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ANALISI CITOFLUORIMETRICA

E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

ANALISI CITOFLUORIMETRICA

E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

Cos’è la CITOMETRIA A FLUSSO?• Citometria si riferisce alla misura di caratteristiche chimico-fisiche di cellule odi altre particelle biologiche.

• Citometria a flusso è una tecnica di misurazione multiparametrica dicaratteristiche fisiche e/o chimiche condotta su cellule in sospensioneall’interno di un fluido di trasporto.

• FACS - Fluorescence Activated Cell SortingÈ la citometria a flusso con la capacità aggiuntiva di separare e raccogliere le cellule con una serie di caratteristiche meccaniche ed elettriche.

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Definizione

CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO

Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse

misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimicheall’interno di un flusso laminare

che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

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Un po’ di storia

La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intornoagli anni 70, determinando un veloce ed intenso sviluppo delletecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente era limitata allamisura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l’altro per lafluorescenza.

La CFM porto’ grande impulso allo studio del sistema immunitario,grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali marcati con fluoresceina(FITC). La grande complessita’ del sistema immunitario e la presenzadi diverse subpopolazioni che reagivano con lo stesso anticorpostimolarono:

� lo sviluppo di MoAb sempre piu’ specifici;

� la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi;

� la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici

I PRIMI PROBLEMI…..

• trovare coloranti che potevano essere coniugati agli Ab senzamodificare la loro capacita’ di legame all’antigene;

• selezionare fluorocromi con spettri distinti di emissione.

E LE SOLUZIONI!!!

un punto di svolta nella CFM fu lo sviluppo di coloranti come leficobiliproteine, fluorocromi naturali solubili in acqua, fluorescenti apH neutro, facilmente coniugabili con MoAb, con elevate resequantiche.

Ficoeritrina (PE): viene eccitata dalla stessa lunghezza d’onda delFITC (488 nm), quindi possono essere usati insieme per realizzare unsistema di rilevazione molto sensibile in doppia marcatura.

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Citofluorimetria a flusso oggi

Negli ultimi anni la CFM ha raggiunto una notevole diffusione, sia inlaboratori clinici che in laboratori di ricerca.

Fattori che hanno contribuito a questo notevole sviluppo:

� la possibilita’ di utilizzare piu’ laser di emissione, che permette dieffettuare analisi multiparametriche a 4 e piu’ colori;

� la disponibilita’ di MoAb marcati con un’ampia gamma difluorocromi e diretti contro una larghissima varieta’ di Ag dimembrana e/o intracellulari;

� la riduzione dei costi e della complessita’ nell’utilizzo dellostrumento.

APPLICAZIONIPermette di analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo (50.000cellule in pochi secondi), quantificando numerosi parametri per ogni singolacellula.

Permette ad es. di determinare il contenuto di DNA, i diversi sottotipicellulari, gli organelli intracellulari, l’attivita’ di alcuni enzimi.

� Studio della ploidia e della proliferazione cellulare;

�Analisi del ciclo cellulare;

� Analisi immunofenotipica multiparametrica;

� Risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (celluleantigene specifiche, produzione di citochine, ecc);

� Livelli di apoptosi in patologie associate a deplezione cellulare (es AIDS)o accumulo cellulare (tumori);

� ecc ecc!!!!!

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COME FUNZIONA UN CITOFLUORIMETRO?1) Le cellule di una popolazione eterogeneavengono aspirate dalla provetta e immesse in unsistema fluidico il quale tende, in opportunecondizioni idrodinamiche, a trasportare le cellulein maniera separata e ordinata fino al punto dimisura.

2) Ogni singola cellula viene poi attraversata da unfascio di luce che eccita i fluorocromi e determinal’emissione di un segnale fluorescente

3) Il segnale passando attraverso un sistema lenti,specchi e filtri ottici, viene inviato ai sensori(fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misuranol’intensita’.

4) I segnali elettrici provenienti da ognisensore,opportunamente amplificati vengonoquindi processati e digitalizzati, sono inviati ad unanalizzatore, che elabora il dato e lo visualizzatramite un grafico.

5) Attraverso piastre di deflessione le celluleanalizzate possono essere raccolte separatamentetramite un processo definito “sorting”.

• Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica)

• Sistema ottico (laser Argon 488nm)

• Sistema elettronico (software CellQuest)

Componenti di un citofluorimetro a flusso

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Sistema Fluidico

La velocita’ di efflusso delle celluleviene valutata come numero dieventi al secondo: numero diparticelle che hanno incontrato ilraggio di luce nell’unita’ di tempo.

Il sistema di dispersione delcampione liquido fornisce unefficiente mezzo in grado dipresentare individualmente lecellule del campione alla stazionedi misura, dove intersecano ilraggio di luce emesso dal laser. E’importante evitare la formazionedi aggregati cellulari.

La sospensione cellulare viene spinta con pressione all’interno della camera diflusso, dove le cellule vengono messe in fila una dietro l’altra, grazie alladifferenza di pressione tra il campione e il fluido di trasporto. Si realizza così unflusso laminare concentrico di liquidi (FOCALIZZAZIONEIDRODINAMICA) in cui il più esterno (liquido di trascinamento) trasportaall’interno una sottile vena fluida di campione. Le cellule sono così forzate adallinearsi ed attraversare individualmente un punto di misura interagendo con ilfascio di luce del sistema di eccitazione. La pressione di spinta e la diluizione delcampione consentono di contare fino a qualche migliaia di cellule al secondo.

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Sistema Ottico

Le cellule così disposte passano davanti al raggio laser di forma ellittica,focalizzato in modo da colpire le cellule al centro del canale di contaformato dal liquido di trasporto.

Sorgenti luminose

Nella grande maggioranza dei citofluorimetri si utilizza una sorgenteluminosa a ioni Argon centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu).Tale luce consente una efficace misura dei parametri fisici, inoltre permettela contemporanea eccitazione di diversi fluorocromi.

Se e’ necessario utilizzare altre lunghezze d’onda bisogna utilizzare altri tipidi laser (es Kripton, Elio Neon, ecc)

I laser hanno costi molto elevati!!!

Un’alternativa piu’ economica e’ costituita dall’uso dei citometri a lampada,che hanno come fonte di eccitazione una lampada a vapori di Mercurio oXenon che non richiede particolari sistemi di raffreddamento. Sono utili perle applicazioni che riguardano particolari fluorocromi (es quelli utilizzati perla marcatura del DNA).

LIMITI: bassa potenza erogata, scarsa stabilita’ della luce di emissione,rapido decadimento

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Ione Argon.•UV 350/364 nm •Visible 458 465 472 488 496 502 515 nm

Ione Krypton.•UV 350/356 nm•Visible 468 476 482 520 530 568 647 676 nm

Helium/Neon 633 nmhoy@cf.ac.uk

Proprietà del Laser Radiazione coerente a discrete lunghezze d’onda.

Sorgenti più comuni:

Light scattering :

I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisichedelle popolazioni cellulari sono correlabili alle dimensioni dellecellule. Se si osserva una cellula in controluce, si misura un segnalelegato alla diffrazione (scatter) che è in relazione al diametro cellulare(FORWARD SCATTER O SCATTER LINEARE = FSC)

Se ci si pone ortogonalmente al fascio, si misura un segnale legatosostanzialmente alla riflessione e alla rifrazione (SIDE SCATTER OSCATTER A 90 = SSC) dovute alla granulosità cellulare, al rapporto n/c e allairregolarità della superficie cellulare.

Rifrazione & Riflessione:proporzionale allagranularità cellulare ealla complessità rilevate a90° rispetto la luceincidente

Diffrazione:proporzionale all’areadella cellula rilevatalungo l’asse della luceincidente 0°

Dall’interazione delle cellule con il raggio luminoso del sistema dieccitazione, vengono generati dei segnali dipendenti dalle caratteristichefisiche e dalla presenza di marcatori fluorescenti sulla superficie, nelcitoplasma o nel nucleo della cellula.

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RICAPITOLANDO:

Il Forward scatter distingue le cellule sulla base del volume ed è anche in grado di distinguere cellule vive da morte.

Il Side scatter tende ad essere più sensibile rispetto alle inclusioni all’interno della cellula e può essere usato per

distinguere le cellule granulate dalle non-granulate.

diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione di questi due tipi di segnale. Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari

basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche.

