Médecine régénérative : cellules souchesMédecine régénérative : cellules souches

Cellules souches embryonnaires- à partir de embryon au stade préimplantatoire

- restent non différenciées au cours des différents passages si cultivées correctement

- expriment des marqueurs de non différentiation comme Nanog et Oct4 (facteurs de transcription)

- sont multipotentes : peuvent donner types cellulaires des trois feuillets embryonnaires (endoderme, mesoderme, ectoderme)

Cellules souches - non différenciées- peut donner des cellules différenciées

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Cellules souches embryonnaires

Pas bon génotype (histocompatibilité)

Problèmes éthiques

http://www.eurostemcell.org/factsheet/embyronic-stem-cell-research-ethical-dilemma

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Cellules souches embryonnaires

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Cellules souches embryonnaires

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Autres types de cellules souches avec bon génotype

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Cellules souches pluripotentes induites- à partir de fibroblastes adultes

- « transfection » de 4 gènes : Oct4, Sox2; Klf4, c-Myc- sont multipotentes : peuvent donner types cellulaires des trois feuillets

embryonnaires (endoderme, mesoderme, ectoderme)

Pas de problème d’histocompatibilitéPas de problème éthique lié aux cellules souches embryonnaires

Challenges : -diminuer nombre de gènes à « transfecter »-Ne pas utiliser de retrovirus

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Atteinte de leur cible par les axonesAtteinte de leur cible par les axones

Détermination chez l'embryon des cellules à devenir nerveux (cellules souches)

Division des cellules souches, Différenciation des différents types cellulaires (glial/neuronal; cellule pyramidale/cellule en grains), Migration des cellules. Croissance axone versus dendrite

Croissance des neurites (dendrites, axones) : utilisation de repères pour aller au bon endroit, établissement de cartes topographiques

Arrêt de la croissance neuritique quand la cible est trouvée et création d'une synapse fonctionnelle

Modification de la synapse en fonction de son activité

Comment construire un système nerveux ?

Détermination chez l'embryon des cellules à devenir nerveux (cellules souches)

Division des cellules souches, Différenciation des différents types cellulaires (glial/neuronal; cellule pyramidale/cellule en grains), Migration des cellules

Croissance des neurites (dendrites, axones) : utilisation de repères pour aller au bon endroit, établissement de cartes topographiques

Arrêt de la croissance neuritique quand la cible est trouvée et création d'une synapse fonctionnelle

Modification de la synapse en fonction de son activité

Comment construire un système nerveux ?

Fabr

icati

on d

e la

mac

hine

Plasticité de la machine (apprentissage; mémoire)

Plasticité activité dépendante du SN a lieu au niveau des synapses(Hebb)

Facilement accessible

Varicosités de taille importante => facilement visibles

pièces buccales

lobes cérébrauxganglion ventralmotoneurones

muscles

Face cuticulaire interneCôté droit

Glutamatergique, comme la majorité des synapses excitatrices du système nerveux central des vertébrés

Études électrophysiologiques possibles

La jonction neuromusculaire chez la DrosophileLa jonction neuromusculaire chez la Drosophile

Vue interne

HRP7 6

13 12

Formation et vie d’une synapse

Arrêt du cône de croissance

- comment se fait cette décision- rôle actif de la cible

Fabrication de la synapse

- machineries pré et postsynaptiques- quelle information indique que ces machineries doivent être localisées à un endroit précis ?

Modulation activité-dépendante des synapses

- voies de signalisation spécifiques ou bien ce sont les mêmes que celles utilisées au cours de la formation des synapses ?

Formation et vie d’une synapse

Arrêt du cône de croissance

- comment se fait cette décision- rôle actif de la cible

Fabrication de la synapse

- machineries pré et postsynaptiques- quelle information indique que ces machineries doivent être localisées à un endroit précis ?

Modulation activité-dépendante des synapses

- voies de signalisation spécifiques ou bien ce sont les mêmes que celles utilisées au cours de la formation des synapses ?

Etude de la synapse faite par le motoneurone RP3 sur les muscles 6 et 7

Fin d’embryogénèse :

On peut suivre le trajet d’un motoneurone seulement en l’injectant avec du lucifer yellow :

Rôle « positif » de la fascicline III

Molécule d’adhésion homophilique

Exprimée par les neurones RP3

Exprimée par les muscles 6 et 7 au moment de l’arrivée du cône de croissance de RP3

Dans un mutant FasIII, le cône de croissance de RP3 n’est pas correctement stabilisé et donne des JNM petites

Lorsque FasIII est surexprimée dans tous les muscles, le cône de croissance est stabilisé au niveau de muscles autres que 6 et 7

La Fas III présente sur RP3 et sur les muscles cibles est responsable de la stabilisation sélective de ce cône de croissance sur ces muscles

