Analyse de l'acrylamide par UPLC-MS/MS
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DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC-MS/MS
LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 1/15
Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
Laboratoire de Liège
MET-LFSAL- 139
DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC-
MS/MS
Version 02
Date d’application 2013-12-02
Rédaction par : Marie-Christine Offermanne (Expert technique)
Vérification par : Marianne Aubry (Quality Manager)
Autorisation de publication par : Fabian Etienne-Thewissen (Chef de section)
Gestion et localisation de la
version valide :
LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\LAB 23 I-MET LFSAL -139.doc
Destinataires : Membres du personnel de la section Phyto-Résidus.
Mots clefs : Acrylamide – UPLC-MS/MS – chromatographie
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Aperçu des modifications
Révision
par/date*
Motif de la révision Partie du texte/portée de la révision
Offermanne
Marie-Christine
15/06/2013
Première version
Etienne-
Thewissen
Fabian
21/11/2013
Adaptation suite à l’audit
LFSAL 30-2013
Points : 2-5-8-10-11
* L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
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1 OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2 CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4
3 DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 5
4 DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 5
5 PRINCIPE ........................................................................................................................... 5
6 INDICATEURS DE PRESTATION ..................................................................................... 6
7 CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUE ............................................. 6
8 REACTIFS ET SOLUTIONS .............................................................................................. 6
8.1 RÉACTIFS ....................................................................................................................... 6 8.2 SOLUTIONS ..................................................................................................................... 7
9 EQUIPEMENTS ................................................................................................................. 8
10 METHODE .......................................................................................................................... 8
10.1 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS INCONNUS .............................................................. 8 10.2 PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON DOPÉ ....................................................................... 9 10.3 PRÉPARATION D’UN BLANC MÉTHODE .......................................................................... 9 10.4 PRÉPARATION D’UN ÉCHANTILLON DE CONTRÔLE ........................................................ 10 10.5 CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES ........................................................................ 10 10.6 SÉQUENCE D’INJECTION DES SOLUTIONS ................................................................... 11
11 CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ......................................................................................... 11
11.1 CONTRÔLES DE PREMIÈRE LIGNE ............................................................................... 11 11.2 CONTRÔLES DE DEUXIÈME ET TROISIÈME LIGNE ......................................................... 12
12 CALCUL ET RAPPORTAGE ........................................................................................... 12
13 RÉFÉRENCES AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS .................................................................................................... 12
13.1 PROCÉDURES ........................................................................................................... 12 13.2 FORMULAIRES .......................................................................................................... 13 13.3 LISTES ..................................................................................................................... 13
14 ANNEXES ........................................................................................................................ 14
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1 Objectif
La méthode décrit les procédures d'extraction, de purification et d'analyse de l'acrylamide
dans divers aliments : pain, frites, céréales et dérivés, café et épices et aliments pour bébés.
L'acrylamide est le nom usuel du 2-propénamide (amide acrylique) de formule brute
C3H5NO.
L’acrylamide peut se former notamment lors de la cuisson (friture, rôtissage..) à haute
température d’aliments riches en hydrate de carbone (amidon, sucres) et en protéines.
La formation de l'acrylamide semble fortement influencée par la température de cuisson, la
teneur en eau des aliments, ainsi que le « brunissage » (carbonisation) des produits.
Les aliments les plus concernés seraient d'abord les produits à base de céréales et de
pomme de terre (tels que les chips ou les frites), les pains et pâtisseries et généralement tous
les produits soumis à des températures élevées comme le café ou les amandes grillées. On
sait depuis quelques années que de l'acrylamide apparaît « spontanément » lors de la
cuisson de certains aliments à plus de 120 °C.
2 Champ d’application
La méthode permet de quantifier l’acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg
par UPLC-MS dans les matrices suivantes :
- Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés,…
- Matrices grasses : frites précuites, chips,…
La méthode permet de quantifier l’acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg
(transition ion/ion la plus intense) pour le pain et les aliments pour nourrissons et enfants en
bas âge, et supérieures à 50 µg/kg pour les produits à base de pommes de terre, les autres
produits à base de céréales, le café et les autres produits par UPLC-MS dans les matrices
suivantes :
Acrylamide
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- Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés,…
- Matrices grasses : frites précuites, chips,…
3 Documents légaux et normatifs
- Recommandation de la commission du 2 juin 2010 concernant la surveillance des
niveaux d'acrylamide dans les aliments (210 2010/307/UE)
- Recommandation de la commission des 10.1.2011 sur les niveaux d'acrylamide
dans les études alimentaires
4 Définitions et abréviations
S/N : Signal to Noise
MRM : Multiple Reaction Monitoring
UPLC : Ultra-high Performance Liquid Chromatography
MS : Mass Spectrometry
ES+ : electrospray positif
ml : millilitre
IP : ion précurseur
IQ : ion de quantification
IC : ion de confirmation
EC : énergie de collision
eV : électronvolt
SPE : solid phase extraction
SI : standard interne
Tpm : tours par minutes
ACN : acétonitrile
EtOH : éthanol
HAc : acide acétique
MeOH : méthanol
H2O : eau
5 Principe
Les échantillons sont préalablement homogénéisés. Suivent alors une extraction et une
purification, puis détection, identification et quantification à l’aide d’un UPLC-MS/MS en mode
MRM. La quantification est réalisée par étalonnage externe.
