6es g6n6tiques se fait par l ' in te rm6dia i re de trois processus cl6s : la r~plicalion, la t ranscript ion et la lraduclion.

Au cours de cette revue, nous nous a t tacherons essent iel lement fi d6finir le r61e du r ibosome lors de la t raduct ion du message g6n6tique, et nous tenterons de faire le poin t sur l%tat des connais- sances en mati6re de g6n6tique des const i tuants r ibosomiaux.

Le pe r fec t ionnement des systbmes in vitro de synthbse prot6ique a condui t fi une connaissance trbs approfondie de ce m6,canisme fondamental . L 'accunmla t ion de donn6es fi ce sujet est telle qu ' i l est hers de p r o p e r d 'en discuter ici. Notre but est de situer le r ibosome au rein du processus dent il est davantage le <( moteur ~ que le support . De nombreuses revues sent parues sur ce sujet [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. On y t rouve d 'abondantes r6f6- rences sur chacun des points r6sum6s ici.

Le processus de synthbse d 'une prot6ine peut se subdiviser en trois phases. Au cours de la pre- mibre, l ' ini t iation, le r ibosome se fixe sur le m-RNA au niveau d 'un signal d ' in i t ia t ion. Au cours de l '~longation, la t raduc t ion p rop remen t dite a lieu. Le r ibosome se d6.place le long du

(') Adresse aetuelle : Department of Biochemistry College of Agriculture and Life Science, University of Wisconsin, Madison, 'Wise. 53706 (USA).

© A qui route correspondanee dolt ~tre adress6e.

messager par 6tapes de trois nucl6otides et un acide amin6 s 'ajoute fi la chaine po lypep t id ique en croissance fi chaque 6tape. La terminaison sur- vient lorsque, au cours de son d6placement, le r ibosome rencont re un signal de t e rmina i son ; la prot6ine te rmin6e cst alors lib6r6e. Chez les pro- karyotes, od le processus est le plus simple, les composants du systbme prot6osynth6t ique sent au nombre de 139 envi ron (de 40 fi 60 acides r ibo- nucl6iques de t ransfer t ou t-RNA, 20 aminoacy l t-RNA ligases, une soixanta ine de composants du r ibosome, une dizaine, ou plus, de facteurs).

Wal le r et Harr is [8] furent les p remie r s fi sug- g6rer la comp]exil6 de la s t ruc ture du r ibosome. Les exp~.riences de Wal le r [9] d6montr~rent l 'exis- tence d 'au moins vingt prot6ines diff6rentes. A l 'heure actuelle, le nombre de prot6ines consid6- r6es comme r ibosomiales s'616ve fi 54 [10]. D'au- tre part , trois mol6cules de RNA const i tuent les deux t iers de la masse de la par t icule . Le tableau I pr6sente un synopt ique de la composi t ion du ribo- s o n l e .

ASSEMBLAGE.

Nomura fur le p r e m ie r ~ mon t r e r qu ' i l est possible de recons t i tuer in vitro des sous-unit6s riboso- miales 30.S actives au d6part de l 'ensemble de leurs composants isol6s [15]. Cette exp6r ience d6mon- tre que toute l ' i n fo rmat ion n6cessaire h l 'assem- blage est contenue dans les const i tuants r iboso- miaux. En outre, elle a mis en valeur le r61e fon- damenta l du RNA dans ce processus. Six ou sept prot6ines se l ient sp6ci f iquement au RNA 16S isol6 [16], fo rmant ainsi la <<base >> de l '6difice. Par ailleurs, le site de fixation de ces prot6ines sur le BNA est connu avec une cer ta ine pr6cis ion [17]. ] 'out r,6cemment, Hochkeppe l el ses collabo- rateurs [18] ont d6montr6 la fixation de nom- breuses autres prot6ines au RNA 16S. D'apr6s ces auteurs, l '6tat du RNA 16S d6termine la capacit6

10

126 M. de W i l d e and coll.

TABLEAU ].

Composition et propri~t~s physiques da ribosome de E s c h e r i c h i a Col i (*).

R i b o s o m e 70S : p . m . = 2 , 6 5 -t- 0 , 2 10%

R i b o s o m e 30S : p . m . = 0 , 9 10% d i m e n s i o n s : 55 X 220 X 220 A. h y d r a t a t i o n : 0,39 gr H~O/gr rib.

>- 1 molecule de RNA : 16S : 1520 nuel~otides p . m . = 0 , 5 6 10 ~

- - ~ - 21 prot~ines : p . m . m o y e n = 19 .000 (de 10 ~ 29 .000) -~- I prot . de 65 000

Ribosome 50S : p . m . = 1,55 10% d i m e n s i o n s : 115 X 230 X 230 A . h y d r a t a t i o n : 0,58 gr H,zO/gr rib.

)" 2 mol6eules de RNA : 23S = 3.500 nuel6otides p . m . ---- 1,1 10%

5S ~--- 120 nucl~ot ides p . m . = 4 lOq

- - ~ 34 prot~ines : p . m . m o y e n = 16 .300 (de 9 A 26 .000)

(*) D'apr~s Van Holde et Hill [11] ; W i t t m a n n [12] ; Monier DI~] et Fel- lner [14].

de ce lu i -c i "~ f o r m e r u n c o m p l e x e s t a b l e a v e c u n e p r o t 6 i n e .

L ' o r d r e d ' a d d i t i o n des pro t@ines au R N A 16S a 6t6. @tudi~ h l ' a i d e de pro t@ines p u r i f i 6 e s [19, 20]. L ' a d j o n c t i o n des prof i6 ines n e se f i x a n t p a s d i r e c - t e m e n t au RNA r e q u i e r t s o u v e n t la p r 6 s e n c e d ' a u - t r e s p r o t 6 i n e s , e n p l u s d ' u n e p a r t i e ou de rou te s ce l l es se f i x a n t d i r e c t e m e n t . L a c a r t e d ' a s s e m b l a g e qu i a p u 6 t re a i n s i d r e s s 6 e (.figure 1) r6vb le le c a r a c t 6 r e h a u t e m e n t c o o p ~ r a t i f d u p r o c e s s u s , l l f au t r a p p e l e r que les i n t e r a c t i o n s qu i s o n t r e p r 6 - s en t6e s s u r la c a r t e ne s o n t p a s n ~ c e s s a i r e m e n t d i r e c t e s ; e l les n e r e f l 6 t e n t d o n c p a s a priori la p r o x i n l i t 6 des c o m p o s a n t s d a n s le r i b o s o m e t e r - m i n 6 . P a r a i l l eu r s , d ' a u t r e s i n t e r a c t i o n s , n o n r6v6- 16es p a r les e x p 6 r i e n c e s de r e c o n s t i t u t i o n , o n t t rbs p r o b a b l e m e n t l i eu d a n s le r i b o s o m e c o m p l e t ( i n t e r a c t i o n s p r o ~ 6 i n e ~ p r o t 6 i u e , aus s i b i e n q u e p ro t~ ine~RNA) .

I1 est p r o b a b l e que la s 6 q u e n c e d ' a s s e m b l a g e in vitro c o r r e s p o n d e assez b i e n ~ la s i t u a t i o n in vivo. Les p r o t 6 i n e s ¢ p r 6 c o c e s >> se r e t r o u v e n t e n effe t d a n s les p r 6 c u r s e u r s n a t u r e l s que l ' o n p e u t i s o l e r ( v o i r t a b l e a u I I) . On t r o u v e u n e d i s c u s s i o n d6 ta i l - 16e de ce p o i n t d a n s l ' a r t i c l e ,de N o m u r a et H e l d [22].

La r e c o n s t i t u t i o n ,de s o u s - u n i t ~ s 50S a c t i v e s p o s e de s 6 r i e u x p r o b l b m e s , dus ~t la p l u s g r a n d e corn-

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 2.

I 16S RNA ]

-4 . . . . I - ,

s!,J I

- :

.... A ./.....i/o

sm ?

Fro. 1. - - Carte d'assemblage des p¢otdines riboso- relates 3,0S de E. coli [20].

Les flbches issues du RNA 16S po in ten t vers les pro- t~ines capables de fo rmer un complexe stable et sp6- cifique avec l 'acide nucl~ique. Les flbches ent re pro- t~ines ind iquen t la s t imula t ion apport~e pa r une pro- t~ine sur la f ixat ion d 'un autre.

