44 31 Methode Ceratocystis Platani Version b Cle893e62

7/21/2019 44 31 Methode Ceratocystis Platani Version b Cle893e62

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MF/97/09 version b1/14

Direction Gnral de lAlimentation

Sous-direction de la Qualit et de la Protection des Vgtaux

Vgtal : platane (Platanusspp.),

Dtection de

Ceratocystis platani

par pigeage biologique

Laboratoire de rfrence : Laboratoire national de la protection des vgtaux

Rf. : MF/97/09 version b

LABORATOIR

E

DE

REFERENCE

Laboratoi

renationaldela

Protectio

ndesvgtaux

METHODE OFFICIELLE

Laboratoire de mise au point

Station de MycologieDomaine de PixrcourtBP 9005954220 MALZEVILLE

M


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RevueLes mthodes de dtection publies au bulletin officiel sont revues priodiquement en fonction des prioritsdfinies par le sous directeur de la qualit et protection des vgtaux.

ModificationLes modifications des mthodes officielles peuvent tre effectues en tant que de besoin, elles sont

numrotes et dates sur chaque mthode.

DistributionLes mthodes de dtection publies au bulletin officiel de la rpublique franaise par la Sous Direction dela Qualit et Protection des Vgtaux sont les mthodes de rfrence utilises dans le cadre des analysesofficielles. Elles sont disponibles sur le site Internet du Ministre de lagriculture et de la pche(www.agriculture.gouv.fr).

Limite de responsabilit :La publication dune mthode de dtection propose par le laboratoire de rfrence ou le LNPV est de laresponsabilit du Sous-Directeur de la Qualit et de la Protection des Vgtaux.La Sous-Direction de la Qualit et de la Protection des Vgtaux, le laboratoire de rfrence ou le LNPVne peuvent en aucun cas tre ports responsables des conditions dutilisation de cette mthode dans lecadre des analyses de routine effectues dans les laboratoires utilisateurs.

Manipulation des organismes de quarantaine:Les organismes phytopathognes de quarantaine sont lists dans la directive 2000/29 modifie pour lUnionEuropenne et de nombreux autres pays. En France, en application du code rural, leur dtention et leurmanipulation exigent des prcautions en terme de confinement et sont soumis autorisation prfectoralpralable. Les laboratoires manipulant ces organismes doivent sassurer quils respectent toutes lesexigences rglementaires les concernant.

Management de la qualit :Les laboratoires doivent tablir un systme de management de la qualit conforme aux exigences de lanorme ISO/CEI 17025 et notamment en ce qui concerne les exigences gnrales concernant la comptence

des laboratoires dtalonnages et dessais


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Sommaire

1- Introduction4

2- Objet .4

3- Domaine dapplication.4

4- Dfinitions ..5

5- Principe .5

6- Consommables et produits.5

7- Matriel..6

8- Echantillonnage et chantillon...6

8.1 Echantillonnage ..6

8.2 Prparation de lchantillon pour analyse .6

9- Mode opratoire ....6

9.1 Prise danalyse ..6

9.2 Mise en place des contrles .. 6

9.2.1 Tmoin ngatif de processus.6

9.2.2 Tmoin positif de processus..6

9.3 Mise en pratique ...7

9.3.1 Prparation du matriel et consommables..7

9.3.2 Mise en place des chantillons..7

9.3.3 Incubation..7

9.4 Observation ...7

9.5 Expression des rsultats .7

9.5.1 Lecture des rsultats 7

9.5.2. Validation de lanalyse...8

9.5.3. Interprtation des rsultats8

9.5.4. rapport dessai.8

10. Schma du mode opratoire..9

11. Rfrences bibliographiques.9

12. Annexes 10-13


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VEGETAL : PLATANE (PLATANUSSPP.),DETECTION DECeratocystis platani

PAR PIEGEAGE BIOLOGIQUE

Avertissements et prcautions de scurit

Dcontamination des restes de lchantillon aprs analyse, en chaleur humide par passage lautoclave pression de vapeur au moins 20 minutes 121C ou par tout autre traitement permettantdobtenir un rsultat quivalent.

