Méthodes de détection des mutations connues et inconnues

COUTTON Charles

EC Génétique

09/02/2011

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Clinique non évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Criblage du gène

DDGE, HPLCHRM

Inno-LIPASéquençage

Mutation ciblée

(ex: familiale)

Screening large

1. Caryotype2. MLPA

3. CGH-array4. Séquençage HD ?Etude de liaison

PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS

Caryotypeet/ou FISHet/ou MLPA

si (-)

si (-)

si (-)

si (-)

Stratégie Générale

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Criblage du gène

Mutation ciblée

(ex: familiale)

Suspicion mucoviscidose

Mutation ∆F508 dans la mucoviscidose

⇒ délétion de 3 paires de bases dans l’exon 10 du gène CFTR

responsable de la mucoviscidose.⇒70% des mutations

PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS

MUCOVISCIDOSE� Pathologie généralisée des glandes exocrines

séreuses et à sécrétion muqueuse : accumulation

d'épaisses sécrétions dans les voies

respiratoires et digestives

� Fréquence : 1/2500

� Grande variabilité d'expression

� Traitements symptomatiques

� Gène : 7q31.2 - 27 exons - 230 Kb

� Protéine: CFTR (Cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator)

� Régule les flux d'eau et de sel au travers des

membranes cellulaires (canal chlore)

� Test de la sueur : dosage du Cl- de la sueur

(augmentation)

� Mutations : > 1000

� ∆F508 (F508del) = 70 % des mutations

� 7 - 8 mutations fréquentes (G542X, N1303K,…)

� Possibilité d’hétérozygote composite

� Variations régionales ou ethniques

� Certaines mutations : absence bilatérale des canaux déférents

Classe V : défaut d’abondance (épissage incorrect)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Dénaturation

Hybridation

Elongation

Cycle répété n fois

Nb de copies final = 2n

PCR-RFLP (Restriction fragment Length Polymorphism)

PCR ARMSPCR spécifiques d’allèles

1 amorce commune (COM)

• • • • •+

• • • • • •A • • • • • • • • • • • • • • • Allèle 1 (n)• • • • • • C • • • • • • • • • • • • • • • Allèle 2 (m)

5’ • • • • • A 3’ Amorce spécifique de l’allèle 1 (ASPn)

5’ • • • • • C 3’ Amorce spécifique de l’allèle 2 (ASPm)

Hom (n) HétHom (m)

Construction d’amorces

PCR avec ASPn ou ASPm + COM

Possibilités :

- Réactions multiplex

- Introduction d’un site de restriction

3’

Evaluation de la fluorescence en temps réel

PCR temps réelHybridation d’une sonde fluorescente spécifique

Possibilité de quantifier

Détection de mutation ponctuelle

Sondes spécifiques d’allèles

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Criblage du gène

Mutation ciblée

(ex: familiale)

Suspicion mucoviscidose

DDGE, HPLCHRM

Inno-LIPASéquençage

PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS

Peu coûteux

Très sensible >95%

Applications :

Détection mutations inconnues

Etude de polymorphisme

Inconvénients :

Demande une analyse informatique de chaque région

Taille limite : 500 pb

Allèlemuté Formation des

hétéroduplex :dénaturation (95°C) puis

renaturation lenteCA G TGC ATAT GC+

Hétéroduplex HomoduplexAllèlenormal

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)= Electrophorèse en gradient dénaturant

Homoz

ygote

sain

Hétéro

zygo

te

Homoz

ygote

muté

Sen

s de

mig

ratio

n

Gra

dien

t dén

atur

ant (

urée

)

HRMHigh resolution melting

HRMHigh resolution melting

HRMHigh resolution melting

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Criblage du gène

Mutation ciblée

(ex: familiale)

Suspicion mucoviscidose

DDGE, HPLCHRM

Inno-LIPASéquençage

PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS

InnoLipa

InnoLipa

Sondes mutées

Sondes sauvages

Homozygote Hétérozygote

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Criblage du gène

Mutation ciblée

(ex: familiale)

Suspicion mucoviscidose

DDGE, HPLCHRM

Inno-LIPASéquençage

PCR-RFLPPCR temps réelPCR ARMS

Séquençage classique

Séquençage classique

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Caryotypeet/ou FISHet/ou MLPA