La nomenc la tu re des prot6ines r ibosomiales est bas le sur la s~parat ion des prot~ines pa r ~lectrophorbse sur gel de po lyacry lamide ~ deux d imens ions [21]. Les prot~ines du 30S sont d~sign~es par la let t re S (S1 $21), celles du 50S pa r la le t t re L (L1 & L34).

Appor t s de la gdn~tique ~ la connaissance du r ibosome bactdrien. 127

plexit6 de l '6dif ice. Elle est poss ib le pour le 50S de Bacillus stearothermophilus [?3] ; ce syst6me nbcessite une incuba t ion pro long6e h 60°C, qui ne r6ussit pas au systbme de E. coi l La recons t i tu - t ion totale du 50S de E. coli a bien 6t6 rappor t6e [24, 25], mais ces exemples n 'ont pas 6t6 mul t i - pli6s.

~1~LATIO N STRUCTURE-FONCTION.

L'assemblage de t ro is mol6cules de RNA et de 54 pro t6 ines diff6rentes fai t du r ibosome un exem- ple un ique en son genre. Le nombre et la d iver- sit6 de ses fon,ctions sont du m6me o r d r e de com- plexi t6 : f ixat ion sp~cif ique et pr6,cise de mol6- cules de RNA (m-RNA, t -R~A), de prot6ines (fac- teurs) , de nucl6ot ides (GTP), act ivi t6s pu remen t enzymat iques (pept idy l t ransf~rase) . En outre, le r ibosome est impl iqu6 dans des m6canismes dis- t incts de la synthbse pro t6 ique p r o p r e m e n t dite, telle la synth6se de guanos ine t6tra- et pen taphos - pha te [26].

La carac t6r i s t ique p r i n c i p a l e - d e s in te rac t ions entre les composants du r ibosome r6s ide clans leur coop6rat ivi t6 , t l est bon de ga rde r ce po in t /~ l ' espr i t , lorsque l 'on tente d 'ass igner , pa r quelque m6thode que ce soit, une fonct ion h l 'un ou l ' au t re de ces composants . En effet, lorsque l 'on observe la d i spa r i t i on d 'une fonct ion, suite ~ l ' a l t6ra t ion d 'un composan t (par muta t ion , p a r omiss ion da.ns un syst6me de recons t i tu t ion , pa r modi f i ca t ion chimique) , on ne peut g6.u6ralement pas d is t in- guer entre deux poss ibi l i t6s :

1) on a r6el lement touch6 le site impl iqu6 dans la fonc t ion consid6r6e ;

2) le composan t alt6r6 ne p a r t i c i p e h la fonc- t ion consid6r6e qu 'en ma in tenan t le ¢ site act i f >> dans une confo rmat ion ad6quate.

Citons ici les p r i nc ipa l e s approches exp6r imen- tales uti l is6es pour d6f inir les composan t s associ6s aux diff6rentes fonct ions :

1) Recons t i tu t ion avec omiss ion d 'un ou de plu- s ieurs composants . Cette app roche pe rme t de dis- t inguer les pro t6 ines requises essent ie l lement pour l 'assemblage, ou pou r telle ou tel le autre fonct ion [27]. La r6appa r i t i on d 'une fonc t ion apr6s add i -

t ion de prot6ines h des par t i cu les r ibosomia les in- compl6tes pe rme t 6galement d ' a s soc i e r cette fonc- t ion aux pro t6 ines en quest ion [28, 29].

2) Inh ib i t ion d 'ac t iv i t6 pa r f ixat ion d ' an t i co rps sp6cif iques pour chaque pro t6 ine [30]. Cette m6- thode, comme la pr6c6dente , ne pe rme t pas de dis- t inguer un effet d i rec t d 'un effet ind i rec t .

3) Le marquage d ' a f f i n i t 6 : pontage covalent d 'un l igand h une ou p lus ieurs pro t6 ines de son site de fixation.

4) G6n6tique : assoc ia t ion entre la mod i f i ca t ion d 'un composan t p a r muta t ion et l ' a l t6 ra t ion d 'une fonct ion.

STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE.

De nombreuses app roches ont 6.t6 uti l is6es pour d6 te rmine r l ' o rgan i sa t ion spa t ia le des pro t6 ines au sein du r ibosome :

1) Pontage ch tmique entre pro t6 ines vois ines h l ' a ide de r6act ifs b i fonct i0nnels . Cette app roche est tr6s f iable , b ien qu ' i l soit poss ib le d 'y vo i r des l imi ta t ions [31]. Diff6rents r6act ifs ont 6t6 uti l is6s et on d ispose a,ctue.llement d 'un g rand nombre de donn6es (voir t ab leau II).

2) Le marquage d 'aff ini t6 donne 6galement des in fo rmat ions sur la t opograph ie du r ibosome. Cette t echn ique ut i l ise soit un r6ac t i f b i fonc t ion- nel, soit un d6riv6, r6ac t i f du l igand. Dans le pre- mier cas, on ne peut d i s t inguer en t re un couplage d i rec t ( l igand-prot6inei) ou i nd i r ec t ( l igand-pro- t6inej-prot6inei) , ce qui d iminue le po ids de tel les in format ions , pour ce qui est de leur in te rpr6 ta - t ion en termes de topograph ie .

3 °) La d6 te rmina t ion du site de f ixat ion de cer- ta ines pro t6 ines sur le R,NA pe rme t de d6dui re la p rox imi t6 de deux prot6ines , si leurs sites de fixa- t ion sont proches .

4) Malgr6 les r emarques fai tes plus haut , la car te d ' assemblage du 30S est souvent ut i l is6e comme r6f6rence.

5) Toute m6.thode pe rme t t an t de d6 te rmine r l ' imp l i ca t i on de p lus ieurs pro t6 ines dans une fonc- t ion donn6e, pe rme t de d6dui re la p rox imi t6 de ces prot6ines . De tel les d6duct ions sont pa r t i cu - l i6rement sujettes aux objec t ions ment ionn6es au p a r a g r a p h e pr6c6dent et donc h cons id6re r avec c i r conspec t ion .

6) La mic roscop i e 61ectronique est ut i l is6e comme voie d ' a p p r o c h e de la t opograph ie du r ibo- some ; ce moyen d '6tude dev ien t fort int6ressant , lo rsqu ' i l est coupl6, h l 'u t i l i sa t ion d ' an t i co rps sp6- cif iques [32, 33]. L 'observa t ion des sites de fixa- t ion des an t i corps mbne h l '6d i f ica t ion de modbles d6jh tr6s 61abor6s [34, ~ ] .

7) Le t ransfer t d '6nergie entre sondes fluores- centes fix6es sur diff6rentes pro t6 ines p e r m e t d 'es- t imer les d is tances entre prot6ines . Cette techni - que pe rme t 6galement d '6 tudier le d6roulement de l ' a ssemblage in vitro. Le p r i n c i p e de cette techni - que r emarquab le est d6cr i t clans l ' a r t i c l e de Can- tor et co l l abora teur s [36], les p r emie r s r6sultats dans Huang et co l l abora teur s [37].

8) La d i f f rac t ion des neut rons (p r inc ipe : voi r Moore et co l l abora teur s [383) est une t echn ique toute indiqu6e pour le r ibosome et p rome t d ' int6-

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 2,

1 2 8 M. de W i l d e and coll.

TABLEAU II.

Fonctions des composanls du ribosome 30S.

Prot~ine

[4o]

$1

$2

$3

$4

$6

$7

$8

$9

S10

S l l

S12

$5 L L

15,6

22,7 K 19,6 B -~-

15,5 -~

16,2

12,4

1 5 , 5 _ _

17,2

Assemblage

Pr6senee dans 21S [22]

in vitro in vivo t / 2 sad/W.T.

- +

- - ±

+ +

- - t

+ + +-FI - - +

+ + - - I + -

+ + + +

+ + --

- = , o - t $14 I L I

BIOCI-1IMIE, 1977, 59, n ° 2.