FSC e SSC rappresentano i parametri fisici. Raggruppandoli in un unico grafico se ne ottiene unobiparametrico, il Citogramma:

Citogramma

Grafici monoparametrici(istogrammi)

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Componenti di un citofluorimetro a flusso

Segnali di fluorescenza: in citofluorimetria vengono rilevati segnalifluorescenti generati:

• dall’utilizzo di MoAb marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc)specifici per antigeni presenti sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo;

• da fluorocromi che si legano in maniera stechiometrica a determinatesostanze come il DNA e l’RNA.

Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d’onda perl’eccitazione e l’emissione.

Limiti alla scelta di fluorocromi da utilizzare in combinazione:

• La lunghezza d’onda di eccitazione

• Le bande di emissione devono essere sufficientemente separate dapermettere la loro appropriata misurazione.

FLUOROCROMI

La fluorescenza e’ il fenomeno per cui una molecola colpita da unaradiazione luminosa di definita ne emette un’altra a maggiore (effettoBohr).Ogni fluorocromo presenta una caratteristica per l’eccitazione e perl’emissione.Se utilizziamo piu’ fluorocromi nello stesso protocollo sperimentale, le loroemissioni devono essere sufficientemente distanti per poter essere selezionatein modo distinto, ciascuna da un Fotomoltiplicatore.L’intensita’ della fluorescenza emessa è proporzionale al numero di siti dilegame.

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Con l’utilizzo degli anticorpi coniugati a Fluorocromi (e. Isotiocianato difluoresceina: FITC, FICOERITRINA (PE), etc:) ed il Citofluorimetro,sono stati identificati numerosi determinanti antigenici di superficie chepermettono di differenziare sia i vari tipi di cellule che il loro stadio dimaturazione

Come lavorano i fluorocromi?

• Un laser eccita il fluorocromo

• il fluorocromo eccitato sale nel livello successivo della nuvola elettronica

• il fluorocromo ritorna al livello originale e rilascia l’energia in eccesso comefotone

• i fotoni emettono a lunghezze d’onda maggiori rispetto a quelle a cuivengono eccitati

Fluorocromi diversi hanno lunghezze d’onda diverse

L’eccitazione proviene dal laser. Ci sono 4 diverse opzioni: 488nm Blue, 633nmRed, 405nm violet, 350nm UV.

Usando filtri e specchi è possibile separare le diverse lunghezze d’onda edinviarle a diversi detectors

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In caso di impiego di più di una sostanza fluorescente, le diverse emissionidi colore vengono separate attraverso un sistema di filtri ottici, in mododa poter analizzare separatamente tutte le diverse fluorescenze (FL1,FL2, FL3, FL4).

Sistema ElettronicoSistema di conversione ed elaborazione digitaleOgni singolo valore proveniente dai sensori,viene amplificato e convertito, costituendo cosi’ il“quanto citometrico” o evento. Tutti gli eventirelativi all’insieme dei dati misurati siaccumulano nei canali che ne rappresentano ladistribuzione dei valori.Il modo piu’ semplice di rappresentare unacorrelazione tra due parametri è il diagrammadi dispersione a due punti (dot plot),nel qualeogni punto rappresenta un singolo evento o uninsieme di eventi dotati di un definito valore perciascuno dei due parametri considerati.

I segnali emessi vengono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici edinviati ai relativi sensori (fotodiodi e Fotomoltiplicatori) che trasformano isegnali luminosi in impulsi elettrici direttamente proporzionali alla luce raccolta(ampiezza del segnale). Vengono poi digitalizzati ed inviati ad un elaboratore cheprovvede alla loro definizione statistica.

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Elementi fotoelettronici di base di un FACS

Fotomoltiplicatori trasformano il segnale in voltaggi

FSC SSC FL1 FL2 FL3

hoy@cf.ac.uk

File Size header+cells x (parameters x bytes).

Elencate e visualizzate ‘Header’ contiene informazioni riguardanticome Flow Cytometry l’esperimento ed il settaggio del citometro.Standard ( FCS ) I dati correlati sono registrati per singola cellulaFiles elencata per tutti I parametri selezionati.

Digitalizzati su una 0-255 (un byte) per la maggior parte scala discreta 0-1023 per risoluzioni superiori (i.e. DNA).

