Techniques immunologiques

A) Propriétés du complexe anticorps/antigène

Plan du cours

Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse

Immunodiffusion

"Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot

Immunodétection

IgE: RIST et RAST

"Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs)

B) Propriétés du complémentCH50

C) Réponses lymphocytaires

Détection de complexes immuns: test au C1q

Test de lymphoprolifération aux mitogènes

Test de culture mixte

A) anticorps/antigèneImmunodiffusion

anticorps +antigène +++

anticorps++antigène ++

anticorps+++antigène +

équivalence

Précipitation

Ac polyclonal

Ac monoclonal

Visalisation sur gel(bleu de comassie)

Immunoélectophorèse

Ouchterlony

ImmunodiffusionA) anticorps/antigène

anticorps+antigène précipitation

Ouchterlony

Équivalence: précipité bleu

Sensibilité: 20-200µg/ml

Ouchterlony

• Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen)

• Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)

Ouchterlony

• Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum)

• Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer

• Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes– La bande la plus proche du puits central correspond à

l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)

Ouchterlony

• Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique

• Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité

Ouchterlony

• Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle

- F(ab)

- chains

- chains

- Fc from IgG with chains

- A mixture of heavy

and chains

- chains

Quizz: Ouchterlony

Réponses au Quizz (just for the fun)

• 1 Fab : identité partielle avec 2• 2. Chaînes

– Identité avec ligne externe de 3• 3. Mélange de chaînes et de chaînes légères

– deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon

• La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4)• L’autre ligne : la protéine la plus lourde g

• 4. Chaînes – Absence d’identité avec 5– Réaction d’identité avec une des protéines 3

• 5. Chaînes – Reconnaissance mais absence d’identité avec 4

• 6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes – Aucune reconnaissance (pas de bande)

Quizz: Ouchterlony

ImmunodiffusionA) anticorps/antigène

Immunoélectrophorèse

Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids

moléculaires très voisins)

Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par

précipitation

Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml)

Immunoélectrophorèse

Puits contenant la mixture d'Ag

Déplacement des ≠ Ag

Diffusion des Ac

Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes

DétectionImmunoglobulinesAlbumineTransferrine

Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine)

Utilisation:

Immunoélectrophorèse

Immunoglobulines

Polyclonal ou monoclonal

IgGIgM

Enzyme/Chromogène

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Radioactif

Fluorescence

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" ou d'anticorps soluble

ELISA Westernblot

Sérum Urine Surnageant de cultureEtc.

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" ou d'anticorps soluble

ELISA=

enzyme-linked immunosorbent assay

Enzyme/Chromogène

ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV

Résultat

Sensibilité: 10-1000 pg/ml

ELISA

ELISA sandwich

Ac de capture

Détection Ac

Détection Ag

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" ou d'anticorps soluble

Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel

Détection par Ac (présent dans le sérum du patient)

Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa)

Détection de Ac par un Ac marqué

Westernblot

Exemple: détection d'Ac anti-HIV

Résultat P

os

patientsNeg

Protéines HIV

Patient A: négatif

Patient B: indéterminé

Patient C: positif

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux

Immunohistochimie

Cytométrie en flux(FACS)

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules : sur coupe

Principe

indirecte

directe

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules : sur coupe

Exemple: marquage actine, tubuline et noyau

• Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules : sur coupe

Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur

Nég Pos

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules : sur coupe

Exemple: marquage Fas

NégPos

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Présence d'anticorps "anti-soi"

Sérum patient

Anticorps anti-nucléaire

Cellules test

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Présence d'anticorps "anti-soi"

Anticorps anti-nucléaire

A) anticorps/antigèneImmunodétection

"Ag" liés aux cellules en flux

Cytométrie en flux

FACS = fluorescence activated cell sorter

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Principe

indirectedirecte

Cytométrie en flux (FACS)

FACS

3000 cellules/sec

FACS

Sang

Taille

"gra

nu

losi

té"

Th

Tc

FACS Sang

Fluorescence verte

Flu

ores

cenc

e or

ange

Coupe:

Avantages et inconvénientsFacs versus coupe

Rapidité d'analyse

Multi-couleurs

Possibilité de tri

FACS:

Localisation

Interaction entre ≠ cellules

Atopie

A) anticorps/antigèneImmunodétection

IgE: RIST et RAST

A) anticorps/antigèneImmunodétection

IgE: RIST

RIST = radioimmunosorbent test

quantification des IgE totales

A) anticorps/antigèneImmunodétection

RIST = quantification des IgE totales

A) anticorps/antigèneImmunodétection

IgE: RAST

RAST = radioallergesorbent test

quantification des IgE spécifiques

A) anticorps/antigèneImmunodétection

RAST = quantification des IgE spécifiques

Le complexe C1

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Test au C1q

• La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface

A) anticorps/antigèneImmunodétection

Test au C1q

C1qComplexe immun

Ac libre

B) Propriétés du complémentCH50

Mesure l'activité fonctionnelle du complément

C3

C3b

C5-C9 Lyse de la cellule cible

Voie classiqueC1, C4, C2

Voie alterneP, C3, B, D

AmplificationP, B, D

Voie lectine complément

B) Propriétés du complémentCH50

Globule rouge sensibilisé par Ac

ComplémentSérum patient

Destruction du globule rouge

B) Propriétés du complémentCH50

Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges

ComplémentSérum patient

B) Propriétés du complémentCH50

Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)?

ComplémentSérum patient

B) Propriétés du complémentC3

C) Réponses lymphocytaires

Test de lymphoprolifération aux mitogènes

Test de culture mixte (MLR)

C) Réponses lymphocytairesTest de lymphoprolifération aux mitogènes

Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à un mitogène non

spécifique?

Détection immunodéficience

Comment observer les réponses des lymphocytes T in vitro?

Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium

dans le DNA

0

10

20

30

40

50

60

0 2.5 5 7.5 10

Quantité d’antigène

Rad

ioac

tivi

té

Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?

Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium

dans le DNA

0

10

20

30

40

50

60

0 2.5 5 7.5 10

Rad

ioac

tivi

té

Mitogène

Mitogène

Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium

dans le DNA

Patient immunodéficient0

10

20

30

40

50

60

0 2.5 5 7.5 10

Rad

ioac

tivi

té

Mitogène

Mitogène

Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?

C) Réponses lymphocytairesCultures mixtes (MLR)?

Les lymphocytes d'un patient réagissent-elles contre les cellules du donneur ?

Greffe

Prolifération lymphocytaire

0

10

20

30

40

50

60

0 2.5 5 7.5 10

Rad

ioac

tivi

té

Cellules du donneur

0

10

20

30

40

50

60

0 2.5 5 7.5 10

Rad

ioac

tivi

té

Pas de réaction

Réaction receveur-donneur

Cellules donneur (irradiées)

Cellules receveur