La ménopause La ménopause vue du laboratoirevue du laboratoirevue du laboratoirevue du laboratoire

Dr Michel RossierDr Michel RossierServServ. Chimie clinique et Toxicologie. Chimie clinique et ToxicologieInstitut Central des Hôpitaux ValaisansInstitut Central des Hôpitaux Valaisans

SommaireSommaire

Introduction à l’hormonologie

Le cycle menstruel

Les changements hormonaux liés à la ménopauseLes changements hormonaux liés à la ménopause

Les méthodes de dosage

Exemples cliniques

Les principales glandes endocrines et leurs hormonesLes principales glandes endocrines et leurs hormones

pinéalehypothalamus

hypophysethyroïde

parathyroïdes

pancréas

(thymus)

surrénales

TRH, SST, GnRH, CRF, GHRHDopamine

TSH, LH, FSH, GH,MSH, PRL, ACTH /AVP (ADH), OT

Mélatonine

Thyroxine (T4),Triiodothyronine (T3),Calcitonine

PTH

Aldostérone, Cortisol (F),DHEA, androgènes / Insuline, Glucagon,

homéostasie& stress

métabolisme& croissance

ovaires

testicules

DHEA, androgènes /Adrénaline, Noradrénaline

Insuline, Glucagon,Somatostatine (SST)

Estrogènes, Progestérone

TestostéroneAutres sources d ’hormones:

placenta: hCG (gonadotropine chorionique), Estrogènes, Progestéronecœur: Peptide natriurétique auriculaire (ANP)reins: 1,25-OH2D3, EPOestomac: Gastrine, Grhelineintestin: Sécrétine, Cholécystokininetissu adipeux: Leptine, Adiponectinecerveau: Divers peptides, stéroïdes(poumons): AVP, ACTH

reproduction

Transport des hormones vers leurs tissus cibleTransport des hormones vers leurs tissus cible

Reconnaissance de l’hormonepar son récepteurpar son récepteur

Laboratoire

conc.M mM µM nM pM

Domaine de concentrations des hormones circulantesDomaine de concentrations des hormones circulantes

Ins

gastrineADH

FTT tDop

T E

Na Glc

Ca

Méthodes chimiques & chromatographiques

Méthodes immunologiques

ACTHPTH

peptides

gastrine

amines/Tyr

Adr FT4T4tDop

stéroïdes

AldoCortisol

T E2DHEA-S

Transport des hormones dans le sangTransport des hormones dans le sang

- sous forme libre-associées à des transporteurs(protéines vectrices)

TBGtranscortineF

F T4

SHBG (Inst. Bioch. Zurich)

Albumine

TBG

IGF-BP ’sSHBG

E2

T

IGF

F

T4

T4

IGFT

E2

T

Problématique du dosage des hormones libresProblématique du dosage des hormones libres

GnRH

HypothalamusHypothalamus

HypophyseHypophyse

OvaireOvaire

EndomètreEndomètre

LH/FSH

OestradiolOestradiolProgestéroneProgestérone

Source: P. Bischof & M. Cohen

RétroRétro--contrôlecontrôle de l’axe de l’axe hypothalamohypothalamo--gonadiquegonadique

HYPOTHALAMUS

HYPOPHYSE

GnRH

--

+/+/--

--

OVAIRE

FSHLH

EE22 ProgProg

InhibinInhibin

AMHAMH

-- --

Le Le cycle ovariencycle ovarien

OvulationFollicularReserve

Signal

● A la naissance, 106 follicules primordiaux● A la puberté, 105 follicules primordiaux

FSH dependant growth

FSH independant growth

AtresiaSource: P. Bischof & M. Cohen

AMHAMH

La La Phase FolliculairePhase Folliculaire

Primaire

PréovulatoireFSHFSH

PrimordialAntral

RecrutementSélection Croissance

StéroïdogenèseStéroïdogenèseovarienneovarienne

Image: http://mapageweb.umontreal.ca/cabanat/bio2460/Gametogenese.html

EstradiolEstradiol

FSHFSH

aromatase

TestoTesto

Cholestérol

Pregnenolone

Progestérone

GRANULOSAGRANULOSA

THEQUESTHEQUES

LHLH

Progestérone

17OH-Progestérone

Androstènedione

Testostérone

Oestrone

Oestradiol

FSHFSHAromatase

Source: P. Bischof & M. Cohen

La La Phase OvulatoirePhase Ovulatoire

Caractéristiques:

- Élévation abrupte de la LH (due à la rétroaction positive de l’E2)