Dsinfection du matriel recyclable (verrerie, rpartiteur, ) soit par strilisation dans les conditionsprcdentes (si le matriel le supporte) soit par trempage dans une solution dhypochlorite de Sodium oudeau de Javel, dilue et titre au moins 1% de Chlore actif, au minimum 10 minutes, ou par tout autremoyen permettant darriver un rsultat quivalent .

limination de tous les diffuseurs et tuyaux du dispositif d'aration la fin de lanalyse.

1. Introduction

Le champignon Ceratocystis platani (Walter) Engelbrecht et Harrington (synonyme : CeratocystisfimbriataEllis et Halsted f.sp. plataniWalter, synonyme :Endoconidiophora fimbriata (Ellis et Halsted)Davidson f.sp. plataniWalter), agent du chancre color du platane, est un ascomycte de lordre desophiostomatales. Sa forme imparfaite (stade conidien) est Chalarasp.

Les platanes (Platanus spp.) sont les seuls htes de cette forme spcifique.

Ceratocystis platani(Walter) Engelbrecht et Harringtonest un agent de trachomycose (dgnrescencedu systme vasculaire) provoquant de graves dprissements et entranant rapidement la mort desarbres (3 7 ans). Les arbres atteints sont priori reconnaissables par leur feuillage clairsem et

jauntre, ainsi que le dprissement dune ou plusieurs branches.Le champignon se manifeste sous forme de lsions de lcorce, reconnaissables leur aspect deflamches de couleur bleu-noir ou violette sur le tronc et les branches. Il pntre obligatoirement par desblessures et gagne lintrieur de larbre par les rayons ligneux et les vaisseaux.Le parasite est principalement vhicul par les outils infects soit loccasion dlagages, soit lors detravaux de terrassement. La dissmination peut galement seffectuer par lintermdiaire des eaux decanaux et de rivire, par simple contact racinaire et partir de tissus vgtaux infects morts.

Conformment aux exigences sanitaires des vgtaux ou produits vgtaux, Ceratocystis platani estconsidr comme un organisme de quarantaine (Annexe II, partie II : Organismes nuisibles prsentsdans la communaut et importants pour toute la communaut sils se trouvent sur certains vgtaux ouproduits vgtaux ). La lutte contre ce champignon concerne les vgtaux de Platanus, destins laplantation, lexception des semences, et les bois de Platanus, y compris celui qui na pas gard sa

surface ronde naturelle.

2. Objet

Cette mthode qualitative s'applique la dtection de Ceratocystis platani. Elle est utiliser pour lesanalyses officielles notamment dans le cadre des contrles phytosanitaires rglementaires pour lesparasites de quarantaine en surveillance du territoire et l'importation.

Seuls les laboratoires remplissant les conditions pour lintroduction ou la circulation de certainsorganismes nuisibles pour des travaux des fins dessais (Directive 2008/61/CE) peuvent maintenir etmanipuler des champignons de quarantaine ou rglements vivants et cela dans des strictes conditionsde quarantaine.

3. Domaine d'application


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La mthode par pigeage biologique (Grosclaude et al. (1988)) permet de dtecter C. platani: dans des chantillons collects sur arbre en place , de prfrence en bordure de lsions, lendroit o le champignon est le plus actif:

- soit laide dune tarire de type Pressler (carottes de bois)- soit par tout autre moyen permettant un prlvement quivalent (copeaux de bois )

dans tout autre matriel susceptible dhberger le champignon (dbris darbres dprissant oumorts, sciure, eau, terre, etc. .....).

4. Dfinitions

Cellule conidiogne:cellule qui produit une ou plusieurs conidies.

Endoconidie: spore asexue (= conidie) dj forme l'intrieur de la cellule conidiogne.

Prithce: fructification (souvent globuleuse) contenant asques et ascospores, issue de la reproductionsexue.

Ascospores : spores rsultant d'un processus de reproduction sexue toujours formes dans un sacappel asque qui s'ouvre maturit pour les librer.

5. Principe

Le principe de la mthode consiste utiliser une bchette de bois de platane sain, que l'on corce avantde la mettre en contact avec le matriel tester dans un milieu liquide ar. La bchette de platane sainjoue le rle de pige spcifique vis vis du champignon ventuellement prsent dans le matriel tester (cf. Paragraphe 7- Annexe 3).

6. Consommables et produits6.1. Bchettes provenant de platane sain- de diamtre de 5 15 mm environ- de longueur peu prsquivalente la hauteur du rcipient utilis.

