Post on 11-Jul-2020
Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’endocytose
David Perrais
Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (IINS), CNRS UMR 5297
Centre de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux, Université Bordeaux Segalen
david.perrais@u-bordeaux2.fr
Master 2 – BCPP Université Bordeaux
Endocytose : entrée dans la cellule de macromolécules empaquetées dans des vésicules
qui dérivent de l’invagination et de la séparation de fragments de membrane plasmique
Conner & Schmid, Nature 2003, 422, 37-44
Caractérisation des vésicules d’endocytose
Formation de vésicules concentrant le cargo et recouvertes d’un manteau composé en grande
partie de clathrine (Pearse 1976)
La clathrine est un composant universel dans les cellules eucaryotes, levure comprise
L’endocytose médiée par la clathrine semble être majoritaire dans la plupart des cellules;
exceptions possibles: macrophages
Willingham & Pastan, Cell 1980
Un trimère de clathrine (Fotin et al. Nature 2004)
Structure en triskèle Heuser, JCB 1980
Structure du manteau de clathrine
L’invagination progressive des puits recouverts de clathrine s’accompagne
d’un réarrangement du manteau
Combien de temps pour former une vésicule ?
Estimation dans fibroblastes : proportion de membrane plasmique : ~2%
Temps pour un renouvellement complet de la membrane : ~ 60 min
Donc l'ensemble des puits internalise 2% de la membrane en 1.2 min
Mais… la clathrine ne se lie pas directement à la membrane plasmique
Un intermédiaire, les protéines adaptatrices
Protéines adaptatrices
Benmerah et Lamaze, M/S 2002
Autres protéines impliquées dans l’endocytose
Le mutant shibirets de drosophile (isolé en 1973), film visible sur http://www.endocytosis.org/Dynamin/Shibire.html
provoque une inhibition de l’endocytose dans les neurones en culture (1990)
correspondant à la dynamine (1991), qui s’associe aux microtubules (!)(1990)
1993: démonstration que la dynamine mutée bloque l’endocytose à un stade précoce (sans affecter les microtubules)
Images de terminaisons synaptiques de neurones de souris sauvage (A) et dynamin1-/- (B-E)
Ferguson et al. Science 2007
Reconstruction à partir d’une série de coupes
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) issus de souris double KO dyn1 et 2
Un cas intéressant de compensation dans les KO simples
Rôle essentiel de la dynamine dans les cellules non neuronales
Ferguson et al. Dev Cell 2009
Trois partenaires essentiels
Conner & Schmid, Nature 2003
Recherche d’autres partenaires
1. Liaison avec des protéines connues
2. Analogie de structure
3. Mutations affectant l’endocytose
Quantification de l’endocytose
4. Présence pendant la formation des vésicules d’endocytose
Incubation à 4°C
+ marqueur Incubation à 37°C
- marqueur
Incubation à pH 3
("stripping") (4°C)
- marqueur
Quantification marquage Marqueur: ligand ou anticorps
Exemple: cellules n’exprimant plus la sous-unité µ2 de AP2
Motley et al. J. Cell. Biol., 2003 ; Conner & Schmid J. Cell. Biol., 2003
contrôles m2 knock down
Expériences faites sur des cellules HeLa
Motley et al. J. Cell. Biol., 2003
En conclusion : AP2 nécessaire pour endocytose du récepteur de la transferrine (TfR)
mais pas pour celle des EGF-R ni des LDL-R
Il existe d’autres protéines adaptatrices:
• epsine pour les protéines ubiquitinées (EGF-R)
• Dab2 et ARH pour les protéines avec motif NPXY (LDL-R)
• β-arrestine pour les GPCR
Exemple: cellules n’exprimant plus la sous-unité µ2 de AP2
Saccharomyces Cervisae : un bon modèle d'étude de l'endocytose?
Un système modèle pour les études génétiques
Existence de nombreux homologues des protéines de l'endocytose
(clathrine, protéines adaptatrices)
Mais…
Endocytose toujours possible dans chc
Pas d'homologue de dynamine
Clc-GFP
Sensibilité aux mutants affectant le cytosquelette d'actine
Sla1p-GFP Kaksonen et al. Cell 2005
Kymographes: fluorescence de
la ligne en fonction du temps
Saccharomyces Cervisae : un bon modèle d'étude de l'endocytose?