- Extrusion de l’ovocyte mûr au travers des parois folliculaires et ovariennes

Source: P. Bischof & M. Cohen

Dans les cellules de la Dans les cellules de la granulosagranulosa

Synthèse

ENZYMES PROSTAGLANDINES

LHLH

Digestion de Digestion de la paroi folliculairela paroi folliculaire

Séparation Séparation oocyteoocyte--paroi paroi folliculairefolliculaire

Contractions Contractions musculairesmusculaires

RUPTURE FOLLICULAIRE ET OVULATIONRUPTURE FOLLICULAIRE ET OVULATION

Source: P. Bischof & M. Cohen

LHLH

La La Phase Phase LutéaleLutéale

ProgestéroneProgestérone

OestradiolOestradiol

Corps Jaune

Source: P. Bischof & M. Cohen

Epithélium Glande

Modification de l’endomètreModification de l’endomètre

OH

=O

O

Couchebasale

Conjonctif

Epithélium de surface

Glande

HO

Règles Prolifération1 5 14 28 jours du cycle

DifférentiationSource: P. Bischof & M. Cohen

Les cycles:Les cycles:

-- hormonalhormonal

ovulation

Source: http://www.afblum.be/bioafb/systrepr/systrepr.htm

-- ovarienovarien

-- endométrialendométrial

phase folliculaire phase lutéale

OvulationFSHLHOestradiolProgestérone

le le cycle jour après jourcycle jour après jour

-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14

Jours depuis le pic LHSource: P. Bischof & M. Cohen

OvulationFSHLHOestradiolProgestérone

-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14

Jours depuis le pic LHSource: P. Bischof & M. Cohen

FSHLHOestradiolProgestérone

Ovulation

-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14

Jours depuis le pic LHSource: P. Bischof & M. Cohen

FSHLHOestradiolProgestérone

Ovulation

-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14

Jours depuis le pic LHSource: P. Bischof & M. Cohen

FSHLHOestradiolProgestérone

Ovulation

-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14

Jours depuis le pic LHSource: P. Bischof & M. Cohen

La ménopauseLa ménopause

60

50

40

30

Dur

ée du cy

cle en

jou

rsDurée moyenne d’un cycleDurée moyenne d’un cycle

30

20

10

0Dur

ée du cy

cle en

jou

rs

Mén

arch

e

Années post-ménarche

12-14 48-52

Source: P. Bischof & M. Cohen

Période

d’instabilité

La ménopauseLa ménopause

Définition (OMS): Cessation permanente des menstruations (aménorrhée pendant >12mois) résultant d’une perte de l’activité folliculaire ovarienne.

H.Burger et al. Rec Prog Horm Res 2002 57:257

ménopausepériménopause (~4 ans)pré-

ménopause

premierssymptômes(vers 45-48 ans)

dernièresrègles

transition

changementschangementshormonauxhormonaux

The Melbourne The Melbourne Women’sWomen’s MidlifeMidlife HealthHealth ProjectProject

- étude australienne longitudinale- étude australienne longitudinale

- 2000 femmes âgée de 45-55 ans

- pré-ménopausées et sans contraceptifs (438)

- dosage hormonal annuel en début de phase folliculaire

H.Burger et al. Hum Reprod Update 2007 13:559

Changements hormonaux associés à la phase de transitionChangements hormonaux associés à la phase de transition

FSH

E2

E2

FSH

H.Burger J Sex Med 2008 5:2266

diminutionréserve

ovarienne

INH-B

(0 correspond au moment des dernières règles)

Et les androgènes ?Et les androgènes ?(la diminution de la libido chez la femme a été

associée à une baisse des androgènes)

La testostéronetestostérone totale (T) et la DHEADHEA--SS diminuent régulièrement chez la femme entre 20 et 45 ans et changent peu pendant la phase de transition.

En fait, suite à la baisse de SHBGSHBG, la T libre aurait même tendance à augmenter.

Actuellement, il n’existe pas de bon marqueur biologiquede la phase de transition permettant de prédire la survenuedu dernier cycle menstruel.

En résuméEn résumé

La concentration d’AMH circulante (et l’ultra-sonographiedes ovaires) représente le meilleur moyen d’estimer laréserve ovarienne.

L’hormonologie est cependant très utile dans le diagnosticdifférentiel des aménorrhées.