+ +

+ s21

-}- s 4

+

Topographie

Pontage chimique

avec :

[ 4 6 - 5 5 ] (b) (c~

$14, $21

$ 3 0 , $5, S8

$ 2 0 , S10

$5 ,$6 ,$8 $9,S12,S13

$2 ,$4 $ 8 0 , $90

S4, (S7), ( s 9 ) , sis

($6), $8 , $90

$2, $ 5 0 , $4, $7

$ 5 0 , $70 (S6), $4

$3

$18, ($19),

$4, S190

$1, $19

Fonctions

Fixation de

Autres propri~t6s

du m-RNA [56,57,58] tire h la t raduct ion de 9] proche de l 'extr. 3'

[60, 6 | ] ini t iat ion, 3' a n f o l d i n g " [62, 63] :ue au facteur i [64] IF-2 et IF-3 (1)

EF-T-GTPase (m)

du m-RNA (i)

! de l a t r a d u c t i o n IV) du tr iplet AUG (n)

~IA 16S [65,66,67,68]

~F-G-GTPase (m) EF-T-GTPase) (m)

de l a t r a d u c t i o n (tabl. IV)

sensibilit~ h la spectinomycine difference entre K et B [t0, 69]

XL h IF-3 [60] difference entre K et B ( tabl . IV) pas de diff. fonctionnelle [70] XL au RNA 16S [65, 66, 67, 68]

activit~ EF-G-GTPase (m) activit~ EF-T-GTPase (m)

XL h IF-2 et IF-3 (1) fid~lit6 de la t raduct ion (e)

XL /~ IF-2 et IF-3 (I) sp6ciflcit~ de l ' ini t ia t ion a m b i g u i t ~ de la t raduct ion

(e et tabl . IV) sensibilit~ ~ la s t rcptomycine

(tabl. IV)

XL h IF-2 et IF-3 (1)

Apports de la g~ndlique d Ia connaissance du ribosome bactdrien. 129

TAI~LEAU II (suite).

Protdne

L~o]

S15

P . M .

X t 0 -3

12,5

C 0 m ~

plexe avec RNA ~6S 116]

+

Assemblage

Presence dans 2iS [22]

inv i t ro ! inv ivo t / 2 sad/W.T. [42,43] I [~t, 45]

+ + + + ! + + +

Topographie

Pontage chimique

cores avec

÷

$16

S17

11 ,7

10,9

?+?, +

I 1

+ + + ++i +

I . . . . . I - -

J

+ ÷ I 1

Foncti0ns

Fixation de

Imet pb6 t-RNA t-RNA I strep.

I I

Autres propri6t6s

. . . . . i.

requise un iquement pour l 'as- s e m b l a g e [71]

a m b i g u i t 6 de la t r aduc t ion (tabl. IV)

s e n s i b i l i t 6 /~ la n 6 a m i n e (tabl. IV)

ehaugemen t de conformat ion par f ixat ion de po lyU-aa t -

S18 12.2

S19 13,1

$20 12,0

$21 12,2

i i i

+ + + ± -

i i

. . . . . + - - + - -

+ ; + + + + + . . . . . . . . . . . . . . t

i - - - } - - - _ _

+

+

+

+

I

_ _ _ _ : m . - -

i

$6, Sll,$21~1 -[-(f)

( S I 1 ) , S 1 3 n I s14 ! + (d)

iV(e)

S1, S l l , SlSDI _~_+ (d)(e)

;

J + (d;

+ ( d ) (f)

÷ (g)

R N A - E F - T u - G T P [79.]

fixation m - R N A (polyU) [58] XL ~ IF-3 (1) f ixation du t r ip le t AUG (n)

XL h IF-2 et IF-3 (1)

changemen t de conformat ion , pa r f ixat ion de po lyU [72] (-~-)(d) f ixation de m R N A (polyU) [,581

!(÷) (f)XL ~ IF-3 O) non n~eessa ire ( a b s e n t e ?) h

! I l ' in i t ia t ion (o)

(a) Donn6e t e c h n i q u e ne r e l e v a n t pas de l ' a s s e m h l a g e p r o p r e m e n t d i t ; + : pr6sente , - - : a b s e n t e des <( cores )> CsC1 5 M [?3, 74].

(b) P o n t a g e cova len t pa r r6act i f b i f o n c t i o n n e l : rn : pon tage d6tect6 p a r au m o i n s deux r6act i f s diffd- r en t s ; ( ) : d 6 t e r m i n a t i o n non d6finit ive.

(e) Voir auss i : m e s u r e s de d i s t ance i n t e r p r o t 6 i n e s par : t r a n s f e r t d '6nergie en t r e sondes f luores- cen tes [37] ; d i f f r ac t ion de n e u t r o n s [393.

(d) I n h i b i t i o n pa r f ixa t ion de Fah sp6cifiques [75].

(e) R e c o n s t i t u t i o n avec o m i s s i o n d ' un seul e o m p o s a n t (n 'es t consid6r6 c o m m e s ignif ica t i f que lo r sque la r e c o n s t i t u t i o n m6ne h des pa r t i cu l e s 30S) [27].

(f) I n h i b i t i o n p a r r6ae t ion pr6a lah le des SH avee la N - 6 t h y l ma l 6 i mi d e [76].

(g) prot6g6 de la t r y p s i n e pa r f ixa t ion de Ph6- t -RNA [77].

(h) S t i m u l a t i o n p a r ad d i t i o n d ' u n exe6s de p ro t~ ines purif i6es dans n n sys t6me de r e c o n s t i t u t i o n [78].

(i) R6cup6ra t ion d 'ac t iv i t6 pa r ad d i t i o n de p ro t6 ine s h des pa r t i cu l e s inae t iv6es [79].

(j) P e r t e de la f ixa t ion apr6s d iges t ion m6nag6e h la t r y p s i n e [80].

(k) R6cup6ra t ion de l ' ac t iv i t6 p a r a d d i t i o n de p ro t6 ines purif i~es h des (< cores << LiC1 [29].

(1) XL pa r le m e r c a p t o s u b 6 r i m i d a t e : IF-2 [81] ; IF-3 [ H e i m a r k et Trau t , non publ i6] ; la m6 thode ne p e r m e t pas de d i s t i n g u e r les vo i s ins d i rec ts (XL IF-p r , ) des vo i s ins 61oign6s (XL I F - p r j - p r i ) .

(m) R6cup6ra t ion d 'ac t iv i t6 p a r a d d i t i o n de p ro t6 ines h des <( cores )> CsCI : EF-G [2~3, EF-T [82].

(n) Marquage d 'a f f in i t6 (ana logue de AUG) [83] ; ces r6su l t a t s d6penden t f o r t e m e n t des cond i t i ons exp6- r i m e n t a l e s ; se lon les cond i t i ons , S18 et $21, $4, S18 et $21, ou encore $4, S l l et S12 p e u v e n t ~tre m a r - qu6es [84].

(o) I n h i b i t i o n de la f ixa t ion de f m e t - t - R N A pa r ad d i t i o n de $21 h des 30S << na t i f s )> [8.5] ; s~ r i eusemen t contes t6 p a r des exp6r ienees de r e e o n s t i t u t i o n [86].

" X L : ab r6v i a t i on pour << cross l i nk ing >> : p o n t ag e ch imique .

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 2.

130 M. de Wi lde and coll.

ressants r6sultats (voir Engelman et col labora- teurs [39]).

Nous avons repr is dans le tableau II l 'essent iel des propridt6s des protdines du r ibosome 30S, d6- riv6es des approches exp6rimentales d6crites ci- dessus.

GENETIQUE DU I~IBOSOME.

La connaissance de l 'o rganisa t ion g6n6tique des composants r ibosomiaux est ndcessaire h la com- prdhension de leur biosynth6se. L'6tude de mu- tants altdrbs dans le r ibosome const i tue la source d ' impor tan tes in format ions quant h sa s t ruc ture et

sa fonction. Malgr6 l ' ampleur des efforts consen- tis, les rdsultats restaient modestes jusqu ' i l y a peu. Cependant, nous verrons qu'h cer tains points de vue tout au moins, un bond en avant a 6td fait durant ces derniers roots.

l ' augmenta t ion d 'hybr ida t ion sur le DNA de sou- ches m6rodiploides , soit h observer au mic roscope 61ectronique, l ' hybr ida t ion de r-RNA sur le DNA d 'un 6pisome. Enfin, l '6tude d 'un phage t ransduc- teur de la rdgion r i f ( rpoB , 88.5 mn sur la nou- velle carte gdn6tique (*)), a permis de local iser des gbnes de r-RNA pr6s de ce marqueur . Les con- clusions de ces diff6rentes 6tudes sont rdsum6es dans le tableau HI.

