Etude de la résistance des cellules souches de la peau

humaine au rayonnement par les puces à haute densité

Walid Rachidi

Laboratoire Lésions des acides Nucléiques (LAN)

walid.rachidi@cea.fr

INAC / SCIB / Laboratoire Lésions des Acides Nucléiques W.Rachidi, 11 septembre 2008

Peau humaine

épiderme

derme

hypoderme

10 follicules pileux, 100 glandes sudoripares, 2500 cellules sensorielles,

3 m des capillaires, 12 m de fibres nerveuses1 cm2 X 3 mm de profondeur

Structure de l’épiderme

Couche basale

Couche épineuse

Couche granuleuse

Couche cornée

prolifération

Différenciation+

Différenciation++

Différenciation terminale+++

Cellules souches et AT

Kératinocyte épineux

Kératinocyte granuleux

Cornéocyte

COUCHE BASALE

Kératinocyte souche

Cellule-fille souche Cellules AT (d’amplification transitoire) Proliférantes renouvellement du tissu.

Division asymétrique

Modèle de l'épiderme humain interfolliculaire

En culture : test des colonies

méroclones

AT

holoclones

= souches

paraclones

Peau

Lésions immédiates

(brûlure, inflammation …)

Effets tardifs

Séquelles (nécrose, kératose)

Tumeurs cutanées

Peau et irradiations

Hypothèse: les cellules basales sont à l'origine des lésions

basal cellcarcinoma

Mutations dans les cellules AT/souches ?

Objectifs

Deux objectifs principaux :

1- Isoler et caractériser les cellules de la couche basale

(cellules à risque)

2- Etudier leur radiosensibilité différentielle

Souches AT

LGRK : Isolement des 3 populations

Intégrine α6

CD

71

0.1%

8-10%

Kératinocytes AT

Kératinocytes souches

Toxicité à court (24, 48 et 72h

et long terme (14 jours) :

XTT et survie clonale

Radiosensibilité différentielle

Dégâts de l’ADN

δ-H2AX (cassure double brin)

Génomique Fonctionnelle :

Transcriptomeα6+CD71-

α6+CD71+

Kératinocytes souches

Kératinocytes AT

2 Gy

2 Gy

Toxicité à long terme: survie clonale à 15 j (2Gy)

*

*

nb de coloniesnb cellules

ensemencées

CFE = n = 3p < 0.05

Colony Forming Efficiency

0

2

4

6

8

10

12

TA KSC

controlirradiated

Stem cells

Colony Forming Efficiency

0

2

4

6

8

10

12

TA KSC

controlirradiated

0

2

4

6

8

10

12

KSC

controlirradiated

Colony Forming Efficiency

AT Cellules souches

0Gy 2Gy2Gy 0Gy 2Gy2Gy

Résultats

kératinocytes AT: radio-sensibleskératinocytes souches:

radio-résistants

mécanismes ?

Signalisation, réparation de l’ADN??

AT

Souches

et 24 h…

05

1015202530354045

0 5 15 30

Temps (min)

Foci

per

cel

l

Proliférants

Souche

Comptage des foyers d’γ-H2AXMarquage des foyers d’γ-H2AX (cassure d’ADN double brin)

Réparation de l’ADN

Les kératinocytes souches ont une efficacité de réparation de l’ADN très rapide par rapport aux kératinocytes proliférants ou AT.

Décroissance très rapide du nombre des cassures d’ADN double brin dans les kératinocytes souches par rapport aux kératinocytes proliférants

Questions reposées

• Quels sont les mécanismes responsables d’une telle réparation chez les kératinocytes souches?

• Quels sont les gènes pouvant être impliqués dans ces mécanismes?

Puces: générateur d'hypothèseNombre de cellules : 10 000 à 50 000Amplification de l’ARNm Marquage fluorescent indirect (Cy5 ou Cy3)Puces à oligonucléotides longs (~60 mers) spottées avec 26496 dépôts (espèce Homme)4 réplicats techniques (2 dye swap)Liste des gènes modulés : Test de Student, p = 0,005Gènes sur-exprimés : rapport > 1,5Gènes sous-exprimés : rapport <0,66

Réponse spécifique des cellules souches à l’irradiation

4700 genes166

gènes227

SoucheAT

other specific pathways

DNA repairXRCC5, RAD52,

RAD23B, XAB1, BCCIP

cell signallingCHK1

Réseaux d’interaction géniques

Most significant networkin irradiated stem cells: cytokines

Ingenuity

up- regulated

genes

Upregulated FGF2 pathway in stem cells

FGF2

H-Ras

CREB

FGF-R1

SHP2

MEK1

ERK1/2

Radioresistance ?

extracellular

cytoplasm

nucleus

GRB2

Summary:

progenitors and stem cells can be purified

progenitors radiosensitive, both shortand long-term

stem cells radioresistant

mechanisms : apoptosis inhibition, faster DNA repair and activated signalling

FGF2 and DNA repair?Radioresistance of stem cells and high cancer

frequency?

FGF2 signalling is critical for FGF2 signalling is critical for DNA repair in human DNA repair in human epidermal stem cellsepidermal stem cells

•• Blocking FGF2 signalling inhibited the Blocking FGF2 signalling inhibited the rapid decrease of gH2AX foci in stem cells, rapid decrease of gH2AX foci in stem cells, suggesting a direct role of FGF2 in DNA suggesting a direct role of FGF2 in DNA repairrepair

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