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6 Indicateurs de prestation (données de validation de la méthode)
Répétabilité-Reproductibilié intra-laboratoire : Matrice sèche :
Concentration (µg/kg)
n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg)
Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg)
CVr
(%)
CVr Max (%) – 2/3 CVHor
CVR (%)
CVR Max (%) – CVHor
82.3 3 x 6 6,4 17,5 2,7 15,5 8,1 23,3
Matrice grasse :
Concentration (µg/kg)
n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg)
Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg)
CVr
(%)
CVr Max (%) – 2/3 CVHor
CVR (%)
CVR Max (%) – CVHor
296.0 3 x 6 18,9 57,7 2.2 12.8 7.3 19. 2
Incertitude de mesure
Matière sèche Matière grasse
19% 18%
7 Consignes de sécurité et mesures spécifique
Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et
dans le log book de l'appareil.
Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte.
L’influence de la lumière (du jour ou artificielle) n’est pas connue. Éviter d’y exposer
inutilement les réactifs et les solutions.
8 Réactifs et solutions
Réactifs : les standards analytiques et les solutions sont conservés selon les conditions reprises sur les certificats. Les solvants sont conservés à température ambiante.
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8.1
Eau de qualité UPLC
Ethanol
Méthanol de qualité UPLC
Méthanol de qualité HPLC
Dichlorométhane
Acide Acétique
Acrylamide
Acrylamide-d3 (standard interne)
8.2 Solutions
8.2.1 Solutions d’Acrylamide
8.2.1.1 Solution stock (SS) d’Acrylamide à 1 mg/ml : 20 mg/ 20 ml d’éthanol
8.2.1.2 Solution fille A (SFA) d’Acrylamide à 5µg/ml : 100 µl SS/ 20 ml d’eau
8.2.1.3 Solution fille B (SFB) d’Acrylamide à 0,5 µg/ml : 1000 µl SFA/ 10 ml d’eau
8.2.1.4 Solution fille C (SFC) d’Acrylamide à 0,05 µg/ml : 100 µl SFA/ 10 ml d’eau
8.2.2 Solutions de Standard Interne (Acrylamide-d3)
8.2.2.1 Solution stock (SIS) d’Acrylamide-d3 à 1 mg/ml : 10 mg/ 10 ml d’éthanol
8.2.2.2 Solution fille A (SIA)d’Acrylamide-d3 à 10µg/ml : 100 µl SIS/ 10 ml d’eau
8.2.2.3 Solution fille B (SIB)d’Acrylamide-d3 à 0,5µg/ml : 1000 µl SIA/ 20 ml d’eau
8.2.3 Solutions d’étalonnage L1 à L5 6:
Niveau de calibration
Solution d’Acrylamide
(µl)
Solution d’Acrylamide-
d3 (µl)
Eau de qualité UPLC
(µl)
Concentration finale (ng/ml)
1 200 SFC 500 SIB 300 10
2 60 SFB 500 SIB 440 30
3 200 SFB 500 SIB 300 100
4 70 SFA 500 SIB 430 350
5 200 SFA 500 SIB 300 1000
6 300 SFA 500 SIB 200 1500
8.2.4. Solution d’acide acétique 0,1%
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- pipeter 500 µl d’acide acétique dans une fiole jaugée de 500 ml
- amener au volume avec de l’eau pour LC-MS et homogénéiser.
9 Equipements
Tubes Falcon de 50 ml
Moulinette-mixer
Balance analytique
Trébuchet
Bain à ultrasons
Agitateur orbital
Centrifugeuse (5000 t/min)
Micropipettes et tips
Seringues et filtres acrodisk de 0,2µm
Tubes à essai en pyrex
Système sous-vide pour cartouches SPE
Vials
Cartouches SPE HLB Oasis 200 mg, 6 ml
Cartouches SPE Bond Elut- Accucat 200mg, 3 ml
Chaîne UPLC-MS équipée d’un détecteur de masse de type triple quadrupôle, d’une
colonne analytique permettant une résolution correcte de l’acrylamide. La colonne
Synergi 2.5µm Hydro-RP 100A 100x2,0mm est donnée à titre d’exemple.