Il est acquis que les gbnes de r-RNA sont trans- cri ts en entit6s comprenan t dans l ' o r d r e : 16S, 23S et 5S (voir plus loin). Par consdquent, les ]oca- l isat ions ind6pendantes des g6nes de 5S et de 16S (et 23S) devra ient se recouper .

A l ' examen du tableau III, on peut fa i re les associat ions suivantes : c q s a (5S) co r respondra i t h r r n A ('16S + 23S), r r n B aux g6nes ddtectds sur le ~dri[ (79'/88.5'), et r r n C ~ c q s B (5S, 74'/83') . On

TABLEAU IlI.

L o c a l i s a t i o n des g~nes de R N A r i b o s o m i a l .

Gbne

5S : eqsA (K 12) . . . . . . . . . . . . . . cqsB (MRE 600) . . . . . . . . . . cqsC (MRE 600) . . . . . . . . . . cqsD (MRE 600) . . . . . . . . . . .

16S : (2 exemplaires) . . . . . . . . . . . (K 12)

16S -~- 23S : rrnA . . . . . . . . . . . . . rrnB . . . . . . . . . . . . . rrnC . . . . . . . . . . . . .

Loealisation (a) marqueurs minutes

mete - rha rbs - ilv ~roB - real ~rgR - aroE

(75,5/84-77,5/86) (74,3183-74,7/83,2) (65,3/73,5-65,8/74) ( 6 2 , 5 / 6 9 , 6 - 6 3 , 6 / 7 1 , 5 )

~r~s de met B (78/87)

ilv - melB ~rgC - glg T !rkD - ilv

(74 ,7 /83 ,2-78 /87~ (78,7/87,5-78,9]88,2) (74,6/83-74,7[83,2)

Mdthode

transduction/oligom~res spdcifiques

conj ugaison / oligom~res sp6eiflques

i hybridation sur ie D N A de l'6pisome KL 14 / microscopic dlectronique

Rdfdrences

[90]

[93]

[94]

16S -[- 23S : 50 p. cent . . . . . . . . . rdgion ilv (74/83) hybridation sur le DNA d'une souehe [95, 96] 30 p. cent . . . . . . . . rdgion metC (55 /61 -59 /66 ) mdrodiploide

16S -~- 23S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . rdgion aroE (60/66-66/74) idem [97]

16S -t- 23S ~- 5S (K 12) . . . . . . . . ril (rpoB) (79/88,5) ), transducteur [98, 99]

(a) Les positions en minutes se rdf~rent /~ l'anciennc [92] et h la nouvelle carte [~lr], respectivement.

LOCALISATION DES GI~NES DE RNA IIIBOSOMIAL.

D'apr6s les mei l leures donn6es disponibles, le g6nome de E. co l t cont ient 6 exempla i res de cha- que gbne de RNA r ibosomial [87, 88, 89]. Malgr6 cette redondance , on constate trbs peu d'hdt6ro- gdndit6 dans la s6quence des r-RN.A [13, 14]. L 'ex is tence de ces h6.t6rog6n6it6s mineures pro- voque l ' appar i t ion , dans le p rodu i t d 'une diges- t ion enzymatique, d 'o l igombres mineurs qui peu- vent 6tre spdcifiques d 'une souche donnde. J a r r y et Rosset [5,0] ont utilis6 ce fair pour local iser 4 g6nes de R'NA 5S. Une autre approche, bas6e sur l ' hybr ida t ion DNA-RNA, consiste soit h observer

atteint ainsi les 50 p. cent du r-DNA dans la r6gion i lv [95]. Les rdsultats s ' accorden t moths bien pour les envi rons de 60'/70' , off c q s C et c q s D (5S) pour- ra ient co r re spondre aux g6nes de 16S et 23S dd- tectds par Gorelic [97J. Mats ce dern ie r rdsultat est contestd par Unger et col laborateurs [96]. Notons aussi que c q s B , C et D sont des localisa- t ions dans 1K.RI?; 600; qui n 'on t pas n6cessai rement leur 6quivalent dans K12. L 'ensemble de ces rdsul- tats est repr is dans la carte gdn6rale figure 2).

(*) La carte gdndtique de E. colt a dtd recalibrde rdcemment [91]. Dans ce qui suit, les positions sur l'ancienne [92] et la nouvelle carte sont indiqudes sucessivement.

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 2.

Appor ts de la gdndtique ~ Ia connaissance du ribosome bactdrien. 131

==

, ~ 7 j 78,7/'8"8,7 I16SIRNA 23SSSEF-Tu (L1Ltl)LtOLT/L12 ,9 /'~' i . " ' " '19/8"c'

• , 91U2 ' - "" ~- )',r=f ~.'-'" . thr~SU~ alaSts $20

" ' - - - . - ' " . - - ' ' " ~- Lres: (ramB} " - . ' ; . . . . kksg A

" . . . : L ~ ; ~ -* 1/t.tl._ le u 165235 ~" $18 ~ = " cqs Ay, ! ° I ' - ' - ' ~ " ' ' ' - ~ ". "*~ . . ~ . 090/0100 "'~, c, ksg C |

63.5/71 S4S5 $17 S12 65/73 EFG $7

X fus* >'

hybrldeS

$3 $4 $5S7S8S9S10 $12 $15 S16SI7L1L3L4 Lt3L22L 25 (L6/L29) 50a50to50~450~5 ( '*)

* X fus : L17~S4S11(S13)p (L15L30)S5L18L6S8SHL5L24LHp (S*TU6L29)(S3S19)tL22L2L2-~)(L4S!0L3}p TuGS7S!2p

Fro. 2. - - Carte g~n~tique des eonstituants ribosomiaux. Les positions, en minutes, sur la carte reealibr6e [91] sont indiqu~es en italiques. (*) Nomenclature selon Osa'wa et al. [!154].

L O C A L I S A T I O N DES GENES

DE P R O T E I N E S 1AIBOSOMIALES.

Le tableau IV fait l ' inventa i re des mutat ions affectant, ou susceptibles d 'affecter des prot6ines r ibosomiales. L 'a l t6rat ion de 16 prot6ines diff6- rentes a 6t6 mise en 6vidence, ce qui cousti tue un tableau assez maigre, si l 'on considbre qu ' i l faut s 'a t tendre h 53 g~nes diff6rents. Dans neuf c a s seulement ($4, $5, $7, $12, S17, $18, L l l , L 7/12), on peut associer l 'a l t6rat ion de ]a prot6ine h une mutat ion de son g~ne de structure. Le cri tbre d6finitif, h c e propos, consiste h d6terminer la subE st i tut ion d 'ac ide amin6 dans la prot6ine modifi6e,

BIOCHIM1E, 1977, 59, n ° 2.

Cependant , la d6tection de deux formes de la pro- t6ine (parente et mut6e) dans une souche diploide pour la r6gion du g~ne concern6 est une bonne indica t ion en la matibre. Dans le cas du r ibosome off plusieurs modi f ica t ions pos t - t ranscr ip t ionnel les ont d6jh 6t6 mises en 6vidence, il est par t icul ibre- ment impor tan t de faire la preuve d 'une a]t6ra- t ion du g~ne de structure. Ce genre de problbme pourra i t expl iquer le d6saccord sur la local isat ion du gbne de $2 (voir tableau IV).

D'autres m6thodes ont 06 utilis6es pour ]oca- l iser les gbnes de prot6ines r ibosomiales . Les diff6- rences de mobili t6 61ectrophor6tique (ou chrolna-

132 31. de Wi lde and coll.

TABLEAU IV.

M u t a l i o n s a[[ec tan t le r i b o s o m e .

