Physiopathologie du cœur embryonnaire

soumis à l’anoxie-réoxygénation:

Rôle protecteur du NO et des canaux KATP

Alexandre Sarre

Directeur de thèse: Dr Eric Raddatz

Thèse de doctorat es Sciences de la Vie

réalisée au Département de Physiologie

Introduction

Au cours du développement embryonnaire…

Le cœur est le premier organe à assumer sa fonction définitive:

se contracter rythmiquement…

Afin d’apporter des nutriments

et de l’oxygène à l’embryon.

L’embryon et le fœtus se développent

dans un environnement naturellement

pauvre en oxygène. Cependant, toute diminution de la

concentration en oxygène (hypoxie)

perturbe le fonctionnement cardiaque et

le développement de l’embryon.

C’est par exemple le cas lors d’un

dysfonctionnement du placenta ou de

torsion du cordon ombilical.

Cette adaptation peut avoir des

répercutions à l’âge adulte (mémoire

fœtale):

maladies cardiovasculaires (infarctus,

hypertension)

syndromes métaboliques (diabète…)

De plus, la cardiologie et la chirurgie

fœtale sont en plein essor.

Il est donc important de comprendre

les mécanismes cellulaires impliqués

dans la pathologie du cœur immature.

Modèle expérimental

embryon de poulet96h; stade 24HH

in ovo

modèle expérimental

4mm

embryon de poulet96h; stade 24HH

in ovo dissection

cœur isoléspontanément contractile

1 cm

in vitro

ECGactivité contractile

production ROS/RNS

1cm1mm

modèle expérimental

4mm

cœurélectrodes

Chambre de culture

normoxie (21% O2) réoxygénation (21% O2)anoxie (0% O2)

Protocole expérimental

45 min 30 min 60 min

membrane transparente en silicone (échanges gazeux)

cœur battant spontanément

MILIEU

GAZ (AIR, N2, CO2)

37°C

(HCO3-/CO2)

± agents pharmacologiques

QRS

P

OV

V

100 ms

ECG

contractionauriculaire

contractionventriculaire

T

500 mV

5 µm

10 µm

EMDa

EMDv

OG

V

CT

1 mm

électrodes ECG

mesure photométriquede la contraction

OD

Mesure de l’activité électrique et mécanique

MILIEU

AIR, N2

37°C

Mesure de la production radicalaire par la technique du DCFH

cœur isolé

+ DCFH 10 µM

excitation490 nm

émission530 nm

OCT

V

1mm

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 30 60 90 120

temps in vitro (min)

21% O2 21% O2N2

normoxie anoxie réoxygénation

fluore

s cence

(u.a

. )

Profil temporel de production de ROS/RNS

mesure continue de la fluorescence du DCFHéchantillonage: toutes les 30s; déterminée sur une aire de 0.07 mm2

Résultats

PACEMAKER: rythme sinusal 165 ±

9 bpmDUREE DU POTENTIEL D’ACTION:

durée du QT (cœur entier) 161 ± 14 msoreillette isolée 78 ± 6 msventricule isolé (QT) 111 ± 7 ms

CONDUCTION AURICULO-VENTRICULAIRE:intervalle PR 130 ± 17 msdélai mécanique AV 150 ± 17 msvitesse de propagation AV 15,7 ± 1

mm/sCOUPLAGE EXCITATION-CONTRACTION:

délai électro-mécanique auriculaire (EMDa) 21 ± 2 ms

délai électro-mécanique ventriculaire (EMDv) 14 ± 2 msCONTRACTILITE:

contraction ventriculaire (apex) 19 ± 7 µm vitesse de contraction (apex) 4,2 ±

1,4 mm/sMETABOLISME:

glycogène / protéine: - oreillette 1,63 ± 0,72

(nmol GU / mg) - ventricule 0,90 ± 0,28

- conotroncus 0,65 ± 0,25

Paramétres in vitro en normoxie

moyenne ± DS; n=8-10

Normoxie

Anoxie

Réoxygénation

100 ms

PQRS T

30 min

Evolution de l’ECG au cours de l’anoxie-réoxygénation

intervalle PR (ms)

fréquence cardiaque (bpm)

100

140

180

220

260

***

50

100

150

200

250

**

EMD (% préanoxique)

T / QRS

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130temps in vitro (min)

0.2

0.4

0.6

0.8

****

*

50100150200250300

**

*

* **

*********

*

oreilletteventricule

contraction ventriculaire (% préanoxique)

0

40

80

120

160

***** * * *

L’activité cardiaque est rapidement altérée par l’A/R

moyenne ± ESM; n=4; *:p<0,05 vs préanoxique

durée du QT (ms)