Un système modèle pour les études génétiques
Existence de nombreux homologues des protéines de l'endocytose
(clathrine, protéines adaptatrices)
Mais…
Endocytose toujours possible dans chc
Pas d'homologue de dynamine
Clc-GFP
Sensibilité aux mutants affectant le cytosquelette d'actine
Sla1p-GFP Kaksonen et al. Cell 2005
Kymographes: fluorescence de
la ligne en fonction du temps
Convergence des modèles: implication de la clathrine dans la levure
Microscopie TIRF pour visualiser les patchs membranaires
Kaksonen et al. Cell 2005
Utilisation de la microscopie deux couleurs (et les mutants) pour définir
des "modules protéiques" impliqués dans l'endocytose
Kaksonen et al. Cell 2005
Un rôle de l'actine dans l'endocytose des cellules de mammifère?
Oui Lamaze C, Fujimoto LM, Yin HL, Schmid SL. (1997) The actin cytoskeleton is required for receptor-mediated
endocytosis in mammalian cells. J Biol Chem 1997;272: 20332–20335.
Mais… l’image est beaucoup moins claire par la suite: Fujimoto LM, Roth R, Heuser JE, Schmid SL (2000). Actin assembly plays a variable, but not
obligatoryrole in receptor-mediated endocytosis in mammalian cells. Traffic 2000;1: 161-171.
Une convergence possible: influence de la tension membranaire
Aghamohammadzadeh & Ayscough, Nat Cell Biol 2009
Les étapes de la formation des vésicules recouvertes de clathrine
recrutement invagination constriction fission mouvement déshabillage
200 nm
Comment déformer localement une membrane ?
Elaboration de systèmes reconstituant in vitro la formation de vésicules, puits, tubules
McMahon & Gallop, Nature 2005
L’epsine s’insère dans la membrane Forme des tubules
S’associe à la
clathrine en
agrégats bombés
Ford et al. Nature 2002
De nombreuses protéines peuvent induire des tubules membranaires
De nombreuses protéines peuvent induire des tubules membranaires
Liposomes + dynamin + GTP + GTPγS
Takei et al. Cell 1998
Domaine BAR de amphiphysine
Peter et al. Science 2004
De nombreux domaines incurvés avec des tailles différentes
Itoh et al. Dev Cell 2005 ; Frost et al. Cell 2008
La dynamine ne fait pas que former des tubules
Après application de GTP, les tubules se fracturent
Quelque chose doit « retenir » la vésicule pour que la dynamine fracture le tubule. L’actine ?
Roux et al. Nature 2007
Quel est le comportement de ces protéines dans les cellules ?
Problème : visualiser la formation des vésicules recouvertes de clathrine dans des cellules
5 mm
Cellule (Swiss 3T3) transfectée avec clathrine-DsRed
clathrin
actin
Observation d’événements d’endocytose dans les cellules vivantes
Endocytose : mouvement de la vésicule loin de la membrane plasmique
Observation par microscopie à onde évanescente (microscopie TIRF)
Merrifield et al. Nature Cell Biol 2002
extracellular pH 7.4
pH 7.4 TfR-pHl pH 5.5
5.5
2 s
Direct detection of endocytic vesicle formation in live cells
TfR-pHl: récepteur de la transferrine fusionné à la pHluorine
Endocytose : formation d’une vésicule
clathrin-
dsRed
TfR-pHl
*
*
Tfnr-phl
pH 5.5 7.4 merge clathrin dsRed
1 min
Observation d’événements d’endocytose dans les cellules vivantes
Merrifield, Perrais & Zenisek Cell 2005
Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule
Dyn1-mCherry TfR-pHl
TfR pH 7.4
pH 5.5
dynamin1
time -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 s
Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule
Dyn1-mCherry TfR-pHl
0
500
1000
1500
2000
fluo (
au)
dynamin1
0
200
400
600
800
-90 -60 -30 0 30 60 90
time (s)
fluo (
au)
TfR pH 7.4
pH 5.5
dynamin1
time -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 s
Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule
250
200
150
100
50
0
-80 -40 0 40 80
250
200
150
100
50
0
1000
800
600
400
200
0
TfR, pH 7.4
TfR, pH 5.5
dynamin1
flu
o
flu
o
co
rre
cte
d flu
o
350
300
250
200
150
100
50
0
-80 -40 0 40 80
400
300
200
100
0
1000
800
600
400
200
0
8 cells, 1297 events,
548 terminal, 578 non terminal
non terminal
terminal
TfR, pH 7.4
TfR, pH 5.5
dynamin
flu
o
flu
o
co
rre
cte
d flu
o
Recrutement de la dynamine au moment de la scission
time (s)
dynamin1
dynamin2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-60 -40 -20 0 20 40
dynaminsyndapinendophilin
time (s)
norm
al. f
luo
correlation distance = 1 – correlation coefficient
0 ≤ correlation distance ≤ 2
Comparaison des profils de recrutement de protéines
Une carte du recrutement de protéines associées
Taylor, Perrais & Merrifield, PloS Biology 2011
Une vision « actuelle » du recrutement des protéines associées
à la formation des vésicules
McMahon & Boucrot, Nat Rev Mol Cell Biol 2011
Conner & Schmid, Nature 2003
La voie dépendant de la clathrine n’est pas la seule :
Les différentes voies d’entrée dans la cellule
Stan, 2002
Les cavéoles : une autre voie d’endocytose ?