G6ne

ksgC rpsB rpsC

rpsD ramA

rpsE spcA ramC

(rpsF) nek

rpsG K rpsH

rpsL strA

rpsQ neaA

rpsR

rpsT rplD eryA

rplE rplG

rplR ergB

rplX

sad

r imA

r ime

Protdine altdr6e

$2 (b) $2 (c) s3 (c) $4

$5

s6 (d)

$7 s8 (c)

s12

S17

S18

S2O (c) L4 (c) L5 (b) L7112

L18 (b) L22(c) L24

Localisation (a)

(12/14') (3,514') 64/72" 64172'

64172'

64/72'

64172' 64172'

64/72'

64172'

84194'

111' 64/72'

Phenotype (s)

r~sistance ~ la kasugamycine r~version de la cryosensibilit6 due ~ sad r~version de la cryosensibilit~ due A sad augmentat ion de l 'ambiguit~ de la t ra-

duction r~version de la d~pendance h la strepto-

mycine r~sistance ~ la spectinomycine (e) augmentat ion de l 'ambiguit~ de la t ra-

duction r~version de la d~pendance h la strepto-

mycinc r~sistance /l la n~amine (en combinaison

avec certaines muta t ions de S12) r6version de la thermosensibilit~ due ~ alas t" difference de s~qucnce entre souches B e t K cor~sistance h la n~omycine et ~ ia kana-

mycine difference de s~quence entre souches B e t K thermosensibil i t6 pour la croissance r6version de la thermosensibili t~ due h valS u r~sistance h la s t reptomycinc (e) d6pendance h la s treptomycine augmentat ion de la fid61it~ de la t raduc-

t ion (e) restriction r~sistance h la n~amine (en combinaison

avec certaines muta t ions de $5) restriction non accompagn~e de str ~ thermosensibil i t6 pour la croissance (ini-i

t iat ion) r~slstanee h la ndamine augmentat ion de la fid~lit~ de la t raduc-

t ion (e) restr ict ion al terat ion de la mobilit6 ~lectrophor~tique

(pas de ph~notype connu) r~version de la thermosensibil i t6 due fi alas ~' r~sistance h l '~rythromycine

? r~sistance 79 / 88' al terat ion

(pas de ? thermo et

fi [a th iopept ine de la mobilit6 6lectrophor~tique ph6notype connu) cryosensibilit6 pour la croissance

64172' 64172'

64172'

75/82'

env. 22125 '

r6sistance fi l '~rythromycine thermosensibili t~ pour la croissance, d6fi-

cience d 'assemblage du 50S h 42 ° C cryosensibll i t~; blocage de l 'assemblage

A basso temp6ra ture (dans le cas de spc ~. ayan t ce ph6notype, celui-ci provient probablement de la modification de $5)

cryosensibilit6; blocage de l 'assemblage du 50S h basse t empera ture

idem

R6f6rences

[ioo, 1ot] [1o2] [Io2]

[io3,1o4,1o5, io6,1o7]

[I08] [109, Iio]

[III, 112]

[1131

[114, I151 [69J

[116, I17]

[118, t19] [120]

[121, 122l [123] [1241

[125, 126]

[113]

[127] [128l

[129]

[130, 131, 132]

[133, I15] [134, 135]

[136] [137]

B38] [t34, t~51

[i39]

[140, t4t]

[142, t43]

BIOCHIMIE, 1977, 59, n" 2.

A p p o r t s de la gdndt ique & la conna i s sance du r i bosome bactdrien.

TAaL~AV IV (sui te)

133

G~ne

rirnB rimD mac

rimF res-1

mod

rplK relC ksgA

rim G ramB

Protdine altdrde

? ? ?

?

?

?

L l l

$4

Loealisation ta)

32137'

env. 75/87'

25129'

1IV

75187'

64/7T

79•88' 111'

Phdnotype (s) Rd[drences

idem tdem ddpendanee h l '~rythromyeine et d'autres

rnaerolides restrietion non aeeompagnde de str ~ (ou

nea a ) restriction non aeeompagnde de str R (ou

nea R )

suppression de la rdsistanee ~ la spectino- rnycine

partiellernent "relaxed" rdsistance A la kasugarnyeine ; sous-mdthy-

lation du RNA 16S (mutation affectant la "rndthylase ")

modification de $4 (phdnotype inconnu)

it/all

[t27]

[t451

I146]

[147, t48] [t4.91

~ / r [150]

(a) Conjointement h la nouvelle carte gdndtique de E. coli [90], Bachmann et eollaborateurs proposent une nomenclature des g~nes de protdines r ibosomiales S1 h $21 : rpsA h rpsU ; L1 h L26 : rplA h rplZ ; L27 h L34 : rpmA h rpmH. La nomenclature proposde par Birge et Kurland [106] (rpx, rpg, rpz), utilisde dans plusieurs publications, semble devoir ~tre abandonnde. Nous reprenons ici la nouvelle nomenclature, conjointement aux symboles originaux, qui rappel lent le ph6notype. La loealisation en minutes reprend suceessivement les valeurs de l 'aneienne [92] et de la nouvelle carte gdndtique [91].

(b) Pas de ddmonstration qu' i l s'agisse du g6ne de structure. (c) Idem, mais prdsenee de ce g~ne sur un X transducteur de cette rdgion. (d) Ce g6ne n'a cependant pas pu ~tre mis en dvidence sur le X-fus (qui porte les g6nes cornpris entre

aroE et strA) (Nomura, communicat ion personnelle). (e) L'assoeiation a l td ra t ion-phdnotype a dtd ddmontrde par reconstitution.

t o g r a p h i q u e ) ex i s t an t en t r e les p ro td ines r iboso- mia l e s de souches ou d ' e sp6ces vo i s ine s ont did raises h p r o f i t : des c r o i s e m e n t s ou t r a n s d u c t i o n s en t r e E. coli et Shigella dissenteriae ou Salmonella thyph imur ium ont pe rnf i s de l o c a l i s e r u n e qu in - za ine de g6nes dans la r6g ion aroE-strA (64 ' /72 ') . On t r o u v e une r e v u e de cet te a p p r o c h e dans S y p h e r d et Osawa [151] et les rdsul ta ts en son t r e p r i s dans la ca r t e gdn6rale (f igure 2). Ces obser - v a t i ons con f i r rnb ren t l ' idde, issue des p r e m i 6 r e s loca l i sa t ions , que b e a u c o u p , si pas t o u s l e s g~nes de p r o t d i n e s r i b o s o m i a l e s p o u r r a i e n t 6tre loca l i - sds dans la rdg ion aroE-strA.

Un d d v e l o p p e m e n t r6cent , et par t i . cu l i6rernent f r u c t u e u x , r e p o s e sur l ' i s o l e m e n t de phages t rans - d u c t e u r s des g6nes r i b o s o m i a u x . E n que lques l ignes , le p r i n c i p e est le s u i v a n t : le bac td r io - phage k est c apab l e de s ' i n t dg re r a i l l eu r s dans ]e c h r o m o s o m e qu'~t son s i te << 16gitime >> (et hau te - m e n t p r6 f6 ren t i e l ) . I1 est en ou t re su scep t ib l e de s ' e x c i s e r a n o r m a l e m e n t , en p e r d a n t une p a r t i e de son p r o p r e DNA et en << e m p o r t a n t >> un s e g m e n t de c h r o m o s o m e b a c t d r i e n vo i s in de son si te d ' a t t a - c h e m e n t . La c o m b i n a i s o n de ces d e u x p h d n o m 6 n e s p e r m e t , en thdor ie , l ' o b t e n t i o n d ' u n phage t rans - d u c t e u r de n ' i m p o r t e que l s e g m e n t du c h r o m o - some b a c t d r i e n [152, 153].

L ' 6 t u d e de d i f fdren ts phages t r a n s d u c t e u r s de la rdg ion aroE-strA, p o r t a n t des quan t i tds c r o i s s a n t e s de DNA b a c t d r i e n (aroE-trkA, aroE-spcA, aroE-[us, v o i r f igure 2), r6v61e :

1) i l n ' y a a p p a r e m m e n t pas de g6ne de p r o t d i n e r i b o s o m i a l e en t r e aroE et trkA.

2) i l y a une t r e n t a i n e de g6nes de p r o t d i n e s r i b o s o m i a l e s en t r e les m a r q u e u r s trkA et strA (rpsL)

3) ce t te rdg ion con t i en t , en ou t re , les ghnes des f ac teu r s d ' d longa t i on EF-G(fus) et E F - T u (tut'A), a ins i que le g6ne de la sous-uni td a de la RNA p o l y m d r a s e (rpoA) [155, 156, 157].