Principales causes d’aménorrhéePrincipales causes d’aménorrhée

ConditionCondition LHLH FSHFSH LH/FSHLH/FSH E2E2 PRLPRL TT DHEADHEA--SS AMHAMH

Ménopause + ++ (-) - N N N -

Prolactinome - - N - + (-) N

Ovaires polykystiques + (-) + N (+) (+) (+) +

Caveat: les valeurs normales sont souvent méthode-dépendantes� valeurs usuelles du laboratoire

Les dosages hormonauxLes dosages hormonaux

Méthodes analytiquesMéthodes analytiques

Anticorps/récepteurspécifique Spectromètre de masse

Les Les immunodosagesimmunodosages

2 modes possibles:

- Compétition- Sandwich

PrinciplePrinciple of of competitivecompetitive immunoassaysimmunoassays

+ +

AntibodyLabeled analyte,tracer

Analyte,(in excess)

+

Free fractionBound fraction, complex

Separation

1st Antibody 2nd antibody, labeled

Analyte,sample

PrinciplePrinciple of of immunometricimmunometricassaysassays

+ +

1st Antibody(in excess)

2 antibody, labeled

Free fraction

Bound fraction,complex

Separation

+

sandwich

« sandwich »

BB

competition

Calibration Calibration curvescurves of of immunoassaysimmunoassays

NSB

B0

B=50%

EC50

Spe

cific

bin

ding

(B

/B0)

(= d

etec

ted

sign

al)

Analyte concentration (log M)

NSB

B0

B=50%

EC50

EIA /sandwich

RIA /compet.

125I

Relative size of the Relative size of the immunoassayimmunoassay protagonistsprotagonists

estradiol (272)

ββββ FSH (~14’700)

IgG (~150’000)peroxydase (~20’000)

An alternative for An alternative for smallsmall moleculesmolecules::Gaz or Gaz or liquidliquid chromatographychromatography coupledcoupledto mass to mass spectrometryspectrometry

C

AA

A

BB

B

BBB

C

C

C

C

C C

phasestationnary

phasemobile

AA

A

AAA

BB B

B

BB

C CC

CC

C

DetectionDetection and identificationand identificationof of steroidssteroids by massby massspectrometryspectrometry (MS)(MS) THE

488

THF

472

SteroidSteroid analysisanalysis by LCby LC--MS/MSMS/MS(triple (triple quadrupolequadrupole tandem MS)tandem MS)

Quadrupole filter

RJ Singh, Clin Lab News 2008: Volume 34, Number 12

cortisone (1)cortisol (2)21-deoxycortisol (3)cortiscosterone (4)11-deoxycortisol (5)androstenedione (6)dexycortiscosterone (7)17-hydroxy progesterone(8)progesterone (9)pregnenolone (10).

ESIAPCIAPPI

Parent ion selection

Physiology, Vol. 22, No. 6, 390-400, 2007

Fragmentation Fragment selection

MmeMme CyclamenCyclamen,

51 ans consulte pour une aménorrhée de 4 mois.Elle a pris trois kilos, dors mal et est déprimée.

Exemples pratiquesExemples pratiques

MmeMme YapludoffYapludoff,

35 ans consulte pour une aménorrhée de 4 mois. Ellea pris trois kilos mais n’a aucune autre plainte.L’anamnèse révèle qu’elle à un frère ayant un grosretard développemental.

Source: P. Bischof & M. Cohen

QUEL EST LE DIAGNOSTIC DE SUSPICION CHEZ QUEL EST LE DIAGNOSTIC DE SUSPICION CHEZ Mmes Mmes CYCLAMEN CYCLAMEN ET YAPLUDOFF? ET YAPLUDOFF?

QUE PEUT ON MESURER POUR CONFIRMER LE DIAGNOSTIC?QUE PEUT ON MESURER POUR CONFIRMER LE DIAGNOSTIC?

QUEL EST LE PREMIER TEST D’EXCLUSION A PRATIQUER?QUEL EST LE PREMIER TEST D’EXCLUSION A PRATIQUER?

Ménopause (ménopause précoce)

Grossesse: dosage hCG

Source: P. Bischof & M. Cohen

QUELS RESULTATS ATTENDONS NOUS?QUELS RESULTATS ATTENDONS NOUS?

LH, FSH, E2 (AMH)

LH FSH E2 AMH

BONUS:BONUS:QUEL EST LE LIEN ENTRE RETARDQUEL EST LE LIEN ENTRE RETARDMENTAL ET MENOPAUSE?MENTAL ET MENOPAUSE?

Mutation génétique:Syndrome de l’X fragile

Merci de votre attentionMerci de votre attention

Xq27.3Répétitions CGG

L ’X Fragile:

•la cause la plus fréquente de retard mental potentiellement héréditaire•1/4'000 -1/6'000 hommes •± 1/10'000 femmes avec RM dû à l'X fragile...