Un lot de bchettes homogne correspond des tronons dbits dans un ou plusieurs rameauxprlevs le mme jour, sur le mme arbre.A leur arrive au laboratoire, les rameaux sont stocks dans un rfrigrateur (ou une chambre

froide), une temprature de 53C. Les extrmits des rameaux sont protges pr alablementpar un film plastique de type Parafilm afin dempcher le desschement du vgtal. Unetiquette portant la rfrence du lot (anne- numro dordre chronologique) et date de prlvementest appose sur le conditionnement contenant les rameaux. Un contrle visant vrifier leurfracheur est effectu avant utilisation (le phlome doit tre encore vert).

6.2. Ethanol 70% [Produit inflammable, maintenir loign des sources de chaleur et desflammes nues].6.3. Eau distille ou osmose ou eau de source.6.4. Acide lactique ou solution de bleu de mthyle environ 0,5% dans de lacide lactique.6.5. Eau de Javel ou solution dhypochlorite de sodium (NaOCl), 1% de Chlore actif minimum

[Produits corrosifs manipuler avec prcautions].6.6. Coton, papier absorbant.6.7. Vernis ongle ou baume du Canada (conservation de lames).6.8. Film plastique de type Parafilm.

7. Matriel

7.1. Dispositif d'aration avec tuyaux avec ou sans diffuseurs (type aquarium).7.2. Rcipient de type Erlenmeyer ou bocal dune contenance minimale de 200 ml7.3. Aiguilles de prlvement.7.4. Lames et lamelles pour montage microscopique et scotch7.5. Loupe binoculaire (minimum x25).

7.6. Microscope photonique (grossissement 20 1000) avec micromtre ou tout autre systmepermettant la mesure des lments observs..7.7. Autoclave pression de vapeur permettant datteindre une temprature de 121pendant au moins20 minutes ou tout autre traitement permettant dobtenir un rsultat quivalent.


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7.8. Brleur alcool ou tout autre matriel permettant la strilisation daiguilles la flamme.7.9. Pompe air.7.10. Rpartiteurs en mtal ou en plastique.7.11. Anti-retour pour pompe air (ncessaire si la pompe air est plac en dessous du niveau de leau).7.12. Rfrigrateur (T= 53C) ou chambre froide.7.13. Recommandation: Poste de travail en conditions striles (poste de scurit microbiologique, )

8. chantillonnage et chantillons

8.1 chantillonnage (cf. Annexe 4 : Symptmes et conseils de prlvement)

L'chantillon peut tre constitu:a)de carottes de bois(un minimum de 2 carottes est recommand), dune longueur denviron 5 cm,prleves laide dune tarire de type Pressler dans une direction approximativement radiale parrapport au tronc ou la branche qui porte un symptme suspect,b) de petits fragments de bois, de sciure, (de prfrence, volume infrieur ou gal 200 ml),c) de terre prleve au voisinage darbres atteints par le chancre color, deau dun cours deau

traversant une zone contamine

Chaque chantillon est dpos dans un conditionnement individuel bien hermtique (ex.: flacon plastiqueavec bouchon vissant) et parfaitement identifi.

Les outils sont dsinfects avant et aprs prlvement par trempage dans de lthanol 70% ou de leaude Javel (ou solution dhypochlorite de sodium (NaOCl)), dilue et titre au moins 1% de Chlore actif oudans lalcool brler ou par tout moyen convenable, le tout suivi dun gouttage nergique et flambage.

8.2 Prparation de l'chantillon pour analyse

Dans la mesure du possible, lchantillon est exploit ds son arrive au laboratoire. Lanalyse peut trereporte de quelques jours (5 maximum). Lchantillon est alors conserv au rfrigrateur 5C 3C.

Si ncessaire, les fragments de vgtaux sont dcoups sous une hotte permettant de travailler en

conditions striles, laide dun instrument pralablement dsinfect (tremp dans lalcool brler puispass la flamme et refroidi).

9. Mode opratoire

9.1. Prise d'analyse

Le test se pratique sur l'ensemble de l'chantillon, qui doit tre prpar pour pouvoir tre immerg dansle bocal

9.2. Mise en place de contrles

9.2.1. Tmoin ngatif de processus

Un tmoin ngatifest test pour chaque lot dchantillons afin de vrifier :- ltat sanitaire du lot de bchettes-pige vis vis du Ceratocystis platani,- labsence de contamination pendant la phase de traitement de lchantillon,- labsence de contamination croise entre chantillons pendant la dure de lanalyse.