Amplificazione e linear linear log log lineartrasformazione logse richiesta

Rappresentazione dei dati

Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. Larappresentazione piu’ semplice e’ costituita dall’istogramma dovel’ascissa riporta l’intensita’ di fluorescenza e l’ordinata il numero dicellule che esprimono o meno l’antigene (diagramma di distribuzione).

L’analisi statistica si basasull’impostazione di cursori chedelimitano le aree di interesse, esulla quantificazione degli eventicellulari che rientrano in tali aree(la % di cellule è determinata conuna funzione integrale- area sottesadalla curva). Per ogni picco e’possibile calcolare dati statistici(valore medio, deviazione standard,coefficiente di variazione, ecc)

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Rappresentazione bidimensionale

Oltre all’istogramma, e’ possibile utilizzare una serie di rappresentazioni bidimensionali, che permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro.

Dot-plot:ogni singolo punto rappresenta un evento

Contour-plot:Visualizzano aree aventi la stessa densita’

mediante linee concentriche

CD8-/CD4-

CD8+/CD4-

CD8-/CD4+

Si possono utlizzare altre rappresentazioni dove l’intensita’ delcolore e’ proporzionale alla densita’ degli eventi

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Campione : cellule ematiche periferiche dopo lisi emzie.Dati raccolti su 10000 cellule.

Dot

Horizontal : low angle scatter. Vertical : high angle scatter.hoy@cf.ac.uk

Density Contour

VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :

• multiparametricità• possibilità di mettere in relazione più caratteristiche

della stessa cellula• analisi di grandi quantità di cellule

• riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni

• grande sensibilità• rapidità di analisi

• possibilità di ulteriori analisi a posteriori

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Limitazioni dell’ANALISI citofluorimetrica :

• nella necessita’ di impiegare sospensioni monocellulari, • nei costi,

• nella relativa complessità della strumentazione che richiede un addestramento estensivo del personale ed

accurata manutenzione.• Nessun citofluorimetro a flusso potrà dare buoni risultati da cattivi campioni, e questo fondamentale

aspetto preanalitico dipende dallo scrupolo dell’operatore e dalla sua capacità di valutare anche

visivamente la qualità di un preparato cellulare o di una marcatura.

Applicazioni1. determinazione dei marcatori di

differenziamento cellulare, di superficie,intracitoplasmatici e intranucleari

2. valutazione del contenuto cellulare di DNA3. discriminazione tra cellule vive, cellule

apoptotiche e necrotiche4. predisposizione per la separazione cellulare5. Macchina per l’emocromo-> un citofluorimetro

a basso costo predisposto alla lettura deglielementi corpuscolati del sangue.

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Una delle principali applicazioni cliniche e sperimentalidella Citofluorimetria riguarda l’immunofenotipizzazionelinfocitaria che consiste nell’utilizzazione di anticorpispecifici diretti verso i vari marcatori di membrana CD(Cluster Of Differentiation) al fine di differenziare,all’interno di un pool di linfociti, le diversesottopopolazioni.I linfociti infatti, morfologicamente indistinguibili traloro, sono costituiti da diverse sottopolazioni con ruolispecifici nella risposta immunitaria, le quali hanno pero’diverse espressioni antigeniche.

Nelle patologie coinvolgenti il sistema immunitario,ritroviamo caratteristiche alterazioni dei rapporti tra lesottopolazioni linfocitarie, che possono essere riconosciutegrazie alla loro Tipizzazione citofluorimetrica.

Tipi di cellule

• Immunofluorescenza

• Antigene specifico

• Reporters genetici– FACS Gal

– FISH

– GFP

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• Immunofluorescence

• Antigene specifico

• Reporters genetici– FACS Gal

– FISH

– GFP

• Immunofluorescence

• Specific antigen

• Genetic reporters– FACS Gal

– FISH

– GFP

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Stadi: Quiescenza, Attività, Apoptosi

• DNA Totale: ciclo cellulare

• Sintesi di RNA

• Mitocondri

• Ca++ Intracellulare

• pH Intracellulare

• Esposizione di fosfatidilserina

G0/1

S G2/M

Apoptosi: Annexin-V + PI

Ref: Beckman Coulter Inc: http://www.beckman.com

Dead Cells

Viable Cells

Early Apoptosis

Late Apoptosis

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The Pre-Apoptotic Sequence

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