Richter et al. Traffic 2008
Congélation à haute pression et tomographie
Coupe fine après fixation chimique Replique de platine, surface cytoplasmique
Endocytose par les caveoles faible, mais peut être stimulée
Cholera toxin: des modes d’entrée plus variables
Un excès de cholesterol stimule l’endocytose
des cargos des caveoles
Singh et al. Mol Biol Cell 2003
Un autre rôle des caveoles, la régulation de la tension membranaire
Sinha et al. Cell 2011
Les caveoles permettent de conserver la tension membranaire
Un choc osmotique provoque l’aplatissement des caveoles
Recherche de protéines impliquées dans la formation des caveoles
Purification de membranes résistantes aux détergents
(MRD, contenant les caveoles) dans souris WT et Cav1-/-
Protéines (identifiées par spectrométrie de masse) enrichies
dans les MRD: 8 au total
PTRF (polymerase-I transcript release factor)
SDPR (serum deprivation response protein)
Deux autres genes forment une « famille »
SRBC (sdr related gene product that binds to C-kinase)
MURC (muscle restricted coiled coil protein)
Hill et al. Cell 2008
Influence des SDPR, PTRF (Cavin1 et 2) dans la formation des cavéoles
Surexpression (10x) des protéines SDPR et PTRF
Hansen et al. 2009
Autres voies d’endocytose
Voie indépendante de la dynamine (dynamin1,2-/-)
Ferguson et al. Dev Cell 2009
Un même récepteur peut utiliser deux voies d’endocytose en parallèle
Exemple: récepteur de l’EGF
Sigismund et al. PNAS 2005; Dev Cell 2008
Des protéines exogènes (pathogènes) peuvent induire la formation de tubules
Römer et al. Nature 2007
Dans les cellules
(sans dynamine) Dans les vésicules géantes
Après l’endocytose: déterminants moléculaires des organelles
1. Les protéines Rab
Stenmark, Nat Rev Mol Cell Biol 2009
2. Les phosphoinositides
Vicinanza et al., EMBO J 2008
Maturation des endosomes
OCRL1
APPL1
WDFY2
EEA1 Rab5
PI(3)P
PI(4,5)P2 -> PI(4)P
Zoncu et al. Cell 2009
Recrutement successifs de marqueurs dans les cellules vivantes
La dégradation du PI(3)P stabilise APPL1
Outils moléculaires pour interférer avec les phosphoinositides
Zoncu et al. Cell 2009
La stabilisation des endosomes APPL1 augmente la signalisation de EGFR
1.5 ng/ml
Zoncu et al. Cell 2009
Après l’endocytose: recyclage, dégradation, trafic vers d’autres compartiments
Grant & Donaldson, Nat Rev MolCellBiol 2009
Bibliographie • Aghamohammadzadeh, S. and K. R. Ayscough (2009). "Differential
requirements for actin during yeast and mammalian endocytosis." Nat Cell
Biol 11(8): 1039-42.
• Benmerah, A. and C. Lamaze (2007). "Clathrin-Coated Pits: Vive La
Difference?" Traffic.