140

165

190

215

240

****

*

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130temps in vitro (min)

ANOXIE REOXYGENATION ANOXIE REOXYGENATION

bloc AV 2/1 (anoxie et réox)

100 ms

QRS QRS QRS

P P P P P P

échappement ventriculaire (réox)P P P P P P P P P P PP P P P P

QRS QRS QRS QRS

1s

L’anoxie et la réoxygénation entraînent de nombreuses arythmiesbloc AV 3/1 (anoxie et réox)

QRS QRSQRS

P P P P P PP P P

400 ms

PPP P P P P P P P PPP Wenckebach (réox)

1s

5 s

cardioplégie cardioplégie

O

V

ECG200 µV

5 µm

0.5 µm

O

V

ECG500 µV

0.5 µm

1 µm

bloc AV(3ème degré)

bloc AV(3ème degré)

10 s

et des bouffées d’activité.

aucune fibrillationaucune extrasystole ventriculaireaucune dissociation électromécanique

arythmies durant l’anoxie

tachycardie sinusale

bradycardie sinusale

arrêts sinoauriculairesintermittents (bursts)

arythmies auriculaires

bloc AV 3ème degré (intermittent)

block AV 3/1

block AV 2/1

5 1510 3020 250min

10 3020 40 500min

cardioplégie

bradycardie sinusale

arrêts sinoauriculairesintermittents (bursts)

atrial arrhythmias

bloc AV 3ème degré (intermittent)

block AV 3/1, 3/2

block AV 2/1

Wenckebach

échappement ventriculaire

arythmies durant la réoxygénationLes arythmies apparaissent selon un ordre particulier

Conclusion 1

• L’ECG embryonnaire ressemble à celui de l’adulte.

• Le cœur embryonnaire répond rapidement et de manière réversible à l’anoxie.

• L’oreillette est plus résistante à l’anoxie-réoxygénation que les autres parties du cœur (A>V >CT).

• Les arythmies ressemblent à celles du myocarde adulte défaillant.

Leur origine est essentiellement auriculaire.

Protection contre les dommages liés à l’ischémie-reperfusion

- Reperfusion contrôlée

- Antioxydants (piégeurs de ROS/RNS)

- Inhibition d’échangeurs de cations (NHE) ou d’anion (HCO3)

- Antagonistes des canaux calciques

(réduction de la surcharge en Ca2+)

- Activation des canaux KATP mitochondriaux- Préconditionnement ischémique:

courtes périodes d’ischémie (protection précoce ou tardive)

- Préconditionnement non-ischémique:

pharmacologique (NO, adénosine, bradykinine…)

pacing à fréquence physiologique

sarc-KATP

mito-KATP PTP

UCP

ROS

pace maker?

contractilité?

CICR(L-type Ca++, RyR)

couplage E-Cconduction

GAP(Cx43)

? ?

PKC

NOS

NO

mitochondriem.i.

m.e.

-180 mV

mito-KATP

∆ ROS

∆ volume

∆ Ψ

∆ ATP

∆ Ca2+

sarcKATP

∆ Vm

sarcolemme

Modulation pharmacologique des canaux KATP

mitochondriaux et sarcoplasmiques

diazoxide(50 µM)

5-hydroxydecanoate(500 µM)

glibenclamide(1 µM)

moyenne ± DS; *:P<0,01vs contrôle DMSO, #:P<0,01 vs DIAZO (test t de Student)

L’activation des canaux mitoKATP augmente la production de ROS à la réoxygénation, exclusivement

PREANOXIE

REOXYGENATION2

∆ fl

uore

scen

ce (

a.u

./se

c)x1

0-3

0

0.5

1

1.5

0.5

0contrôle

DMSO

7

DIAZO

*

7

DIAZO +5-HD

#

7

non-traité 5-HD

6 5

GLIB

4

150

250

350

450

50

délai électro-

mécaniqueventriculaire

(% préanoxique)

L’activation des canaux mitoKATP accélère la récupérationpostanoxique du couplage excitation-contraction.

moyenne ± ESM*: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+5-HDANOVA mesures répétées

Contrôle DMSO (7)DIAZO (7)DIAZO+5-HD (5)

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)

0

100

200

300

400

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)

Contrôle (6)5-HD (5)

GLIB (4)

*

ANOXIE REOXYGENATION

conduction

5-HD,glibenclamidediazoxide

pace making contractility+

conduction

mito-KATP

ROSMPG 1mM

E-C coupling

CICR(L-type Ca++, RyR)

E-C coupling

GAP(Cx43)sarc-KATP

moyenne ± DS;*:P<0,01vs contrôleDMSO, #:P<0,01 vs DIAZO (test t de Student)