L a p r d s e n c e de la g r a n d e m a j o r i t d de ces g6nes a dtd raise en d v i d e n c e tan t in vivo qu'in oitro ( ') (M. N o m u r a , c o m m u n i c a t i o n pe r sonne l l e ) . Ils sont r e p r i s dans la f igure 2.

Un p h a g e t r a n s d u c t e u r du m a r q u e u r rif (79 ' / 88.5') c o n n u p o u r p o r t e r les g~nes des sous-uni tds

et 6' de la RNA p o l y m d r a s e [158] s 'es t r6v61d

(*) In oivo : st imulat ion de la synth6se de protdines r ibosomiales apr6s infection de baetdries dont la syn- th6se propre a dtd minimlsde par i r radiat ion prdala- ble ; in vitro : analyse des produits synth~tisdes par un syst~me coupl6 transeription-traduction, h part ir de DNA purifiC

BIOCHIM1E, 1977, 59, n" 2.

134 M. de Wi lde and coll.

p o r t e u r de q u a t r e g~nes de p r o t 6 i n e s r i b o s o m i a l e s du 5OS (*) en p lus des gbnes de E F - T u et de RNA 16S et 23S [98, 137, K i r s c h b a u m ( c o m m u n i c a t i o n p e r s o n n e l l e ) ] . Un p o i n t r e m a r q u a b l e est l ' ex i s - t e n c e de deux g6nes de E F - T u (tufa et tu[B) [160].

En r(sum~ : une d o u z a i n e de g~nes de p ro t6 ines r i b o s o m i a l e s on t 6t6 local i s6s ~ l ' a i d e de mu ta - t i ons ( tableau IV). L '6 tude de ~ t r a n s d u c t e u r s con-

est i nexp lo r6e . I1 y a q u e l q u e s a r g u m e n t s p o u r p e n s e r que le g~ne de S18 (qui o c c u p e une pos i - t i on p a r t i c u l i ~ r e h la m i n u t e 84/9'4) fasse p a r t i e d ' u n op6ron off i'l o .ceuperai t une p o s i t i o n d is ta le El61[. Cet te r6g ion est d o n e une c a n d i d a t e de eho ix . La r6g ion thr-leu (1 ' /0.5 ') de m S m e ne m a n - que pas d ' a t t r a i t : 1) on y t r o u v e d e u x g6nes de ¢ m o d i f i c a t e u r s >>, l ' u n du RNA 16S (:ksgA), l ' au - t re de la p r o t 6 i n e $4 (ramB).

TABLEAU ¥.

Localisation des g~nes de prot~ines ribosomiales.

Position M6thode IS1 2 3 ~ 5 6 7 8 9 10 11 t2 t3 lt~ 15 t6 t7 t8 19 2012t

I mutation 64/72' ), transd.

hybrides

mutation 1 [1' k transd.

hybrides

I mutation 3/3 ,5' k transd.

hybrides

84•94' mutation

58[64' hybrides

non rep6r6s

+ + + + + + + + +

(+)

+ + +

(+)+ + + + + + + +

+ + + + +

+

+ J + +

+ +

+ + +

I ÷ + ~+)

L12 3 ~ 5 6 7/t20 9 1C 17 t8 192021 2223 2~ 25 O O 27 28 29 30 3t 32 33 34

64/72' mutation k transd. hybrides

mutation 79188,5' k transd.

+ + + + +

+ + +

+

+

+ + -~

It t3 t4 t5 t6

+ + + +

+ +

+ + + + + + ÷ + + +

+ +

58 / 64' hybrides +

non rep6r6s + + + + + + + + +

O L8 est un complexe form6 des prot6ines L7/12 et L10 [200]. OO Les prot6ines $20 et L26 sont vraisemblablement identiques [121.

f i r m e la p l u p a r t de ces l oca l i s a t i ons et a jou te une v i n g t a i n e de g~nes h la ]iste. En out re , que lques g~nes suppl ,~ulentai res on t 6t6 d~tect~s p a r c ro i s e - m e n t i n t e rg~n6r ique . Cette s i t ua t i on est r~sum6e dans le t ab l eau V. Si aucun des ~l~ments qu i y f iguren t n ' e s t e r ron~, 41 g~nes ont 6t6 rep6r6s .

Ceei 6tant, peu t -on sp~cu le r su r la l o c a l i s a t i o n des g~nes m a n q u a n t s ? Tou t d ' a b o r d , la r6g ion strA n 'a pas ~t6 6puis6e, la p a r t i e d ro i t e de ce l le -c i

(*) Dont un (L1) a 6t6 mis en 6videnee h 64'/72' par croisement interg~n~rique [11'59].

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2) un et peu t -S t re deux g~nes de p r o t 6 i n e s r ibo - s o m i a l e s : sup alaS*8:$20 et res-1). E, nfin, les au t res r6g ions off son t local i s~es des m u t a t i o n s af fec tant , ou suseep t ib l e s d ' a f f ec t e r le r i b o s o m e sont des c a n d i d a t e s poss ib les .

REGULATION DE L'EXPRE'SISION

DES G]~NES RIBOSOMIAUX.

P e n d a n t la e r o i s s a n c e e x p o n e n t i e l l e , les v i tesses de syntb~se des e o m p o s a n t s r i b o s o m i a u x sont

Appor t s de la gdndlique ~ la connaissance du r ibosome bactdrien. 135

6quilibr6es (*), de sorte que ni r-RNA libre, ni prot6ines r ibosomiales l ibres ne s 'accumulent . D'autre part, la quanti t6 de r ibosomes pr6sents dans la cellule est propor t iounel le h la vitesse de croissance [162, 163, 164, 165.] La cot ransduct ion des RNA 16, 23 et 5,S ent ra ine la p roduc t ion co- ordonn6e des trois esp6ces de r-RNA (voir plus bas). Par contre, il n 'est pas 6tabli comment 1) la p roduc t ion de r-prot6ines est coordonn6e ; 2) les synth6ses de r-RNA et de r-prot6ines sont coor- donn6es ; 3) la p roduct ion iotale de r ibosomes est r6gul6e. I1 est clair cependant que les g6nes, tant du r-RNA que des r-prot6ines, sont soumis au con- trSle << s t r ingent >> [166, 167].

RNA ribosomial.

La cot ransduct ion des gbnes de 16, 23 et 5S, d6jh sugg6r6e par des exp6riences de cin6tique de marquage [168, 169] est ma in t enan t d6finitive- ment prouv6e ; en effet, un grand pr6curseur , con- tenant les s6quences des trois esp~ces de r-RNA, a 6t6 caract6ris6 [170, 171].

Prot~ines ribosomiales.

La localisat ion de nombreux gbnes de r-prot6i- nes darts la r6gion aroE-strA du chromosome con- duisi t h l 'hypoth6se d 'un grand op6ron contenant l 'ensemble de ces g6nes. Ceci rendra i t eompte, 6vi- demment, d 'une synth6se coordonn6e. Des exp6- r iences bas6es sur l ' inser t ion du bact6riophage Mu-1, appuy6rent fortement cette hypothbse [172~. Cependant, ces r6sultats ont 6t6 infirm6s par des exp6riences, u t i l i sant le m6me pr inc ipe [173], ainsi que par l '6tude de phages t ransdueteurs [1563.

Diff6rentes m6thodes furent utilis6es pour esti- met la taHle des 6ventuelles unit6s de t ranscr ip- tion. La lev6e de l ' i nh ib i t ion de la t ranscr ip t ion par la r i fampycine ou le passage de mil ieu pauvre

mil ieu r iche fournissent des condi t ions permet- tant de suivre l ' i nduc t ion de la synth6se de pro- t6ines r ibosomiales [174, 175, 176, 177]. Une autre approche examine la synthbse r6siduelle de r-pro- tbines aprbs i r rad ia t ion U.Y. [161]. S'il est diffi- cile de comparer en d6tail les r6sultats de ces dif- fbrentes 6tudes, il est clair qu' i ls m6nent tous fi la m6me conclusion : les gbnes de r-prot6ines ne sout pas organis6s en une grande unit6 de trans- cr ipt ion, mats plut6t en plusieurs petites.

(*) Lorsque la croissance exponentielle se poursuit depuis de nombreuses g6n6rations, l'ensemble des pro- cessus cellulaires (r6plieation. transcription, tradnc- tion, division, etc.) se d6roule de faqon parfaitement r~guli6re et coordonn~e : on parle de << eroissance ba- tanc~e >> [162].

La localisat ion de g6nes de r-prot6ines h diff6- rents endroi ts du chromosome (voir plus haut) confirme cette id6e. D'616gantes exp6riences, ba- s6es sur la s61ection d ' inser t ions h effet polaire dans les ), t ransduc teurs de la r6gion spcA-strA, sugg6rent l 'existence d 'au moins quatre unit~s de t ransc r ip t ion dans cette r6gion [156, 160] (voir fig. 2,). L 'hypoth6se du grand opSron est donc d6,fi- n i t ivement abandonn6e.

I1 est remarquable que des g6nes codant pour des composants essentiels de systbmes diff6rents soient group6s : h la minu te 64/72, des r-prot6ines, la sous-unit6 a de la RNA polym6rase, les facteurs d'61ongation EF-G et EF-Tu ; h la minute 79/88.5, les sous-unit6s ~ et 8' de la RNA polym6rase, le facteur EF-Tu, des r-prot6ines et des r-RNA ; h la minute 3/3.5, d 'une r-prot6ine ($2), la DNA poly- m6rase III (polC), le facteur EF-Ts (Nomura, com- munica t ion personnelle) . De plus, les prot6ines $7, S12, EF-Tu et EF-G semblent appar ten i r h la m6me uni t6 de t r ansc r ip t ion [160]. H est probable que ces regroupements ont un sens, au point de vue de la r6gulat ion de l 'expression de ces g6nes essen- r ids.

La r6gulat ion de la p roduc t ion de r-prot6ines se fait essentiel lement au niveau de la t r ansc r ip t ion [178, 179]. I1 reste h savoir quels sont les 616ments qui assurent la t ranscr ip t ion coordonn6e des dif- fbrentes unit6s de t r ansc r ip t ion (de r-prot6ines et de r-RNA) et qui la modulent de faqon h la rendre propor t ionnel le h la vitesse de croissance.

F IDELITE DE LA TRM)UCTION.

Ira relat ion entre codon et acide amin6, d6finie par le code g6n6tique, n 'est pas toujours respect6e. La muta t ion d 'un t-RNA peut provoquer l ' intro- duct ion d 'un acide amin6 lh off la croissance de la chaine polypept id ique s 'arr~te (suppression de nonsense) ou l ' i n t roduc t ion d 'un acide amin6 ne cor respondant pas au codon (suppression de rots- sense). La fuite (leakiness) d 'une muta t ion non- sense, par contre, fait i n t e rven i r un ou des t-RNA normaux. ,Get exemple soul6ve la possibili t6 que la lecture d 'un codon ne soit pas u n processus d 'une r igueur absolue, mats que certaines al ternatives existent naturellement. C'est h ce type de ph6no- mbne que nous nous at tacherons dans cette sec- tion, en le qualifiant, un peu a rb i t ra i rement d'erreur de lecture.

La premibre raise en 6vidence d'<< erreurs de lecture >>, provient de l '6tude d 'une muta t ion non- sense, dont la fuite est annul6e par la pr6sence d 'une muta t ion slrA, ~ moins que l 'on ajoute de la

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136 M. de W i l d e and coll.

s t rep tomycine dans le mi l ieu de culture (*) [180, 181].

Sur base de ce seul exemple, Gorini [182] pro- posa qu 'un taux d 'er reurs faible existe naturel le- ment dans le processus de d6codage et que ce taux est amplifi6 par la s t reptomycine et contr616 par le r ibosome (les muta t ions strA, qui res t re ignent la suppress ion ph6notypique, affectent ]e ribosome).

Si la s t reptomycine provoque la suppress ion ph6notypique en indu i san t des erreurs de lecture du messager (¢ mis read ing >>), on s 'a t tend ~ pou- voir reprodui re ce ph6nom6ne in vitro. Davies et coIlaborateurs 6tudi6rent l ' i ncorpora t ion de la p lupar t des acides amin6s dans des syst6mes in vitro dirig6s par diff6rents messagers synth6tiques et conc luren t que la s t reptomycine indu i t l ' incor- pora t ion erron6e de quelques acides amines seu- lement, pour un messager donn6 ; par ailleurs, cette incorpora t ion semble ob6ir /~ des rbgles pr6- cises ; enfin, la lecture d 'un t r iple t donn6 peut 6tre influenc6e par les bases voisines. L 'ensemble des 6tudes ayant men6 / t ces conclus ions sont pass6es en revue dans Davies [183]. Ces erreurs se produi- sent 6galement en absence de s t reptomycine, b ien qu'/~ des taux beaucoup moths 6.1ev6s [182, 103]. L ' i nduc t ion d 'er reurs de lecture par la strepto- myc ine (et d 'autres aminoglycosides) a 6galement 6t6 d6montr6e, in vitro, en ut i l i sant des messagers naturels [184, 185].

Dans certains mutants , l 'effet bact6r icide de la s t reptomycine est retard6. On peut y 6tudier l ' in- duct ion d 'er reurs de lecture en absence d ' inh ib i - t ion directe de la synth6se prot6ique. On constate l ' accumula t ion de prot6ines (par immunopr6c ip i - ration) n ' ayan t pas d 'act ivi t6 enzymatique. Ceci pour ra i t repr6senter un accroissement consid6- rable de l ' i ncorpora t ion d 'acides amin6s incor- reefs dans ces prot6ines [lg6].

Str igini et Br ickman [187] ont 6tudi6 le ph6no- m6ne in vivo, en examinant la suppress ion des trois codons nonsense par chaque type de t-RNA suppresseur. Ils p r i r en t la pr6caut ion d'6viter tout effet secondaire en choisissant des muta t ions affec- taut le m6me site. On observe que le mis read ing pr6sent na ture l lement est for tement accru par la s t reptomycine, mats que celle-ci n ' i n t rodu i t pas de nouveau type de suppression. Les erreurs obser- v~es in vivo ob6issent en part ie aux <~ r~gles >> d6- termin6es in vitro (et non en tout, comme 6crit par Gorini [188]).

(*) Ce ph6nom6ne est appel6 suppression ph6noty- pique par opposition ~ la suppression information- nelle. La premi6re d6pend de l 'environnement, la se- conde est la cons6quenee de la mutation d'un compo- sant de l'appareil de traduction (le plus souvent un t-RNA).

Les muta t ions strA affectent le gbne de s t ructure de la prot6ine S.12 (voir tableau IV). E,11es conf , - ren t la r6sistance h la s t reptomycine et, de plus, res t re ignent les erreurs de lecture in vitro [189] et la suppress ion ph6notypique observ6e in vitro [181]. D'apr6s leur effet sur la suppress ion ph6no- typique, les muta t ions strA ont 6t6. class6es en quatre cat6gories, cor respondant h quatre alleles du m6me g6ne : d a n s i 'o rdre de res t r ic t ion crois- s a n t e : A60, A40, A2 et A!I ~263. Ces quatre cat6go- ries cor respondent en fair h des subst i tut ions d 'acides amin6s b ien pr6cises dans la prot6ine $12 [901.

In vivo, les muta t ions strA ne res t re ignent pas un iquemen t la suppress ion ph6notypique (impli- quant un ou des t-RNA normaux) , mats aussi la suppress ion par les t-RNA suppresseurs de non- sense [191, 192] et de missense [193, 194]. ,La strep- tomycine antagonise 6galement ces effets. La m6me rela t ion quanti tat ive, entre les diff6rents ni- veaux de restr ict ion, existe pour les deux types de suppression.

On interprbte cet ensemble de ph6nom~nes en disant que le r ibosome interf6re (par la vote de la prot6ine S12) avec la reconna issance d 'au moins une par t ie des t-RNA.

