Post on 19-Jan-2019
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 29.09.11
TP CIV 110-14/10
TP CIV 214-18/11
Bilan TP08/12
Callogénèse Caulogénèse OptimisationOrganogénèseindirecte
Caulogénèse Rhizogénèse OptimisationOrganogénèsedirecte
Callogénèse OptimisationOrganogénèseindirecte
Caulogénèse OptimisationOrganogénèsedirecte
Observations résultatsSemaine du 07/11
N. tabacum, var XanthiPlantes de 6 semaines
N. tabacum, var XanthiPlantes de 12 semaines
Explantsfoliaires
Groupe 1: Stratégie demicropropagation
Optimiser les conditions demicropropagation de N.tabacum, var Xanthien s’aidant de la publication de Ali et al. Tester les conditions optimales de la
publication avec N.tabacum, var Xanthi Variation de la nature et de la
concentration en hormones Variation des éléments minéraux (variation
de type de milieu)
Groupe 1: Conditions effectuéesVariations callogénèse
Milieux MS, MS ½, B5
Hormones Auxine Cytokinine
AIA, NAA, 2,4D BAP
Concentrations hormones Conditions optimales (publication)IAA 2,0 3,0 mMBAP 0,2 0,5 mM
Variations caulogénèse
Milieux MS, MS ½, B5
Hormones Auxine Cytokinine
NAA BAP, kinetin,Thidiazuron?
Concentrations hormones Conditions optimales (publication)
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Protocole TP BSNV
Anne-Sophie KirstetterElena Rosa MartinezLeo-Paul TisserantMaxime LestraAntoine VastelYannick Eveno
Groupe IIJulien Delecolle
06/10/2011
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
• 6 milieux d’Organogénèse indirecte
- NAA 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L- NAA 2,0 mg/L + Kinétine 0,2 mg/L- 2,4-D 2,0mg/L + Kinétine 0,2mg/L- 2,4-D 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L- IAA 2,0mg/L + Kinétine 0,2mg/L- IAA 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L
Milieu: MS, 30g/L sucrose, 8g/L agar
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
• 8 milieux d’organogénèse directe- BAP 2,0mg/L + NAA 0,2mg/L- BAP 2,0 mg/L + 2,4-D 0,2 mg/L- BAP 2,0mg/L + IAA 0,2mg/L- BAP 2,0mg/L- Kinétine 2,0mg/L + NAA 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L + 2,4-D 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L + IAA 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L
Milieu: MS, 30g/L sucrose, 8g/L agar
Si besoin, plutôt que de tester des milieux comportant uniquementcytokinine, on peut tester milieu B5 & MS ½.
Milieu Type d’auxineType de
cytokinine
Balancehormonale mg/L
(aux/cyt)Stratégie
MS
AIA
BAP
1/0,2
Callogenèse2/0,2
3/0,2
0,2/1
Caulogenèse0,2/2
0,2/3
2,4D
1/0,2
Callogenèse2/0,2
3/0,2
0,2/1
Caulogenèse0,2/2
0,2/3
NAA2/0,2 Callogenèse
0,2/2 Caulogenèse
- - - Témoin
groupe3
TP BSNV :MICROPOPAGATION
Thais Génard Adrien PaoliChristelle Hoefler Vanessa SchmeltzHugues Mandavid Aurore StrugalaJulia Mouton
STRATÉGIE:
Comparer l’effet de différentes hormones sur la callogenèseet la caulogenèse sur N. tabacum variété Xanthi
PLAN D’EXPÉRIENCE
Callogenèse Caulogenèse
1 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L NAA
8 2,0 mg/L BAP0,2 mg/L NAA
2 0,2 mg/L BAP1,0 mg/L NAA
9 1,0 mg/L BAP0,2 mg/L NAA
3 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L 2,4 D
10 2,0 mg/L BAP0,2 mg/L 2,4 D
4 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L IAA
11 2,0 mg/L BAP0,2 mg/L IAA
5 0,2 mg/L K2,0 mg/L 2,4 D
12 2,0 mg/L K0,2 mg/L 2,4 D
6 0,2 mg/L K2,0 mg/L IAA
13 2,0 mg/L K0,2 mg/L IAA