Le MPG abolit la production de ROS induite par le DIAZO

0

0.5

1

1.5

2

contrôle DMSO DIAZO DIAZO+MPG

0

0.5

*

#

PREANOXIE

REOXYGENATION

∆ fl

uore

scen

ce (

a.u

./se

c) x

10

-3

7 7 4

moyenne ± ESM;*: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+MPGANOVA mesures répétées

Le MPG abolit la protection du couplage E-Capportée par l’activation des canaux mitoKATP

délai électro-

mécaniqueventriculaire

(% préanoxique)

Contrôle DMSO (7)

DIAZO (7)

100

150

200

250

300

350

400

450

50 *

ANOXIE REOXYGENATION

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)

DIAZO+MPG (4)

mito-KATP

conduction

GAP

5-HD,glibenclamidediazoxide

sarc-KATP

contractilitypace making+

ROS

CICR(L-type Ca++, RyR)

E-C couplingconduction

GAP(Cx43)

chelerythrine5M

PKC

moyenne±DS; *:P<0,01vs contrôleDMSO (test t de Student)

L’inhibition des PKC ne modifie pas la production de ROSinduite par DIAZO

0

0.5

0

0.5

1

1.5

2

control DMSO DIAZO DIAZO+CHEL

*

*

PREANOXIE

REOXYGENATION

∆ fl

uore

scen

ce (

a.u

./se

c) x

10

-3

7 7 6

ANOXIE REOXYGENATION

L’inhibition des PKC abolit la protection du couplage E-Capportée par l’activation des canaux mitoKATP.

moyenne ± ESM*: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+CHELANOVA mesures répétées

délai électro-

mécaniqueventriculaire

(% préanoxique)

100

150

200

250

300

350

400

450

50

Contrôle DMSO (7)

DIAZO (7)

*

DIAZO+CHEL (4)

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)

conduction

GAPsarc-KATP

contractilitypace making

GAP(Cx43)

mito-KATP

5-HD,glibenclamidediazoxide

+

ROS

PKC

NOS

NO

L-NAME50µM

CICR(L-type Ca++, RyR)

E-C coupling

moyenne ± DS;*:P<0.01vs control DMSO, #:P<0.01 vs DIAZO (test t de Student)

L’inhibition des NOS abolit la production de ROS induite par DIAZO

0

0.5

PREANOXIE

∆ fl

uore

scen

ce (

a.u

./se

c) x

10

-3

0

0.5

1

1.5

2

contrôle DMSO DIAZO

*REOXYGENATION

DIAZO+L-NAME

#

7 7 5

délai électro-

mécaniqueventriculaire

(% préanoxique)

L’inhibition des NOS abolit la protection du couplage E-Cpar diazoxide.

moyenne ± SEM*: P<0.01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+L-NAMEANOVA mesures répétées

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)

100

150

200

250

300

350

400

450

50

Contrôle DMSO (7)

DIAZO (7)

*

ANOXIE REOXYGENATION

DIAZO+L-NAME (5)

Conclusion 2

Dans le modèle du cœur embryonnaire/fœtal, l’ouverture des canaux mitoKATP améliore la récupération post-anoxique du couplage excitation-contraction ventriculaire exclusivement.

Cette protection est liée à une augmentation de la production de ROS induite par l’ouverture des canaux mitoKATP et à l’activation consécutive des PKC. Le NO semble être indispensable à cette protection.

PKC ROS

couplage E-C

SRRyR

L-type Ca++

CHELMPG

mitoKATP

NOSmt

NO

MYXO

L-NAME

IV

III

II

I

m.i.m.o.

NOS NO

L-NAME

DIAZO

5-HD

conduction

DIAZO

?

m.s.

Cx

gap j. MAPK:JNK, ERK, p38

profil spatiotemporeld’activation (O,V,CT): - activité Kinase - Immunoblotting WB - Immunohistochimie

MPTP

UCP

REMERCIEMENTS

Eric Raddatz

Pavel KuceraNorbert Lange

Stéphany Gardier

Christophe BonnyFabienne Maurer

André Singy

Christian Haeberli

Anne-Catherine Thomas

Tout le personnel du Département de Physiologie

et du Département de Génétique Médicale

Mes amis

Mes parents

Et Esther.