10 Méthode
10.1 Préparation des échantillons inconnus
10.1.1 Préparation et extraction
Broyer et homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un mixer.
Dans un falcon de 50 ml, peser au trébuchet environ 1 g d’échantillon homogénéisé (0,5g
pour la matrice café), avec une précision de 0,01g.
Ajouter 500 µl de la solution SIB de standard interne.
Compléter le volume à 15 ml avec de l’eau de qualité UPLC.
Agiter vigoureusement et placer 15 minutes au bain à ultrasons.
Ajouter 2 ml de dichlorométhane.
Agiter vigoureusement et placer 20 minutes à l’agitateur orbital.
Centrifuger 15 minutes à 5000 t/min.
Filtrer le surnageant sur filtre acrodisk de 0,2µm
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10.1.2 Purification sur cartouche SPE Oasis
Conditionnement : + 3,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 3,5 ml d’eau de qualité UPLC
Echantillon : + 1,5 ml de surnageant
Lavage : + 0,5 ml d’eau de qualité UPLC
Elution : + 1,5 ml d’eau de qualité UPLC
Récolter la dernière fraction dans un tube à essai en verre.
Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec, sauf pour l’élution!
10.1.3 Purification sur cartouche SPE Accucat
Marquer un trait à 1 ml sur la cartouche
Conditionnement : + 2,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 2,5 ml d’eau de qualité UPLC
Echantillon : + la totalité de l’éluat issu de la cartouche Oasis
Eliminer jusqu’au trait à 1 ml
Récolter le reste et transférer dans un vial
Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement!
10.2 Préparation de l’échantillon dopé de contrôle
A chaque séquence d’analyses, un échantillon de la série est dopé.
Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, et ajouter précisément
à la micropipette une certaine quantité d’une des solutions filles en acrylamide correspondante, en
même temps que la solution de standard interne.
Par exemple, pour un dopage à 100 µg/kg, ajouter 200 µl de la SFB en acrylamide à 0,5 µg/ml.
A chaque série d’analyse :
- Un échantillon pain est préparé suivant la procédure des échantillons inconnus.
- Contrôle basse concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide
par l’ajout de 100 µl de la solution SFB et préparé selon la procédure des échantillons
inconnus.
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- Contrôle haute concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide par
l’ajout de 200 µl de la solution SFA et et préparé selon la procédure des échantillons
inconnus.
10.3 Préparation d’un blanc méthode
A chaque séquence d’analyses, un blanc méthode est réalisé.
Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, ajouter la solution
de standard interne, mais ne pas ajouter d’échantillon ni de solution de dopage dans le falcon
de 50 ml.
10.3 Préparation d’un échantillon de contrôle
Par série, et par type de matrice, un échantillon de contrôle est ajouté. Il s’agit d’un
échantillon de la série supplémenté à 50 µg/kg en acrylamide .
10.4 Conditions chromatographiques
10.4.1 Paramètres de l’UPLC :
Volume d’injection : 2 µl
Température de la colonne : 30°C
Température de l’autosampler : 10°C
Solvant de rinçage de la seringue et du piston : Eau (UPLC) (80%) – Méthanol (UPLC)
(20%)
Gradient d’élution :
Temps (min) Flow (ml/min) A : Eau UPLC B : Méthanol UPLC
D : Eau + 0,1% HAc
Initial 0.200 73.5 2.0 24.5
2.50 0.200 73.5 2.0 24.5
2.51 0.200 37.5 50.0 12.5
3.51 0.200 37.5 50.0 12.5
6.00 0.200 73.5 2.0 24.5
8.00 0.200 73.5 2.0 24.5
10.4.2 Paramètres du spectromètre de masse
Mode ESI.
Polarité : ES+
Température de la source : 150°C
Température de désolvatation : 650°C
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Débit de gaz de désolvatation : 1000 l N2 / heure
Débit de gaz – cone : 150L/heure
Débit de gaz – collision : 0.2 ml/minute
Acquisition : MRM
- Acrylamide : m/z 72 > 55
- Acrylamide-d3 : m/z 75 > 58
10.5 Séquence d’injection des solutions
courbe d’étalonnage L1 à L5
blanc méthode
échantillons inconnus et types (max 8)
L1 et L4 (quality check)
échantillons inconnus et types (max 8)
L1 et L4 (quality check)
…
11 Contrôle de la qualité
11.1 Contrôles de première ligne
11.1.1 Identification des pics : l’analyse est réalisée en mode MRM (transition m/z : 72 > 55)
Identifier l’acrylamide dans la solution d’échantillon en comparant le temps de rétention avec
celui des solutions de contrôle (L1 et L4) l’encadrant. Les temps de rétention ne peuvent
différer de plus de 5 %.