7 0,2 mg/L K2,0 mg/L NAA
14 2,0 mg/L K0,2 mg/L NAA
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 29.09.11
Groupe 1
Lundi 10/10
8h30-10h30+13h -15h30
Groupe 2
Lundi 10/10
10h30-12h30+ 15h30-18h
Groupe 3
Jeudi 13/10 9h-11h(+ 20min à 13h)+ Vendredi 14/108h-10h
Groupe 4
Vendredi 14/1010h30-12h30+ 14h30-16h30
BAUCHEDavid
KIRSTETTERAnne-Sophie
TEYSSIERLenny
GENARDThaïs
BAYRO-KAISERVinzenz
LESTRAMaxime
AMIRAULTHervé
HOEFLERChristelle
DEBARNOTCéline
TISSERANTLéo-Paul
SARMIENTOAneth
MANDAVIDHugues
ECKERTDoriane
DELECOLLEJulien
BONNEKatia
MOUTONJulia
FAUVELBlandine
EVENOYannick
BREARDDimitri
PAOLIAdrien
GROSSE-HONEBRINKAlexander
VASTELAntoine
CONANCéline
SCHMELTZVanessa
JAEGTiphaine
MARTINEZElena Rosa
DI PASCOLIThomas
STRUGALAAurore
SCHEFFLERSophie
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Groupe 3
Jeudi 13/10 9h-11h(+ 20min à 13h)+ Vendredi 14/108h-10h
Groupe 4
Vendredi 14/1010h30-12h30+ 14h30-16h30
TEYSSIERLenny
GENARDThaïs
AMIRAULTHervé
HOEFLERChristelle
SARMIENTOAneth
MANDAVIDHugues
BONNEKatia
MOUTONJulia
BREARDDimitri
PAOLIAdrien
CONANCéline
SCHMELTZVanessa
DI PASCOLIThomas
STRUGALAAurore
Groupe 3 :Préparation milieux :Jeudi 13/10 8h-10h+autoclave => 13h : répartition bdp
+ Lundi 17/10 14-16h : mise en culture
Nouvelle proposition de planning :
Groupe 4 :Préparation milieux :Jeudi 13/10 10h-12h+ Lundi 17/10 autoclave =>13h30 : répartition bdp16-18h : mise en culture
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Analyse publismicroprop
Angulo-Berajano &Paredes-Lopez, 2011
Nayak et al., 2010 Rossin & Rey, 2011
Objectifs Ingénierie métaboliqueOpuntia ficus-indica+ micropropagation
Transgénèse Emblicaofficinalis => R/ insectes ouchampignons
Transgénèse Manihotesculenta => R/ froid ,sécheresse ou virus
Stratégie Organogénèse indirecte1: Callo (2x1 mois)2: Caulo (1 mois)3: Rhizo (1 mois)4: Transfert ex vitro/acclimatation
Organogénèse directe1:caulo + 2: multiplication(6 semaines)+ 3: rhizo (3 semaines)+ 4: transfert ex vitro ( 2semaines + 2 mois)
Embryogénèse somatique
Paramètrestestés
BH Age explant (1)BH + nature hormone (2)
CultivarExplant ( feuilles ou bourgeons)Auxine ( 2,4D ou Picloram)
Explant Cladodes régénérées invitro à partir de cladodesstérilisées
Epicotyles de plantulesaxéniques de 1 et 2 semaines
Milieu minéral 1: MS 1+2: MS , 3: MS1/24 : Hoagland
Phytohormones 1: 2,4D 2,26 M/BA2,21 M2: BA 0,5 M3: pas d’hormones
1+2: BA 8,8 M + IAA 1,4 M3: IBA 14,7 M
Picloram 12 mg/l > 2,4D 8mg/lNature explant optimal dépendde cultivar
Autresconstituants
Agar 10g/l, Saccharose50g/lAntioxydantspH 5,7
Saccharose 3%Agar 0,8% - pH5,8
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Plante source Molécule(s)Bioactive(s)
Multiplication
Production
Culture in vitro Transgénèse
CIV &Substances naturelles végétales
Micropropagation
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites
- Shikonine / Lithospermum erythrorhizon
- Taxol /Taxus baccata
- Vinblastine / Catharantus roseus
=> Études de cas
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Analysepublis
prod MetII
Cai et al., 2011 Cui et al.,2011 Praveen et al., 2011
Objectifs Production de métabolitesIIaires par suspension cellulairede Vitis vinifera
Optimisation culture enbioréacteur (3l) de racinesadventives de Hypericumperforatum pour productionde metII
Optimisation de la productionde MetII par des suspensionscellulaires de Gymnemasylvestre