Une bchette- pige, corce, provenant du mme lot de bchettes que celles utilises pour analyser leschantillons, est place, seule, dans un bocal tmoin, avec le mme dispositif de diffuseurs que lesbocaux tests. Ce bocal tmoin est mis incuber dans les mmes conditions que les chantillons tester(cf. Annexe 3).

9.2.2. Tmoin positif de processus

Un tmoin positif est ralis pour chaque lot dchantillons. Celui-ci permet de contrler la sensibilit du

lot de bchettes et de montrer que lanalyse sest droule de faon optimale (critre de performance).Une bchette-pige, provenant du mme lot de bchettes que celles utilises pour analyser leschantillons est place dans un bocal tmoin avec un chantillon hbergeant Ceratocystisplatani. Cetchantillon est constitu dun fragment de culture pure du champignon. Cette souche de rfrence est


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conserve au rfrigrateur et rgnre en tant que de besoin (cf. Annexe 5 : Rgnration des souchesde Ceratocystis platani). Le bocal tmoin est mis incuber dans les mmes conditions que leschantillons tester.

9.3. Mise en pratique (cf. Annexe 3 : Dispositif et matriel)

9.3.1. Prparation du matriel et consommables

- Ecorcer les bchettes saines,- Prparer un bocal par chantillon analyser et l'identifier par une rfrence unique,-Pour des chantillons constitus de carottes ou de fragments de bois, remplir peu prs moitichacun des bocaux avec de l'eau osmose ou de leau distille ou de leau de source,- Pour des chantillons de terre, deau ou de sciure, la quantit deau osmose est peu prsquivalente la quantit dchantillon tester,

- Prparer les systmes tuyau-diffuseur (un par bocal).

9.3.2. Mise en place des chantillons

Sous hotte permettant la ralisation des manipulations en conditions striles, chaque chantillon est traitindividuellement (le plan de travail, les ustensiles et les mains sont dsinfects lthanol 70% entrechaque chantillon) :

- Disposer lchantillon tester dans le bocal rfrenc correspondant(cf. Annexe 3).

- Plonger le systme tuyau-diffuseur puis une bchette- pige dont le sommet doit merger de leau,- Recouvrir immdiatement le bocal avec un film plastique de type Parafilm, de faon bien hermtique(ou tout autre moyen quivalent) afin dviter tout risque de contamination et de dissmination,

9.3.3. Incubation(dans une pice climatise TC= 226C)

- Monter le dispositif- Brancher la pompe- Laisser incuber 3 semaines maximum, en s'assurant que le bullage entrane un brassage de l'eau dechaque bocal,- Surveiller l'apparition dun myclium blanc et/ou d'une coloration noire sur la partie merge desbchettes piges.

9.4. Observation(sous loupe binoculaire et microscope photonique) (cf. Annexe 1 : Tlomorphe et Annexe2 : Anamorphe)

Aprs plusieurs jours dincubation, si C. plataniest prsent, on peut observer sur la partie merge de labchette:

- des amas d'aspect humide, voquant la neige fondante.Un prlvement ce niveau (de prfrence avec un scotch) pour examen microscopique rvle descellules conidiognes laissant chapper des masses d'endoconidies caractristiques de C.platani. Lesconidies sont hyalines, cylindro-tronques, ventuellement encore groupes en files raides (en moyenne5- 40 x 3- 6 m). (cf. annexe 2). Plus rarement, des endoconidies doliformes (7- 12 x 6- 9 m) sontformes en chanes courtes.

- des prithces du champignon, dont le col, trs allong (longueur : en moyenne 400 - 800 m), estfacilement reconnaissable mme la loupe binoculaire, sous forme dune sphre noire surmonted'une soie noire faisant saillie du bois. Les ascospores ont une forme caractristique de chapeau melon(4-8 m) (cf. annexe 1).

- des chlamydospores, paroi paisse, bulbeuses ou ampoules, bruntres maturit, isoles ou enchane, de dimension en moyenne 11-19 x 9-15 m sont parfois prsentes (cf. annexe 2).