Identifier l’acrylamide dans la solution d’échantillon en comparant le temps de rétention de
l’acrylamide et de l’acrylamide-d3. Les temps de rétention ne peuvent différer de plus de 0,05
minute.
11.1.2 Contrôle du blanc méthode
Le blanc méthode ne peut présenter de pic ayant un S/N >10 3 aux temps de rétention de
l’acrylamide ou de l’acrylamide-d3 (SI).
11.1.3 Contrôle de la droite d’étalonnage
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La quantité trouvée pour les injections des niveaux d’étalonnage (QC : L1 et L4) ne peut
différer de plus de 10 % de la quantité théorique.
Pour chaque niveau d’étalonnage, le pourcentage de déviation entre la concentration
mesurée et la concentration théorique doit être inférieur à 10%
Le rejet d’un des points d’étalonnage est autorisé à condition que cela ne soit ni le
premier ni le dernier niveau.
11.1.4 Suivi de l’échantillon de contrôle
Le rendement de l’échantillon de contrôle devra être compris dans l’intervalle 100 +/- l’incertitude
de mesure. Si ce critère n’est pas rencontré, la série d’analyse doit être recommencée.
11.2 Contrôles de deuxième et troisième ligne
Des contrôles deuxième et troisième ligne sont réalisés selon la procédure : « LAB 23 P 020
Gestion des contrôles qualité ».
12 Calcul et rapportage
Établir la droite d’étalonnage en rapportant les facteurs de réponse des pics des solutions
étalons par rapport aux concentrations correspondantes en µg/kg.
La droite d’étalonnage est du type y = ax + b
On peut déterminer la quantité d’analyte X (µg/kg) présent dans l’échantillon selon la
formule :
X = (y-b)
a x PE
La non-conformité du résultat est appréciée sur base des fiches techniques disponibles sur
Intranet.
13 Références aux procédures, instructions, documents, formulaires ou
listes y afférents
13.1 Procédures
LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité
LAB 23 P 018 Création et suivi des cartes de contrôle qualité
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13.2 Formulaires
LAB23 F543-PR-ACRYLAMIDE : Rapport d’exécution – Dosage de l’Acrylamide
13.3 Listes
néant
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14 Annexes
Annexe 1 : Flowchart de la préparation des échantillons.
Blanc méthode:
Tube Falcon de 50 ml
Echantillon dopé:
Tube Falcon 50 ml + solution
fille en acrylamide + 1 g
échantillon (0,5 g si café)
Echantillon:
Tube Falcon 50 ml + 1 g
échantillon (0,5 g si café)
Echantillon de contrôle:
Tube Falcon 50 ml + 1 g échantillon type
15 minutes au bain ultra-sons
20 minutes à l’agitateur
Centrifuger 15 minutes à 5000 tpm
Récupérer le filtrat afin de le purifier sur colonne
Purification manuelle sur colonne SPE HLB Oasis 200mg/6ml
Conditionnement : + 3,5 ml méthanol de qualité UPLC
+ 3,5 ml H2O de qualité UPLC
Echantillon: + 1,5 ml extrait (surnageant)
Lavage: + 0,5ml LC-MS H2O
Elution: + 1,5ml LC-MS H2O
Récolter dans tube en verre
La colonne SPE ne peut pas aller à sec sauf pour l’élution !
transférer dans un vial pour LC-MS
+ 500 µl SFB en
acrylamide-d3 (SI) (=250 ng)
+ 2 ml dichlorométhane
Amener à 15ml avec eau qualité UPLC
Purification manuelle sur colonne SPE Bond-Elut AccuCAT 200mg/3ml
Marquer le trait 1 ml sur la cartouche
Conditionnement : + 2,5 ml méthanol
+ 2,5 ml H2O de qual. UPLC
Echantillon: + la totalité de l’extrait issu de la cartouche Oasis
Eliminer jusqu’au trait à 1 ml
Récolter dans un tube en verre
La colonne SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement !
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Annexe 2 : Flow chart : « Détermination de la teneur en acrylamide dans les aliments par LC/MS»
Ajouter 2 ml de dichloromethane
1g échantillon broyé + 250 ng SI + solution de dopage (si échantillon dopé) + amener à15ml avec eau de qualité UPLC
Placer 15 minutes au bain à ultra-sons
Placer 20 minutes à l’agitateur rotatif
Passer 1,5 ml du surnageant sur cartouches SPE
Centrifugation 15 minutes à 5000 t/min