ANALYSE CLONALE SOMATIQUE Pour quoi faire? - analyse de mutations récessives létales. -...
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ANALYSE CLONALE SOMATIQUE quoi faire ? alyse de mutations récessives létales. nération de tissus mosaïque. st d’autonomie cellulaire. itions : duire des crossing-over dans des cellules en mitose uvoir marquer le clone. Définition d’un clone : groupe de cellules de même génotype (issu d’un même fondateur), au sein d’un individu de génotype différent. (par ex.: -/- au sein de +/-)
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ANALYSE CLONALE SOMATIQUE
Pour quoi faire?- analyse de mutations récessives létales.- génération de tissus mosaïque.- test d’autonomie cellulaire.
Conditions:- induire des crossing-over dans des cellules en mitose.- pouvoir marquer le clone.
Définition d’un clone: groupe de cellules de même génotype (issu d’un même fondateur), au sein d’un individu de génotype différent. (par ex.: -/- au sein de +/-)
+
m
+
+m
m
+
m
+
m
Génotype:+ / m
+
+
m
m
+
+m
m
+
+m
m
+
m
+
m
+
m
+
+
PhénotypeRecombinaison mitotique
Analyse clonale somatique : SYSTEME FRT-FLP
flp
SitesFRT
Recombinaison site spécifique
+
+
m
m
+
+m
m
m
+flp
Génotype:+ / m ; HS-FLP / +
+
+
m
m
+
+m
m m
+flp
Marquage des clones
UB-GFP
Choc thermique
Génotype:+ , UB-GFP , FRT / m , + , FRT ; HS-FLP / +
+
+
m
m
+
+m
m m
+flp
myc-tag
Choc thermique
Génotype:+ , FRT / m , mycTag , FRT ; HS-FLP / +
+
+
m
m
+
+m
m m
+flp
Marquage des clones : négatif (GFP)
UB-GFP
Choc thermique
Génotype:+ , UB-GFP , FRT / m , + , FRT ; HS-FLP / +
ProliférationClones jumeaux(« twin-spot »)
Prolifération, croissanceClones jumeaux(« twin-spot »)
Twin-spots
HS-FLP ; FRT rasc40b mycTag / FRT , +, + ; en-GAL4, UAS-P35
+
+m
m
m
+flp
Marquage des clones : positif (GFP) Système MARCM
UAS-GFP
PromoteurUbiquitaire
GAL4
Génotype:+ , UB-GAL80 , FRT / m , + , UAS-GFP , FRT ; UB-GAL4 , HS-FLP / +
GAL80
répresseur
Promoteur HS
répresseur
m
m UAS-GFP
maternelzygotique
Activation du génome zygotique
m
m + z
z
1 2 3
L ’ovocyte se développe dans un cyste
Fs
m
Fs
Fs
PhénotypeCLONES GERMINAUX : technique « FLP-DFS »
Fs
Fsm
m
flp
Génotype:Fs , + , FRT / + , m , FRT ; HS-FLP / +
+
+
+
+
Fs
m
+
+
Fs
m
+
+
Fs
Fsm
m
flp
+
+
+
+
Fs +
m+
Fs +
m+
PromoteurHSP 70
p-actine
FRT FRT
yellow GAL4
FRT
p-actine GAL4
UASGFP
UASgène X
ELEMENTS TRANSPOSABLES : P
TRANSFORMATION : LIGNEES TRANSGENIQUES
transposase
LacZGAL4UASGène X......
rosywhiteG418
+transposase
APPLICATIONS ET TYPES D'ELEMENTS P
- vecteurs d'expression(gène X; lacZ; GAL4; GFP; FRT; Flipase;...)
- pièges("enhancer-trap"; "gene-trap" ; "protein-trap")
- rapporteur(UAS;)
- mutagène
Vecteur d'expression
gène X; lacZ....
promoteur
ENHANCER-TRAP
LacZ
Promoteur minimal
ENHANCER
"PROTEIN-TRAP"
GFP
SDSA
UAS (5X)
Gène X
GAL4
GAL4
"GENE-TRAP"DEREGULATION
phénotype
GAL4 tissu-spécifique
WT en-GAL4
sans effet Régulateurpositif
Régulateurnégatif
TRACAGE DES CELLULES
Cycle rétroviral
Nicolas, J.F. et al. Development. 1996. 122:2933-46Eloy-Trinquet, S. et al Curr Top Dev Biol. 2000. 47:33-80
P7
GENES RAPORTEURS
