Techniques immunologiques A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Plan du cours Ouchterlouny...
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Techniques immunologiques
A) Propriétés du complexe anticorps/antigène
Plan du cours
Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse
Immunodiffusion
"Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot
Immunodétection
IgE: RIST et RAST
"Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs)
B) Propriétés du complémentCH50
C) Réponses lymphocytaires
Détection de complexes immuns: test au C1q
Test de lymphoprolifération aux mitogènes
Test de culture mixte
A) anticorps/antigèneImmunodiffusion
anticorps +antigène +++
anticorps++antigène ++
anticorps+++antigène +
équivalence
Précipitation
Ac polyclonal
Ac monoclonal
Visalisation sur gel(bleu de comassie)
Immunoélectophorèse
Ouchterlony
ImmunodiffusionA) anticorps/antigène
anticorps+antigène précipitation
Ouchterlony
Équivalence: précipité bleu
Sensibilité: 20-200µg/ml
Ouchterlony
• Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen)
• Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)
Ouchterlony
• Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum)
• Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer
• Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes– La bande la plus proche du puits central correspond à
l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)
Ouchterlony
• Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique
• Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité
Ouchterlony
• Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle
- F(ab)
- chains
- chains
- Fc from IgG with chains
- A mixture of heavy
and chains
- chains
Quizz: Ouchterlony
Réponses au Quizz (just for the fun)
• 1 Fab : identité partielle avec 2• 2. Chaînes
– Identité avec ligne externe de 3• 3. Mélange de chaînes et de chaînes légères
– deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon
• La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4)• L’autre ligne : la protéine la plus lourde g
• 4. Chaînes – Absence d’identité avec 5– Réaction d’identité avec une des protéines 3
• 5. Chaînes – Reconnaissance mais absence d’identité avec 4
• 6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes – Aucune reconnaissance (pas de bande)
Quizz: Ouchterlony
ImmunodiffusionA) anticorps/antigène
Immunoélectrophorèse
Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids
moléculaires très voisins)
Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par
précipitation
Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml)
Immunoélectrophorèse
Puits contenant la mixture d'Ag
Déplacement des ≠ Ag
Diffusion des Ac
Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes
DétectionImmunoglobulinesAlbumineTransferrine
Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine)
Utilisation:
Immunoélectrophorèse
Immunoglobulines
Polyclonal ou monoclonal
IgGIgM
Enzyme/Chromogène
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Radioactif
Fluorescence
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
ELISA Westernblot
Sérum Urine Surnageant de cultureEtc.
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
ELISA=
enzyme-linked immunosorbent assay
Enzyme/Chromogène
ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV
Résultat
Sensibilité: 10-1000 pg/ml
ELISA
ELISA sandwich
Ac de capture
Détection Ac
Détection Ag
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" ou d'anticorps soluble
Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel
Détection par Ac (présent dans le sérum du patient)
Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa)
Détection de Ac par un Ac marqué
Westernblot
Exemple: détection d'Ac anti-HIV
Résultat P
os
patientsNeg
Protéines HIV
Patient A: négatif
Patient B: indéterminé
Patient C: positif
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux
Immunohistochimie
Cytométrie en flux(FACS)
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules : sur coupe
Principe
indirecte
directe
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules : sur coupe
Exemple: marquage actine, tubuline et noyau
• Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules : sur coupe
Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur
Nég Pos
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules : sur coupe
Exemple: marquage Fas
NégPos
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Présence d'anticorps "anti-soi"
Sérum patient
Anticorps anti-nucléaire
Cellules test
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Présence d'anticorps "anti-soi"
Anticorps anti-nucléaire
A) anticorps/antigèneImmunodétection
"Ag" liés aux cellules en flux
Cytométrie en flux
FACS = fluorescence activated cell sorter
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Principe
indirectedirecte
Cytométrie en flux (FACS)
FACS
3000 cellules/sec
FACS
Sang
Taille
"gra
nu
losi
té"
Th
Tc
FACS Sang
Fluorescence verte
Flu
ores
cenc
e or
ange
Coupe:
Avantages et inconvénientsFacs versus coupe
Rapidité d'analyse
Multi-couleurs
Possibilité de tri
FACS:
Localisation
Interaction entre ≠ cellules
Atopie
A) anticorps/antigèneImmunodétection
IgE: RIST et RAST
A) anticorps/antigèneImmunodétection
IgE: RIST
RIST = radioimmunosorbent test
quantification des IgE totales
A) anticorps/antigèneImmunodétection
RIST = quantification des IgE totales
A) anticorps/antigèneImmunodétection
IgE: RAST
RAST = radioallergesorbent test
quantification des IgE spécifiques
A) anticorps/antigèneImmunodétection
RAST = quantification des IgE spécifiques
Le complexe C1
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Test au C1q
• La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface
A) anticorps/antigèneImmunodétection
Test au C1q
C1qComplexe immun
Ac libre
B) Propriétés du complémentCH50
Mesure l'activité fonctionnelle du complément
C3
C3b
C5-C9 Lyse de la cellule cible
Voie classiqueC1, C4, C2
Voie alterneP, C3, B, D
AmplificationP, B, D
Voie lectine complément
B) Propriétés du complémentCH50
Globule rouge sensibilisé par Ac
ComplémentSérum patient
Destruction du globule rouge
B) Propriétés du complémentCH50
Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges
ComplémentSérum patient
B) Propriétés du complémentCH50
Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)?
ComplémentSérum patient
B) Propriétés du complémentC3
C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes
Test de culture mixte (MLR)
C) Réponses lymphocytairesTest de lymphoprolifération aux mitogènes
Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à un mitogène non
spécifique?
Détection immunodéficience
Comment observer les réponses des lymphocytes T in vitro?
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
0
10
20
30
40
50
60
0 2.5 5 7.5 10
Quantité d’antigène
Rad
ioac
tivi
té
Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
0
10
20
30
40
50
60
0 2.5 5 7.5 10
Rad
ioac
tivi
té
Mitogène
Mitogène
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium
dans le DNA
Patient immunodéficient0
10
20
30
40
50
60
0 2.5 5 7.5 10
Rad
ioac
tivi
té
Mitogène
Mitogène
Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?
C) Réponses lymphocytairesCultures mixtes (MLR)?
Les lymphocytes d'un patient réagissent-elles contre les cellules du donneur ?
Greffe
Prolifération lymphocytaire
0
10
20
30
40
50
60
0 2.5 5 7.5 10
Rad
ioac
tivi
té
Cellules du donneur
0
10
20
30
40
50
60
0 2.5 5 7.5 10
Rad
ioac
tivi
té
Pas de réaction
Réaction receveur-donneur
Cellules donneur (irradiées)
Cellules receveur