Women who carry a fragile X mental retardation 1 premutation are at risk for fragile X-associated primary ovarian insufficiency and should be counseled for a potentially reduced fertility. Multiple factors can affect the age of onset and severity of fragile X-associated primary ovarian insufficiency. In this study, we assessed the predictive power of several factors with predictive power of several factors with menopausal age, a surrogate measure of onset of fragile X-associated primary ovarian insufficiency.

fragile X-associated primary ovarian insufficiency (FXPOI), a problem with ovarian function which can lead to infertility and early menopause in some female gene carriers.

2 Ovaire2 Surrénale1

1

HO

=O

Cholestérol

17OH hydroxy-lase

=O

O

Progestérone

17-20Desmolase

=O

O

=O

HO

17OHPrégnènolone17 OHProgestérone

17-20Desmolase

3ß ol dehydro-genase

=O

O

CH 2 OH11 Deoxycortisol

=O

O

CH 2 OH

HO

Cortisol

HODesmolase

17OH hydroxy-lase

prégnènolone

3ß ol dehydro-genase 21 hydroxylase 11 hydroxylase

LH, FSH-

ACTH-

Desmolase Desmolase

Dehydroépiandrostérone( DHEA)

Androstènedione

HO

O

O

O

HO

OOestrone

HO

Oestradiol

3ß ol dehydro-genase

17 OH céto reductase

Aromatase

Aromatase

HO

Androstènediol

O

Testostérone

3ß ol dehydro-genase

17 OH céto reductase

17 OH céto reductase

3- La Phase Lutéale

Phase lutéale = formation et maintien du corps jaune

Durée = 14 jours +/- 2 jours

Si il n’y a pas de grossesse, le corps jaune régresse et le devtfolliculaire se poursuit en vue du cycle suivant

Cellules lutéales: synthèse progestérone+17-OH progestérone, E2, inhibine

empêchent le déclenchement d’un nv pic LH

C- Régulation du cycle

GnRHGnRH

+

-

OestradiolOestradiol

LH/FSH-

ProgestéroneProgestérone

L’Oestradiol

3ème ventricule

Chiasmaoptique

Régulation de LH, FSH, GnRH

-+

-

OHOH

Prolifération de l’endomètre

Hypophyse

Prolifération des cellules mammaires

HOHO

OHOH

Prolifération des cellules osseuses

La Progestérone

Epithélium Glande

=O

O

1 5 14 28 jours du cycleRègles Prolifération Différentiation

Couchebasale

Conjonctif

Epithélium De surface

Glande

FSH Oestradiol

LH

Environ200 pg/ml

Les rétrocontrôles

-18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 +2 +4 +6 +8 +10 +12 +14 +16

Jours depuis le pic LH

200 pg/ml

Evolution of assays in hormonology

Chemical reaction (after chromatography)(ex. steroids: B=corticosterone,E=cortisone, F=cortisol, S=desoxycortisol)

LC(GC)/MSBioassays(ex. insulin: hypoglycemicconvulsion in 50% of animals)

S=desoxycortisol)

Immunoassays(ex. insulin:1st RIA in 1959)

Chromatographic methods

Ex: serum aldosterone assay by RIA in solid phase

?

NSB

ED50Compteur gamma

B0

calibration

2) immuno-assays

-Based on the specificity and high affinity of the interactions antibodies (Ab) / antigene (Ag=hormone)

- 2 possible modes:

a) competitionsmall molecules (steroids, thyroid h., etc.)

Ag - Ab + Ag* (tracer) ���� Ag* - Ab + Ag

b) sandwichpeptides (TSH, FSH, PRL, PTH)

Ab - Ag + Ab* (conjugate) => Ab - Ag - Ab*

Lab terminology: - RIA: radio-immuno-assay (r.a. tracer)- IRMA: immuno-radio-metric-assay (r.a. antibody)- ELISA: enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (conj. Ab)

SeparationSeparation of of urinaryurinary steroidssteroids by GC/MSby GC/MS

ELISA sandwich ELISA sandwich methodmethod

2nd Ab,biotinylated

enzyme/streptavidine

substratechromogene

coloredproduct

1st Ab

hormone

Structure Structure chimiquechimiquedes des hormoneshormones

a) peptideset protéines

645-770 Da645-770 Da

700-30’000 Da700-30’000 Da

b) stéroïdes

c) dérivés de la Tyr

d) bioamines

adrénaline

~180 Da~180 Da

280-380 Da280-380 Da