• Conner, S. D. and S. L. Schmid (2003). "Differential requirements for AP-
2 in clathrin-mediated endocytosis." J Cell Biol 162(5): 773-9.
• Damke, H., T. Baba, et al. (1994). "Induction of mutant dynamin
specifically blocks endocytic coated vesicle formation." J Cell Biol 127(4):
915-34.
• Ferguson, S. M., G. Brasnjo, et al. (2007). "A selective activity-dependent
requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis." Science
316(5824): 570-4.
• Ferguson, S. M., A. Raimondi, et al. (2009). "Coordinated actions of actin
and BAR proteins upstream of dynamin at endocytic clathrin-coated pits."
Dev Cell 17(6): 811-22.
• Ford, M. G., I. G. Mills, et al. (2002). "Curvature of clathrin-coated pits
driven by epsin." Nature 419(6905): 361-6.
• Frost, A., R. Perera, et al. (2008). "Structural basis of membrane
invagination by F-BAR domains." Cell 132(5): 807-17.
• Fujimoto, L. M., R. Roth, et al. (2000). "Actin assembly plays a variable,
but not obligatory role in receptor-mediated endocytosis in mammalian
cells." Traffic 1(2): 161-71.
• Heuser, J. (1980). "Three-dimensional visualization of coated vesicle
formation in fibroblasts." J Cell Biol 84(3): 560-83.
• Itoh, T., K. S. Erdmann, et al. (2005). "Dynamin and the actin
cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by
BAR and F-BAR proteins." Dev Cell 9(6): 791-804.
• Kaksonen, M., C. P. Toret, et al. (2005). "A modular design for the
clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery." Cell 123(2): 305-20.
• Lamaze, C., L. M. Fujimoto, et al. (1997). "The actin cytoskeleton is
required for receptor-mediated endocytosis in mammalian cells." J Biol
Chem 272(33): 20332-5.
• McMahon, H. T. and E. Boucrot (2011). "Molecular mechanism and
physiological functions of clathrin-mediated endocytosis." Nat Rev Mol Cell
Biol 12(8): 517-33.
• McMahon, H. T. and J. L. Gallop (2005). "Membrane curvature and
mechanisms of dynamic cell membrane remodelling." Nature 438(7068):
590-6.
• Merrifield, C. J., M. E. Feldman, et al. (2002). "Imaging actin and dynamin
recruitment during invagination of single clathrin-coated pits." Nat Cell Biol
4(9): 691-8.
• Merrifield, C. J., D. Perrais, et al. (2005). "Coupling between Clathrin-
Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission
Observed in Live Cells." Cell 121(4): 593-606.
• Motley, A., N. A. Bright, et al. (2003). "Clathrin-mediated endocytosis in
AP-2-depleted cells." J Cell Biol 162(5): 909-18.
• Pearse, B. M. and M. S. Bretscher (1981). "Membrane recycling by
coated vesicles." Annu Rev Biochem 50: 85-101.
• Peter, B. J., H. M. Kent, et al. (2004). "BAR domains as sensors of
membrane curvature: the amphiphysin BAR structure." Science 303(5657):
495-9. Epub 2003 Nov 26.
• Romer, W., L. Berland, et al. (2007). "Shiga toxin induces tubular
membrane invaginations for its uptake into cells." Nature 450(7170): 670-5.
• Roux, A., K. Uyhazi, et al. (2006). "GTP-dependent twisting of dynamin
implicates constriction and tension in membrane fission." Nature
441(7092): 528-31.
• Stenmark, H. (2009). "Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic."
Nat Rev Mol Cell Biol 10(8): 513-25.
• Takei, K., V. Haucke, et al. (1998). "Generation of coated intermediates
of clathrin-mediated endocytosis on protein-free liposomes." Cell 94(1):
131-41.
• Taylor, M. J., D. Perrais, et al. (2011). "A high precision survey of the
molecular dynamics of mammalian clathrin-mediated endocytosis." PLoS
Biol 9(3): e1000604.
• Vicinanza, M., G. D'Angelo, et al. (2008). "Function and dysfunction of the
PI system in membrane trafficking." Embo J 27(19): 2457-70.
• Willingham, M. C. and I. Pastan (1980). "The receptosome: an
intermediate organelle of receptor mediated endocytosis in cultured
fibroblasts." Cell 21(1): 67-77.