9.5. Expression des rsultats

9.5.1 Lecture des rsultats

Pour conclure la prsence de Ceratocystis platanisur la bchette-pige, il est ncessaire :

- dobserver sous la loupe binoculaire la prsence dun myclium blanc voquant la neigefondante

- de vrifier par un montage entre lame et lamelle la prsence de cellules conidiognes librant lesendoconodies (cf. Annexe 2)


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Sils sont prsents (car certaines souches de C. platanine produisent pas de prithces) :- dobserver sous la loupe binoculaire la prsence et l'aspect des prithces de C. platani,- de vrifier par un montage entre lame et lamelle la forme des ascospores de C. platani (cf. fiche

annexe 1).

Dautres espces, Ceratocystis paradoxa,Ceratocystis moniliformis, ont des anamorphes semblables celles de Ceratocystis platani, cependant elles ne sont pas signales sur platane.

Les mesures des structures observes au microscope photonique (endoconidies, longueur du col desprithces, ) ne sont ralises quen cas de doute.

9.5.2. Validation de lanalyse

Lanalyse nest valide quaprs avoir effectu les observations sur :- le tmoin ngatif de processus- le tmoin positif de processus- la bchette-pige de la prise dessai

9.5.3 Interprtation des rsultats

Le tableau dcisionnel ci-dessous rsume toutes les possibilits dinterprtation des rsultats obtenus sur laprise dessai et les contrles mis en place.

Contrles

Tmoin ngatif noncontamin

etTmoin positif non

contamin*

Tmoin ngatif noncontamin

etTmoin positif

contamin

Tmoin ngatifcontamin

etTmoin positif non

contamin*

Tmoin ngatifcontamin

etTmoin positif

contamin

Contamine Dtect Dtect Indtermin(faux positif ?) Indtermin(faux positif ?)Prise

dessai nonContamine

Indtermin(faux ngatif?)

Non dtect Indtermin(faux ngatif?)

Non dtect

* Prvoir la rgnration de la souche de rfrence ou lutilisation dune autre souche de rfrence

9.5.4 Rapport dessai

Exprimer le rsultat dans un tableau comportant les informations ci-dessous ou par une phrase du type :

lorsque le rsultat de l'analyse est ngatif:"Ceratocystis platani non dtect sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant larfrence et le titre de la mthode ci-dessus.

lorsque le rsultat de l'analyse est positif:

"Ceratocystis platanidtect sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant la rfrence etle titre de la mthode ci-dessus.

lorsque le rsultat de l'analyse est indtermin :"Ceratocystis platani indtermin sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant larfrence et le titre de la mthode ci-dessus.Si possible, des informations sont donnes sur la cause de lindtermination.Dans ce cas, un nouveau prlvement peut tre transmis au laboratoire.

La mise en vidence de C. platanipeut tre confirme par l'envoi au laboratoire derfrencede lamesfixes et d'une fiche de renseignements dont l'imprim est demander au laboratoire.


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10. Schma du mode opratoire

11. Rfrence bibliographique

ENGELBRECHT CJB., HARRINGTON TC..Intersterility within Ceratocytis fimbriata. Mycologia 2005. 97-1 GROSCLAUDE C., OLIVIER R., PIZZUTO J.C., ROMITI C. ET MADEC S. (1988). Dtection par pigeage duCeratocystis fimbriata f. platani, Application ltude de la persistance du parasite dans du bois infect.European Journal of Forest Pathology, 18: 385-390.OEPP/EPPO (2003). Diagnostic protocols for regulated pests. Bulletin 33, 249- 255VIGOUROUX A.(1979) Une mthode simple de recherche de Ceratocystis fimbriata f.sp. platani sur arbreen place. European Journal of Forest Pathology 9, 316-320

12. Annexes

Annexe 1: Tlomorphe de Ceratocystis plataniAnnexe 2: Anamorphe de Ceratocystis plataniAnnexe 3: Matriel et dispositifAnnexe 4: Symptmes et conseils de prlvement des chantillonsAnnexe 5: Rgnration des souches de Ceratocystis platani


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MF/97/09 version b

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ANNEXE 1 : TELEOMORPHE

Prithces- Col trs long (400 - 800 m)

- : 140 - 220 m

- Absence dappendice

Ascospores

- Forme caractristique de chapeau melon- Longueur : 4 - 8 m

Au microscope photonique

A la loupe binoculaire

LNPV- SM LNPV-SM

LNPV-SM

LNPV-SM LNPV-SM


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MF/97/09 version b

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ANNEXE 2 : ANAMORPHE (FORME CHALARA)