05

10152025303540

Température (°C)

50150250350450550

PR interval (ms)

2060

100140180220

Heart Rate (bpm)

100200300400500600

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Time in vitro (min)

QT duration (ms)

0 30 60 90 120 150 180time in vitro (min)stabilization

25°C 37°C

15

25

35

45 ventricular shortening

mm

5

15

25 ventricular EMD

ms

10

20

30atrial EMD

ms

100

140

180 QT duration

ms

100

120

140

160PR interval

ms

120

140

160

180heart rate

bp

m

0 30 60 90 120 150 180time in vitro (min)

25°C 37°C

Les paramètres fonctionnels sont stables 3h in vitro

La mitochondrie représente la source principale de ROS

mitochondrie

chaîne respiratoire

NO .

(IV) (III) (II) (I)

H2O2. -O2

O2O2

H2O

O2

O2

mtNOS

réticulum endoplasmique(microsomes; cyt p450)

. -O2

NAD(P)H-oxydasesNox 1-5

. -O2

H-W : H2O2

.OH. -O2

+ Fe2+

cascade AA . -O2

(cyclo-, lipoxygénases)

. -O2

NOSNO .

(peroxynitrite)ONOO-

peroxysomes O2 ; H2O2

sources extra-mitochondriales

. -

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Temps in vitro (min)

Flu

ore

scen

ce D

CFH

(u

.a.)

30 60 90 120

La fluorescence du DCFH est dépendante de la pO2

0% O2

21% O2

98% O2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1800 3600 5400 7200Temps (min)

? F

luore

scen

ce (

u.a

)O2 21% N2 98% Réoxygénation

O2 98%

O2 21%

L’hyperoxie augmente la production radicalaire à la réoxygénation(DCFH 10µM)

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135

Time in vitro (min)

DC

F fl

uore

scence

inte

nsi

ty (

a.u

.)

ANOXIAa

b

c

metabolicstabilization

Sarre et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 288; 2005

PREANOXIE

REOXYGENATION

00.2

0.4

0

0.2

0.4

0.60.8

1.0

1.2

1.4

1.6

contrôle myxo

La mitochondrie est la source principale de ROS dans le myocarde immature à la

réoxygènation

∆ fl

uore

scen

ce (

u.a

./se

c) x

10

-3

*

moyenne ± DS; contrôle n=6, myxo n=6; *: p<0.05 vs control

moyenne ± DS; *:P<0.01vs control (Student t-test)

PREANOXIE

REOXYGENATION

∆ fl

uore

scen

ce (

a.u

./se

c) x

10

-3

Sources intracellulaires de ROS

0

0.5

contrôle Myxo10 µM

DPI10 µM

L-NAME50µM

*

*0

0.5

1

1.5

MPG1mM

Apocynine1mM

*

*

7 6 5 4 25

air/N2/O2air/N2/air0

0,5

1

1,5

2

∆ fl

uore

scence

(u.a

./s)

x10

-3

production de ROS/RNS à la réoxygénation

La production de ROS/RNS à la réoxygénation dépend de la pO2.

*

moyenne ± DS*: p<0,05

6 3

Curtin JF (J Immunol. Meth; 2002)

97.4

66.2

45

31

21.5

14.4

kDa

nitratedBSA

nitrateddimer SOD

nitratedSOD

positiv

e co

ntro

l

nega

tive

cont

rol (

BSA)

fres

h he

art

150

min

O2 +

NO d

onor

Air-N

2-O

2

Air-N

2-O

2+ L

-NIO

30 min

98% O221% O2 N2normoxia anoxia reoxygenation

100

0

200

ph

oto

ns /

s

5 10152025 300

255075

100

( stage 24HH; ED4; n= 6; glucose 8mM )

fréquencedes

arythmies ( % )

Le pic de ROS à la réoxygénation est associé auxarythmies auriculaires et ventriculaires

min

ECG

oreillette

ventricule

100ms

norm reox

lucigenin-enhanced chemiluminescence (CL)

Le MPG réduit la tachycardie transitoire à la réoxygénation

ANOXIA REOXYGENATION

0

20

40

60

80

100

120

140

160

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Temps in vitro (min)F

réq

uen

ce c

ard

iaq

ue (

% p

réanoxiq

ue)

Contrôle (6)

MPG (4)

0

100

200

300

400

500

600

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

EMDv ED4 (4)

EMDv ED4.5 (8)

EMDa ED4 (4)

EMDa ED4.5 (8)

Le couplage E-C est affecté de la même manière par l’anoxie et la réoxygénation aux

stades 4j et 4,5j.%

pré

an

oxiq

ue

control (6)

5-HD(5)

L-NAME (4)

MPG (4)

vehicle(7)

DIAZO (7)

DIAZO+5-HD

(5)

DIAZO+MPG

(4)

DIAZO+CHEL

(5)

DIAZO+L-NAME

(5)CHEL (4)

GLIB (4)

heart rate (bpm)