Rôle « négatif » de Toll

Toll est exprimé de façon dynamique sur les muscles

Heure 12

Heure 16

Dans les mutants Toll, le cône de croissance innerve les muscles 15 et autres

Lorsque Toll est surexprimé dans tous les muscles, le cône de croissance n’est pas correctement stabilisé au niveau des muscles 6 et 7

Mu

tants T

ollS

auvages

Su

rexpression

Toll

FasIII

FasIII

+

Toll

-

Toll

-

Concl : une intégration de différents signaux => arrêt et stabilisation du cône de croissance

- dépend des récepteurs et molécules exprimées par le cône de croissance- dépend des molécules (diffusibles ou non) libérées par la cible

Remarque : Toll est une molécule utilisée au cours du développement embryonnaire (polarité dorso-ventrale)

Formation et vie d’une synapse

Arrêt du cône de croissance

- comment se fait cette décision- rôle actif de la cible

Fabrication de la synapse

- machineries pré et postsynaptiques- quelle information indique que ces machineries doivent être localisées à un endroit précis ?

Modulation activité-dépendante des synapses

- voies de signalisation spécifiques ou bien ce sont les mêmes que celles utilisées au cours de la formation des synapses ?- quelles parties des machineries pré et postsynaptiques sont modifiées ?

Rencontre entre l’axone et sa cible : rôle actif de la cible

Exemple de la JNM de Drosophile

Ritzenthaler et al (2000) Nat Neurosci; 3:1012

Début de la synaptogenèse

Microscopie électronique à balayage :

Imagerie in vivo : mouches avec un transgène codant pour une GFP myristoylée

Traitement à la cytochalisine D=> contiennent de l ’actine

Il se produit un regroupement des myopodes au cours du temps

Ce regroupement correspond à la présence de la terminaison nerveuse

La présence de myopodes dépend-t-elle de la présence de terminaisons nerveuses ?

=> utilisation du mutant prospero, chez qui la croissance des axones est retardée

WT

prospero

À 13h myopodes normaux À 18h pas de concentration des myopodes

Il existe deux phases:1) une phase où emergent de nombreux myopodes sur toute la surface du muscle, de façon nerf-indépendante2) une phase nerf-dépendante où les motoneurones stabilisent ou induisent la formation de nouveaux myopodes.

Formation et vie d’une synapse

Arrêt du cône de croissance

- comment se fait cette décision- rôle actif de la cible

Fabrication de la synapse

- machineries pré et postsynaptiques- quelle information indique que ces machineries doivent être localisées à un endroit précis ?

Modulation activité-dépendante des synapses

- voies de signalisation spécifiques ou bien ce sont les mêmes que celles utilisées au cours de la formation des synapses ?- quelles parties des machineries pré et posstsynaptiques sont modifiées ?

Différenciation ultrastructurale de la JNM de Drosophile

Garner et al, 2000, Curr Op Neurobiol

Zone active présynaptique

Machinerie postsynaptique

Sheng et al, 2002, Science

Formation et vie d’une synapse

Arrêt du cône de croissance

- comment se fait cette décision- rôle actif de la cible

Fabrication de la synapse

- machineries pré et postsynaptiques- quelle information indique que ces machineries doivent être localisées à un endroit précis ?

Modulation activité-dépendante des synapses

- voies de signalisation spécifiques ou bien ce sont les mêmes que celles utilisées au cours de la formation des synapses ?- quelles parties des machineries pré et postsynaptiques sont modifiées ?

Un signal rétrograde :

Découverte d ’un mutant qui présente des JNM réduites (crible EMS, visualisation par fluorescence GFP)

Ctrle wit

Récepteur BMP de type II

La mutation affecte un récepteur aux protéines BMP

wit ctrle

wit, surexp wit presyn wit, surexp postsyn

Dans quel compartiment ce récepteur est-il nécessaire ?

Surexp presyn dom. neg.

wit ctrle

wit, surexp wit presyn wit, surexp postsyn

Dans quel compartiment ce récepteur est-il nécessaire ?

Surexp presyn dom. neg.

Concl : La fonction normale de ce récepteur se produit dans les motoneurones

Il y a des défauts ultrastructuraux des mutants wit

wit

ctrle

wit

présynapse

postsynapse

Récepteurs BMP de type II

D’où vient le signal ?Auteurs ont recherché les molécules de type BMP qui étaient exprimées dans le muscle au cours des stades embryonnaires et larvaires1 candidat intéressant : le gène gbb

gbbctrle

gbbctrle

Les défauts sont semblables à ceux des mutants wit

gbb

gbb, surexp gbb presyn.

gbb, surexp gbb postsyn

Dans quel compartiment Gbb est-il nécessaire ?

présynapse

postsynapse

Récepteurs BMP de type II

Ligand Gbb

Modèle interprétatif

présynapse

postsynapse

WgFz (récepteur Wg)

Wit (récepteur Gbb)

Gbb

Le signal Wg est-il nécessaire pour avoir le signal GbbOu vice-versa ?