Stratégie Etude élicitation sur croissancecellulaire et production metII Haute pression 40MPa Streptomycin 28 mg/l Charbon activé 28 mg/l Ethephon 28 mg/l Haute pression + ethephon
Effet inoculum1,5 à 12 g/lintensité aération0,05-0,3 vvm
Effet macroéléments et ratioNH4+ / NO3-
Milieu deculture
Gamborg B5+ NAA 0,1 mg/l+ Kin 0,2 mg/l
MS1/2+ IBA 1 mg/l+ Kin 0,1 mg/l
MS modifié+ 2,4D 2 mg/l+ Kin 0,1 mg/l
Résultats -Pas d’effet des différentstraitements sur croissance-Inhibition de 60% des fortespressions sur productionanthocyanes à 7j-Augmentation (x9) par HP duniveau de production deresveratrol dans milieu (+Ethephon => x15)
Max :3 g/l0,1 vvm
Conditions optimales surcroissance et production métII:NH4NO3 x0.5 / KNO3 x2 /KH2PO4 x2+ Importance ratio NH4+ / NO3-optimal : 7,19mM /18,8 mM
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Taxol® (Paclitaxel)
Vinblastine, VincristineSerpentine, Ajmalicine
- Source : écorce d’If du pacifique( Taxus brevifolia)- alcaloïde diterpénique (taxanes)- anticancéreux
- Source : Pervenche deMadagascar (Catharantusroseus)- terpene indole alcaloïdes (TIA)- anticancéreux etreducteurs hypertension
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol et TIA
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Voie de biosynthèse Taxol ®Walker et Croteau (2001) Phytochem. 58 : 1-7
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11Zhong ( 2002) Jal Biosc. Bioeng. 94(6) : 591-599
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11Zhong ( 2002) Jal Biosc. Bioeng. 94(6) : 591-599
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11Zhong ( 2002) Jal Biosc. Bioeng. 94(6) : 591-599
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
Khosroushahi et al., 2006
Contrôle => 2.5 mg/l
B5+ NAA & 2,4D+kin+ antiox
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
Syklowska-Baranek et al., 2009
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
Syklowska-Baranek et al., 2009
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
Syklowska-Baranek et al., 2009
Contrôle :Paclitaxel11.6 0.9 g.g-1D.W.40.3 ± 0.6 g.L-1
+ L-Phe 100 M+ MJ 100 M
319.7 ± 14 568.2 ± 34X 28
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol
Syklowska-Baranek et al., 2009
Contrôle :Paclitaxel11.6 0.9 g.g-1D.W.40.3 ± 0.6 g.L-1
+ PAB100 M+ MJ 100 M
130.5 ± 9 221.8 ± 14X 11
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
TIA =terpene indole alcaloïdes
Vinblastine, Vincristine,Serpentine, Ajmalicine
Source : Pervenche de Madagascar (Catharantus roseus,Apocynaceae)anticancéreux et réducteurs hypertension
la vinblastine est un agent dépolymérisant, à l'inverse des taxanes quisont des agents polymérisants. ces deux classes de médicaments anti-cancéreux provoquent une inhibition de la dynamique desmicrotubules.
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
« Feeding »
Effet négatif 2,4DEffet positif méthyl jasmonate
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
Peebles et al., 2009
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
Peebles et al., 2009
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA
Peebles et al., 2009
BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11
Plante source Molécule(s)Bioactive(s)
Multiplication
Production
Culture in vitro Transgénèse
CIV &Substances naturelles végétales
Micropropagation