Syndrome de DiGeorge

Clinique non évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Screening large

Recherche X fragile et

1. Caryotype2. MLPA

3. CGH-array4. Séquençage HD ?

Maladie non spécifique

RM isolé

• Première cause de retard mental héritédans l’espèce humaine

• 1/4000 hommes et 1/6000 filles

• 2-3% des RM / 15-20% des RMLX

• Fragilité du chromosome X

• Découverte du mécanisme moléculaire: pathologies liées à une expansioninstable de triplets nucléotidiques

Maladies à tripletsExemple de l’X fragile

� Chez les garçons:� Retard mental

� constant: 90% QI entre 20 et 60� Troubles du comportement� Troubles du langage

� Syndrome convulsif� Dysmorphie faciale

� Visage allongé� Oreilles grandes et décollées

� Macro-orchidie

� Chez les filles:� 50% des filles malades� Tableau clinique + modéré� RM léger

X fragile

• Site fragile Xq27.3 (FRAXA)

Site fragile Xq28 surle chromosome X au

ME

Mise en évidence sur milieu pauvre en folatesRetrouvé chez l’homme et la majorité des femmes atteintesLe plus souvent absent chez les femmes conductrices et les hommes normaux transmetteurs

Résultats inconstants

Risque erreur en DPN

• 1991 clonage moléculaire du locus X fragile

� Mutation dynamique : Expansion instable d’une répétition CGG dans le 1er exon du gène FMR1

� Code une protéine FMRP 70 kDa

� Expression ubiquitaire chez le fœtus, puis prédominance dans le cerveau et les testicules

� Dans le cytoplasme et les dendrites des neurones +++

� Rôle : régulation du transport intracellulaire de ARNmimpliqués dans la fonction synaptique et synthèseprotéique

FMR1

FMR1

� Homme transmetteurnormaux

� Femmes conductrices� Enfants des hommes normaux transmetteur (NTM) jamaisaffectés.

� Petits enfants affectés (par la fille)

⇒ Paradoxe de Sherman⇒ Phénomène d’anticipation = aggravation au fil des générations

Transmission

� 5 à 50 répétitions : NORMALStable lors de la transmission à la génération suivantePhénotype normal

� 50 à 200 répétitions : PREMUTATIONHomme transmetteur sainInstable à la méiose féminine: amplification du nombre de

triplets lors de la transmission à la génération suivante. Risque de passage à la mutation complète.

Phénotype «normal»

� > 200 répétitions : MUTATION COMPLETEHyperméthylation régions flanquantes 5’ FMR1Pas de messager, pas de protéineInstable somatique et méiose fémininePhénotype anormal chez 100% des garçons et 50% des filles

Transmission

� Une femme prémutée transmet avec un risque de 50% l’X prémuté qui: � soit restera à l’état de prémutation (mais taille + grande)� soit passera à la mutation complète� avec un risque variable qui dépend de la taille de la

prémutation

� Le passage de la prémutation à la mutation complète survient obligatoirement lors de la transmission par une femme

� Un homme prémuté transmet � Toujours la prémutation� Aucun risque pour ses fils� Transmet la prémutation à toutes ses filles

Diagnostic

� PCR du triplet répété CGGn possible jusqu’à 55 répétitions(« seuil normal »).

- Si > 55: PCR moins efficace (pb polymérase). � Méthode de Southern pour détecter les patients porteurs

d’une prémutation ou d’une mutation complète X fragile et déterminer le statut de méthylation

� Patient atteint de retard mental: 1. PCR:

� permet de reconnaitre tous les garçons non atteints� 65% des filles non atteintes

2. Southern blot: � une pré mutation ou une mutation chez un patient � ou un profil de restriction normal chez les 35% de filles

non atteintes mais non distinguables des filles atteintes par la PCR.

Diagnostic

30 CGG

34 CGG

37 CGG

Femme N

Femme N ?

Garçon N

34 CGG

Garçon préou muté?

Diagnostic

• Southern blot

Dans 10 à 15% des cas coexistent la mutation mutée et prémutée

Diagnostic

Diagnostic

Clinique non évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Screening large

Recherche X fragile et

1. Caryotype2. MLPA

3. CGH-array4. Séquençage HD ?

Maladie non spécifique

RM isolé

Séquençage haut-débit

� Séquenceurs nouvelles génération

� Séquençage d’un grand nombre de fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)

� Séquences générées alignées sur séquence de référence

� Application en cancéro / constitutionnel

� Efficacité validée

� Niveau de résolution meilleure que puces

Séquençage haut-débit

Séquençage haut-débit

Séquençage haut-débit

� Limites� Coût exorbitant

� Qualité de l’ADN dépendant

� Position (intron) et nature (duplication) des mutations

� Gestion des données(bioinformatique)

� Ethique

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Clinique non évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Screening large

1. Caryotype2. MLPA

3. CGH-array4. Séquençage HD ?

Etude de liaisonEtude d’homozygotie

si (-)

Maladie cliniquement caractérisée ou non et génétiquement inconnue

si (-)

Etude de liaison

� Analyse indirecte

� Etude de liaisons des marqueurs intra ou juxta-géniques = microsatellites

� Permet de poser un diagnostic sans connaître le gène et/ou la mutation responsable

Il s'agit de séquences d'ADN constituées de motifs répétés avec 2, 3 ou 4 nucléotides :

nnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnnn

nnnnnnGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTnnnnnnnn

nnnnnnATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGnnnnn

nb variable de répétitions

Les microsatellites

nb variable de répétitions

nb variable de répétitions

Etude de liaison

Allèle paternelle

…nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn……nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn…

Allèle maternelle

…nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn……nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn…

9 répétitions (CA)

13 répétitions (CA)

Les microsatellites

Etude de liaison

Etude de liaison

Clinique évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Clinique non évocatrice d’une pathologie ou

syndrome

Génique Chromosomique

Gène identifié Gène inconnu

Screening large

1. Caryotype2. MLPA

3. CGH-array4. Séquençage HD ?

Etude de liaisonEtude d’homozygotie

si (-)

Maladie cliniquement caractérisée ou non et génétiquement inconnue

si (-)

Identification des gènes

� Rôle de CGH-array et du séquençage HD +++ (↑ 80% en 4 ans)

Augmentation des gènes identifiées ces dernières années liées àl’émergence des nouvelles techniques

Stratégies d’identification des gènes candidats

� L’approche par séquençage haut débit de tous les gènes du génome

� Approche gènes candidats� Lieu de l’expression des protéines� Gènes paralogues de gènes connus (ex NLGN4 et NLGN3)

� Gènes codant pour des protéines qui interagissent avec des protéines impliquées dans maladies

� L’identification d’une anomalie chromosomique comme une translocation réciproque ou un remaniement cryptique� CGH-array / FISH / MLPA / caryotype…

� Approche globale (carte d’homozygotie)

Microduplication en Xp11.22

Microduplication en Xp11.22

Les polymorphismes sont répartis sur la totalité du génome. L’étude de la ségrégation de polymorphismes sur de larges fragments chromosomiques permet de définir des haplotypes (code barre des chromosome).

Chr 1Microsatelites

(nb de répétitions CA)

a

baa

aa

a

aba

ba

Chr 1SNPs : Single nucleotide

polymorphismS

Approches globales

28

41073

23

4677

a

baa

a

a

aba

a

Famille consanguine

48543

23477

16453

43723

M

23477

43723

M

23477

16453

M

7M M

23477

23477

23477

23477

16453

MMM M

Effet fondateur

MGénération 1X X X

Génération 2

Génération 3

Génération n

En pratique : Recombinaisons

Prophase méiose I: Recombinaison

des chromosomes homologues

Famille consanguine

48543

23477

M

M M

Grand parents

Parents

Fils (cas index)

Méiose 1

Méiose 3

Méiose 2

Région d’homozygotie

M

Effet fondateur

48543

23477

MM

Méiose 1Génération 2

Génération n

Méiose 2

Méiose 3

Méiose 4

Méiose n

On étudie les polymorphismes (code barre) sur tout le génome afin de retrouver une région d’homozygotie

Affymetrix : 250000 SNPs

Single NucleotidePolymorphisms(SNPs)

a

Chr 1

gatggactg

pat mat

ABI- LMS 400

Microsatellites(répétitions CA)

105

158

Chr 1

891710

12 11

pat mat

Cartographie d’homozygotie

P1P2P3P4P5P6P7P8P9

Région minimale ?

Cartographie d’homozygotie