Si le r ibosome joue un r61e actif dans la recon- naissance des t-RNA, on devrait pouvoir isoler des mutat ions qui in terfbrent avec ce processus de fa~on oppos6e h celle des muta t ions strA. Ce rai- sonnement mena Rosset et Gorini [103] h l ' isole- ment des muta t ions ramA (ribosomal ambiguity) . Elles affectent le ribosome, et plus part icul i~re- ment la prot6.ine $4. Les effets de la muta t ion ramA et de la s t reptomycine sont semblables et additifs : augmenta t ion du taux d 'er reurs in vitro, antagonisme de la res t r ic t ion impos6e par les mu- tat ions strA.

Plus r6cemment, Piepersberg et col laborateurs [109] et Cabez6n et col laborateurs [110] ont d6- montr6 que certaines muta t ions du gbne codant pour la prot6ine $5 en t ra inen t un accroissement de l 'ambigui t6 de la t raduct ion . Les effets de ces muta t ions de rpsE sont antagonistes de ceux pro- voqu6s par les muta t ions strA (r6sistance et d6pen- dance).

L'6tude de souches por tan t les muta t ions strA, ramA ou les deux, mont re qu ' i l y a u n e correspon- dance complbte entre la restr ict ion, et la st imula- t ion du mis read ing in vitro d 'une part , de la fuite de nmta t ions nonsense in vivo d'autre par t [103]. Cette corr61ation a 6t6 reprodui te dans l '6tude du mis read ing in vivo par cer tains t-RNA suppres- seurs [187].

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Apports de la gdndtique h la connaissance du ribosome bact~rien. 137

La s61ection de mutants r6sistants ~ la strepto- mycine conduit , si elle est faite /~ haute concen- t ra t ion (0,5 mg/ml) "~ de nombreux mutants d@en- dants. Tous ces mutants, dont il existe plusieurs classes, sont des all61es de strA [195]. Gorini [196] proposa que de tels mutants cor respondent h l 'ex- tr6mit6 de l '6chelle de res t r ic t ion croissante des muta t ions affectant S'12. Dans ce cas, la res t r ic t ion serait telle que certains t-RNA <~ 16gitimes >> ne pour ra ien t plus life le codon qui leur correspond. Cette s i tuat ion ne pour ra i t 6tre r6vers6e que par un induc teur d 'er reurs : la s t reptomycine. Cette hypoth~se est appuy6e par les constatat ions sui- van t e s : 1) d 'autres agents induc teurs d 'er reurs (paromycine, 6thanol) peuvent remplacer la strep- tomycine ; 2) l ' i n t roduc t ion d 'une mutat ion ramA suppr ime la d6pendance [104].

Les mutants de type neaA [105, 129] restrei- gnent 6galement l 'expression de suppresseurs in- format ionnels in vivo ; les r ibosomes de souches r6sistantes ~ la n6amine (mutants de type A) font peu d 'er reurs de lecture in vitro par rappor t ceux de la sou che parente ; de plus, ils mont ren t peu d'affinit6 pour un ant ibiot ique voisin, !a strep- tomycine. Les muta t ions de type neaA se compor- tent donc qual i ta t ivement comme les mutants r~- sistants ~ la s t reptomycine.

Tout comme dans le cas des muta t ions strA et ramA, on peut mettre en 6.vidence une in terac t ion entre les produi ts des g6nes neaA (rpsQ) et ramA (rpsD), les prot6ines $17 et $4 respect ivement (To- pis i rovic et al., Molec. Gen. Genet., sous presse). I1 est donc probable que les prot6ines S,12 et $17 (strA : rpsL) et (neaA : rpsQ) d 'une part, et $4 et $5 (ramA : rpsD) et (ramC : rpsE) d'autre part, soient iinpliqu6es, en sens contraire , dans le m6ca- nisme de contr61e de la fid61it6 de la t raduc t ion ; l 'a l t6rat ion des deux premibres prot6ines accroit la fid61it6 du syst6me, et celle des deux autres la diminue.

L 'ensemble des ph6nombnes d6crits ci-dessus in- clique qu 'une a, mbiguit6 appr6ciable existe dans le processus de d6.codage. Ces erreurs ne semblent pas cependant su rven i r au hasard. Un nombre limit6 de possibilit6s d 'ambiguit6 existe pour cha- que (ou pour certains) codon. Le <~ wobble >> de la posi t ion 3' d u codon [197] peut 6tre consid6r6 comme l 'une de ces possibilit6s (~ haute probabi- lit6, elle). Gependant, l 'ambiguit6 due au wobble est compens6e par la d6g6n6rescence du code, de telle sorte qu 'aucune violat ion de ce dern ie r n 'en r6sulte.

In vivo, seules des condi t ions part icul i6res per- mettent de d6tecter le mis read ing << nature l >>. I1

s'agit, notamment , de la fuite ou de la suppres- sibil i t6 des mutat ions nonsense. I1 n 'existe aucun argument direct pour dire qu'in oivo, des codons autres que nonsense soient lus incorrec tement , du moins en absence de facteurs ext6rieurs : strep- tomycine, mutat ion, etc.

Quant h la s t reptomycine ou la n~amine, it sem- ble qu'elles ne fassent qu 'amplif ier un ph6nom6ne pr6existant. Leur act ion est facile fi tester in vitro, off il n 'y a pas d ' in terf6rence par l'effet bact6r icide de la drogue. In vivo, par contre, il faut ut i l iser des concent ra t ions tr~s faibles, h moins que l 'on ne tire part i des muta t ions part icul i~res d6crites ci-dessus.

En,fin, il est clair que le r ibosome contr61e d 'une facon ou d 'une autre les possibilit6s d 'er reurs de lecture. Des in terpr6ta t ions g6n6rales de ce ph6- nom6ne ont 6t6 propos6es [188, 196, 198]. Cepen- dant, le m6canisme par lequel ce contr61e se fail reste inconnu .

CONCLUSION.

Au eours des ann6es 195,0, il 6tait bien 6tabli que des part icules sph6riques, d 'un diam6tre de 200 300 X, et compos~es de RNA et de prot6ines en propor t ions fi peu pr6s 6gales, const i tuaient le si6ge de la synth6se prot6ique chez la p lupar t des organismes prokaryotes et eukaryotes (r6f6rences: voir Tissi~res [199]).

.Depuis, d '6normes progr6s ont ~t6 r6alis6s ; on conna l t la localisat ion sur le chromosome bact6- r ien de la p lupar t des g~nes codant pour les cons- t i tuants r ibosomiaux. Les t ravaux de s6quence des RNA et des prot6ines se poursu ivent act ivement et il ne faudra plus longtemps pour disposer d 'un atlas complet des s6quences des 616ments riboso- miaux. Le mode d 'ac t ion des divers facteurs im- pliqu6s dans l '6tape de t raduct ion est connu par- fois jusque dans le d6tail. Cependant, divers pro- bl6mes, et non des moindres , restent '~ r6soudre ; ci tons entre autres la r6gulation et l 'expression des g6nes de prot6ines ribosomiales, la coordina- l ion 6ventuelle de l 'expression des g6nes de pro- t6ines r ibosomiales et de celles d 'autres ~16ments impliqu6s dans la synth~se prot6ique, comme les facteurs EF-Tu, EF-Ts, EF-G, ou encore le cou- plage possible entre l 'expression des gbnes de pro- t6ines r ibosomiales et de ceux codant pour la RNA polym6rase.

Beaucoup d'efforts devraient ~.tre consent is pour comprendre les bases mol~culaires des m6canis- rues par lesquels les diff~rents effecteurs de la synth6se prot6ique interagissent in t imement avec

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138 M . d e I ~ i l d e a n d c o l l .

les p r o t 6 i n e s ou les I%N,A r i b o s o n f i a u x ; enf in, les i n t e r a c t i o n s e n t r e a c ide s nuc l6 iques , tels que m - R N A et RNA 16S, ou i -RNA et BNA 5S, p o s e r o n t e n c o r e q u e l q u e t e m p s de s6 r i euse s 6n igmes .

R~suM~.

Cette revue a pour but de d6finir le r61e du ribo- some, et plus par t icul i6rement celui de la sons-unit6 30S, au cours de la t raduct ion du message g6n6tique, et de faire le point des eonnaissances dans ee domaine. Le lecteur int~ressd h une ~tude plus compI6te du ribosome bact~rien se r~fdrera h la publicat ion r~- cente R i b o s o m e s (1974) [1].

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