Endoconidies

Deux types dendoconidies :1) Hyalines, tronques, cylindriques, ventuellement groupes en chanes courtes

Dimensions : 5 - 40 x 3 - 6 m2) Doliformes, brun-ple

Dimensions : 7 12 x 6 9 m

Cellules conidiognesde couleur brun-clair

Chlamydospores

- Bulbeuses, bruntres et paroi paisse,- Dimensions 11 - 19 x 9 -15m

LNPV-SM LNPV-SM

LNPV-SM LNPV-SM


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ANNEXE 3 : MATERIEL ET DISPOSITIF

Diffuseurs

Anti-retour

Rpartiteur

Pompe air

Tuyau en silicone

Dispositif des pigeages biologiques


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Annexe 4

Symptmes et conseils de prlvement des chantillons sur arbre en place

Symptmes

Zones de coloration caractristique dune section de tronc de platane infect

Prlvement

Lchantillon peut tre constitu de tout matriel susceptible dhberger le champignon : sciure,fragment de bois, carotte, Dans ce dernier cas, les chantillons sont collects en bordure deces lsions, si possible laide dune tarire de type Pressler. Les prlvements sont alorseffectus dans une direction radiale, sur une profondeur denviron 5 cm, Chaque chantillon estdpos au fur et mesure dans un conditionnement individuel , bien hermtique, et portant unerfrence unique.

Important : Les outils sont compltement dsinfects lthanol 70%,(ou par tout autre moyende mme pouvoir dsinfectant), avant et aprs prlvement, et entre chaque chantillon.

Reprer un platane suspect, porteur de symptmessuspects :

Feuillage clairsem et jauntreDprissement dune ou plusieurs branchesPrsence d une lsion de couleur bleu-noir ou violette,en forme de flamme, sur le tronc ou les grossesbranches,

Les lsions peuvent tre dtenduevariable. Leurs marges montrent desbandes ou plages allonges de couleurbleu-violette, bleu-noir (plus visibleslorsque lcorce est enleve) ou mouille GDON Marseille

GDON Marseille

GDON Marseille


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Annexe 5 : Rgnration des souches de Ceratocystis platani

La rgnration dune souche consiste effectuer un repiquage sur milieu glos solide (voircomposition ci-dessous), conditionn de prfrence dans des botes de Petri de diamtre90mm, partir dune souche pure du champignon, conserve sur milieu de culture glos ouen tube contenant de lhuile minrale ou . :

Pour un litreExtrait de Malt : 12g 1gChloramphnicol (200ppm) : 2ml s.s. 100lAgar Agar : 15g 1gEau osmose : qsp 1000ml 10ml

1- Repiquage :Les repiquages peuvent seffectuer sous une hotte flux dair strile ou sous une loupebinoculaire.Un fragment de myclium du champignon est prlev laide dun instrument (scalpel,aiguille, ..) strilis (ex. : tremper linstrument dans lalcool brler, le passer la flammeet le refroidir) puis dpos directement sur le milieu de culture raison dun implant par bote(prvoir si possible de 3 4 repiquages).

2- Incubation :Les botes ensemences sont mises en incubation dans une enceinte tempraturecontrle (T= 22 6C), avec un clairage de type lumire du jour photopriode de 12heures ou dfaut dans une pice climatise (T= 22 6C), la lumire du laboratoire.Loprateur ralise des observations rgulires des botes ensemences. Si des pollutionsapparaissent, loprateur procde de nouveaux repiquages.

3- Codification et stockage des souches de rfrence :Chaque bote ensemence porte la mme rfrence que la souche mre et la date durepiquage.Environ 10 15 jours aprs repiquage, loprateur vrifie sous la loupe binoculaire lacroissance du myclium et la prsence de prithces long col portant leur extrmit les

masses mucilagineuses contenant les ascospores du champignon.Les souches sont alors parafilmes, stockes dans une bote hermtique, parafilme, aurfrigrateur puis utilises en tant que de besoin.

4- Ralisation du tmoin positif de processus :Un fragment de cullture denviron 10mm sur 5mm est prlev puis dpos dans le bocaltmoin laide dun instrument strilis (voir paragraphe 1).

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