151±24 160±8 162±12 132±5 168±12177±3

4175±3

2146±2

3144±7 161±13

164±13

195±38

PR interval (ms)

133±25 134±28 145±20 129±19 122±6118±1

5137±2

2144±3

1142±1

0125±25

134±26

146±17

mechanical AV delay (ms)

143±26 141±28 159±19 140±13 130±13126±1

4144±2

7151±3

2158±7 139±28

146±25

162±29

EMDa (ms)

16±4 14±3 18±3 16±3 13±2 13±4 15±3 15± 4 14±2 21±7 15±0 21±2

EMDv(ms)

10±3 7±3 13±3 10±4 10±2 12±5 10±2 8±3 12±6 12±3 13±4 13±3

ventricular shortening

(m)22±21 27±16 7±3 13±7 28±21 28±22 28±24 9±3 7±4 17±12 8±5 8±3

ventricular shortening

velocity (mm/s)1.5±1.3 1.4±0.6 0.6±0.3 0.9±0.4 2.1±1.6

2.0±1.5

1.9±1.6

0.7±0.2

0.5±0.2

0.3±0.20.6±0.

30.6±0.2

délai électromécanique auriculaire (ms)

5

10

15

20

25

30

35

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

ANOXIA REOXYGENATION

untreated (6)

5-HD (5)

glib (4)

5

10

15

20

25

30

35

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

ANOXIA REOXYGENATION

control DMSO (7)

DIAZO (7)

0

20

40

60

80

100

120

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Time in vitro (min)

0

20

40

60

80

100

120

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Time in vitro (min)

incidence des arythmies (% de cœurs arythmiques)

moyenne±ESM

fréquence cardiaque (bpm)

untreated (6)

5-HD (5)

glib (4)

ANOXIE REOXYGENATION

*

0

20

40

60

80

100

120

140

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Time in vitro (min)

contraction ventriculaire (% préanoxique)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Time in vitro (min)

4

*50

100

150

200

250

300 ANOXIE REOXYGENATION

control DMSO (7)

DIAZO (7)

moyenne±SEM; *: P<0.05 glib vs. DMSO (ANOVA repeated measures)

Effets de l’activation des canaux mitoKATP

- entrée K+ + H2O -> gonflement de la matrice -> réduction de l’espace intermembranaire => améliore l’association CK et ANT- compensation de l’augmentation de l’espace intermembranaire provoquée par l’ischémie- augmentation de ROS => oscillations de potentiel et production ROS => ROS-induced ROS release- diminuton de ROS durant l’ischémie et augmentation à la reperfusion- augmentation de ROS -> activation de PLC, PKC, TK- amélioration de larespiration- augmentation de la synthèse et la concentration en ATP - dépolarisation de la membrane mitochondriale- réduction de la surcharge Ca++

- découplage modéré -> réduction deROS durant la reperfusion ?- alcalinisation de la matrice (∆pH)

Diazoxide abolit l’activation de JNK.Cet effet n’est pas abolit par les 5-HD ou le MPG.

diazoxide

DMSO

ANOXIE REOXYGENATION

Stab 10 20 30 10 20 30 40 50 60

phospho-cJun

moyenne ± DS(n=3-8)*p<0.05 vs Stab; §:p<0.05 vs DMSO(test t de Student)

0

1

2

3

4

5

6

Fois

Stab 10 20 30 10 20 30 40 50 60 min

ANOXIE REOXYGENATION

DIAZO + 5-HD

DIAZO + MPG

**

La phosphorylation de p38 est augmentée par l’A/R. Diazoxide augmente la phosphorylation de p38.

Stab 10 20 30 10 20 30 40 50 60

phospho-p38

total-p38

ANOXIA REOXYGENATION

0

2

4

6

8

10

12

14

fois

Stab 10 20 30 10 20 30 40 50 60 min

moyenne±ESM (n=3)ANOXIE REOXYGENATION

diazoxide

vehicle

PKC

TRAF 6-2

TAK 1 - ASK 1

MKK 3-6

p38/RK

MBPSAP 1

Raf

Ras Cdc42 - Rac - Rho

MEK 1-2

ERK 1-2

c fos MAPKAPK2elk 1

MSK 1

PAK 1

MEKK 1

MKK 7

JNK 1-2

c-junelk 1

MKK 4

JAK 1-2

STAT 1-3

IBNFB

RCPGRTK

Expression génique

KATP

IKK

Ischémie

BradykinineAdénosineOpioïdes

PLCPLD

ROS

IP3

NO

ONOO-

p47 phox

NADPHoxydase

H+

NHE-1

Na+

P

NCX

3 Na+ Ca2+