Spectrométrie de Masse

Couplages CLHP-MS

UE 6 – Sciences Analytiques & Qualité

DFGSP3 2021-2022

C. PERRIN

2

A. Détection en Chromatographie

0 5 10 15 20

A

B

C

D

E

Temps

Inte

nsit

é

Amobile Astationnaire

Séparation

Détection

3

Chromatographie : Identification des composés (analyse qualitative)

0 5 10 15

20

A

B

C

D

E

Temps

Inte

nsité

Détecteurs classiques (UV)

Temps de rétention(Comparaison étalon)

Mais Des composés différents peuvent avoir des temps de rétention identiques !!

Identification pas suffisamment spécifique pour des mélanges complexes et/ou inconnus

A. Détection en Chromatographie

4

Détecteur UV à barette de diodes

Nécessité d’augmenter la spécificité de l’identification

Détecteurs + spécifiques

Chromatographie : Identification des composés (analyse qualitative)

A. Détection en Chromatographie

5

0 5 10 15

20

A

B

C

D

E

Temps

Inte

nsit

é

Mais Spectres quasi identiquespour structures proches !

Nécessité d’augmenter la spécificité de l’identification

A. Détection en Chromatographie

6

Solutions pour augmenter la spécificité de l’identification

Spectrométrie de masse

A. Détection en Chromatographie

7

Qu’est ce que la spectrométrie de masse ?

Moléculeséchantillon

IonsPhase gazeuse

Mesurem/z

Détermination de la masse moléculaire des espèces à analyser:composition, structure…..

B. Spectrométrie de masse - Généralités

8

1. Identification qualitative- analyse organique et bio-organique structurale

masse moléculaireidentification fonctions chimiques (structurale)

2.Analyse quantitative- couplage avec techniques séparatives (CPG, CLHP, Electrophorèse)

Quelles sont les utilisations de la MS ?

B. Spectrométrie de masse - Généralités

9

- Applicable à des molécules très variées (petites molécules, macromolécules…)

- Très grande sensibilité: quelques µg d’analytes suffisent (jusqu’à quelques pg)

- Identification très spécifique (MM)

- Possibilité de réactions ions molécules (études d’interactions, mécanismes dedégradation….)

Quelles sont les spécificités de la MS ?

B. Spectrométrie de masse - Généralités

10

Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules ionisées isolées

Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:

1- Volatiliser les molécules de l’échantillon

2- Ioniser les molécules de l’échantillon

3- « Trier » les ions en fonction de leurs rapports m/z et mesurer leurs abondances

MM / nb de charges (m/z)

B. Spectrométrie de masse - Généralités

11

Echantillon Source Analyseur Détecteur

Passage en phase gazeuseIonisation des molécules

Séparation des ions en fonction de m/z

Comptage des ions

Mesure de l’abondance

Traitement du signal

Spectre de masse

Vide poussé (~10-4 Pa)

Détermination m/z

B. Spectrométrie de masse - Généralités

12

Spectre de masse

L'enregistrement de l'abondance des espèces ioniques formées en fonction de leur rapport masse/charge(m/z) dans l'ordre croissant des masses

B. Spectrométrie de masse - Généralités

13

Spectre de masse

Ibuprofène MM : 206

B. Spectrométrie de masse - Généralités

14

1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative

Ibuprofène

Fragments

CH3

CH3

. m/z = 43

CH3

CH3

CH3

.

m/z = 91

CH2.

Spectre de masse

m/z = 161

z = 1

m/z = 206

MM

B. Spectrométrie de masse - Généralités

15

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

CLHP Spectromètre de masse

Introduction des composés « purs » dans le MS

Obtention de pics de forme symétrique= dimensions d’aires (ou hauteur)

précises

Analyse quantitative

Identification par le poids moléculaire

Information sur la structure des composés

Développement de méthode + rapide

Limite de détection : 20 à 50 pg

Séparation + Détection ultra spécifique

16

• Les composés sont séparés les uns des autres au cours de l’analyse chromatographique

• Les composés élués de la colonne pénètrent directement dans la source d’unspectromètre de masse où ils ont ionisés.

•Le balayage de la gamme de masse est répété durant le temps d’élution des composés.

•Les spectres de masse complets de tous les composés sont obtenus.

Principe

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

17

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

18

Somme des abondances quelque soit m/z = f(temps)

TIC: Total Ionic Current

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

19

Obtention d’un spectre de masse pour un temps de rétention donné

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

20

NN

N

N

NO

O

OH

100 200 300 400 500m/z

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

402

386

100 200 300 400 500m/z

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

402

386

9 10 11 12 13 14 15 16

Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

11.62

13.84

13.16

14.40

12.1310.45

15.45

9 10 11 12 13 14 15 16

Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

11.62

13.84

13.16

14.40

12.1310.45

15.45

NN

N

N

NO

O

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

21

TIC

Selected Ion Monitoring (SIM)

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

• Différents modes de détection

22

TIC

SIM

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

23

CLHP

- Extraction de l’analyte du solvant- Ionisation des molécules en phase gazeuse- Transfert Pression Atmosphérique Vide

DétectionMS

Propriétés:- Transmettre quantitativement les composés à analyser- Ne pas dégrader les molécules- Ne pas altérer la séparation chromatographique

Interface/Source d’ionisation

Vide poussé

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

24

Mode d’ionisation privilégié en CLHP-MS

Analytes élués en phase liquide à pression atmosphérique

Source d’ionisation à pression atmosphérique

Electrospray(ESI)

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

25

Interface Electrospray (ESI)

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

26

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

27

Electrospray

• Formation d’ions pseudo-moléculaires ou d’adduits

[M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+

M/Z2 M/Z1

Déconvolution(Algorithme)

MM

• Formation d’ions multichargés pour les molécules possédant plusieurs sites basiques ou acides

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

28

Spectre ESI sulfaméthazine (MM 278)

cf TD

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

29

Spectre ESI de la Trypsinogène (MW 23983)

1599.8

1499.9

1714.1

1845.91411.9

1999.6

2181.6

M + 15 H+

M + 13 H+

M + 14 H+M + 16 H+

m/z Mass-to-charge ratio

cf TD

C. Couplage Chromatographie Liquide - MS

30

D. Applications du couplage CLHP-MS

Mélange d’aflatoxines

31

Mélange de benzodiazépines

D. Applications du couplage CLHP-MS

32Produits de dégradation du salbutamol

D. Applications du couplage CLHP-MS

SIM

33

Identification protéines

SEC-UV-MS

D. Applications du couplage CLHP-MS

34

Analyse d’aggrégats

SEC-UV-MS

MyoglobineMonomère

D. Applications du couplage CLHP-MS

35

Identification protéines

Spectres de masse

Myoglobine

1

2

16 951

16 95133 986

D. Applications du couplage CLHP-MS

36

E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS

Obtention d’information structurale en CLHP-MS (fragmentation)

Modifier le potentiel du cône d’échantillonnage

Ions + Gaz MS

Ions

Cône d’éch.

Tous les ions présents dans la sourceseront fragmentés.Obtention de spectres complexes !

Spectrométrie de masse en tandem (MS-MS)

MS 1 MS 2 MS 3

Fragmentation d’ions sélectionnés

37

Spectrométrie de masse en tandem

E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS

38

Isolement m/z 194,0495

Fragmentation

E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS

MM: 195 g/mol

MM: 193 g/mol

39

E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS