Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’endocytose

David Perrais

Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (IINS), CNRS UMR 5297

Centre de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux, Université Bordeaux Segalen

david.perrais@u-bordeaux2.fr

Master 2 – BCPP Université Bordeaux

Endocytose : entrée dans la cellule de macromolécules empaquetées dans des vésicules

qui dérivent de l’invagination et de la séparation de fragments de membrane plasmique

Conner & Schmid, Nature 2003, 422, 37-44

Caractérisation des vésicules d’endocytose

Formation de vésicules concentrant le cargo et recouvertes d’un manteau composé en grande

partie de clathrine (Pearse 1976)

La clathrine est un composant universel dans les cellules eucaryotes, levure comprise

L’endocytose médiée par la clathrine semble être majoritaire dans la plupart des cellules;

exceptions possibles: macrophages

Willingham & Pastan, Cell 1980

Un trimère de clathrine (Fotin et al. Nature 2004)

Structure en triskèle Heuser, JCB 1980

Structure du manteau de clathrine

L’invagination progressive des puits recouverts de clathrine s’accompagne

d’un réarrangement du manteau

Combien de temps pour former une vésicule ?

Estimation dans fibroblastes : proportion de membrane plasmique : ~2%

Temps pour un renouvellement complet de la membrane : ~ 60 min

Donc l'ensemble des puits internalise 2% de la membrane en 1.2 min

Mais… la clathrine ne se lie pas directement à la membrane plasmique

Un intermédiaire, les protéines adaptatrices

Protéines adaptatrices

Benmerah et Lamaze, M/S 2002

Autres protéines impliquées dans l’endocytose

Le mutant shibirets de drosophile (isolé en 1973), film visible sur http://www.endocytosis.org/Dynamin/Shibire.html

provoque une inhibition de l’endocytose dans les neurones en culture (1990)

correspondant à la dynamine (1991), qui s’associe aux microtubules (!)(1990)

1993: démonstration que la dynamine mutée bloque l’endocytose à un stade précoce (sans affecter les microtubules)

Images de terminaisons synaptiques de neurones de souris sauvage (A) et dynamin1-/- (B-E)

Ferguson et al. Science 2007

Reconstruction à partir d’une série de coupes

Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) issus de souris double KO dyn1 et 2

Un cas intéressant de compensation dans les KO simples

Rôle essentiel de la dynamine dans les cellules non neuronales

Ferguson et al. Dev Cell 2009

Trois partenaires essentiels

Conner & Schmid, Nature 2003

Recherche d’autres partenaires

1. Liaison avec des protéines connues

2. Analogie de structure

3. Mutations affectant l’endocytose

Quantification de l’endocytose

4. Présence pendant la formation des vésicules d’endocytose

Incubation à 4°C

+ marqueur Incubation à 37°C

- marqueur

Incubation à pH 3

("stripping") (4°C)

- marqueur

Quantification marquage Marqueur: ligand ou anticorps

Exemple: cellules n’exprimant plus la sous-unité µ2 de AP2

Motley et al. J. Cell. Biol., 2003 ; Conner & Schmid J. Cell. Biol., 2003

contrôles m2 knock down

Expériences faites sur des cellules HeLa

Motley et al. J. Cell. Biol., 2003

En conclusion : AP2 nécessaire pour endocytose du récepteur de la transferrine (TfR)

mais pas pour celle des EGF-R ni des LDL-R

Il existe d’autres protéines adaptatrices:

• epsine pour les protéines ubiquitinées (EGF-R)

• Dab2 et ARH pour les protéines avec motif NPXY (LDL-R)

• β-arrestine pour les GPCR

Exemple: cellules n’exprimant plus la sous-unité µ2 de AP2

Saccharomyces Cervisae : un bon modèle d'étude de l'endocytose?

Un système modèle pour les études génétiques

Existence de nombreux homologues des protéines de l'endocytose

(clathrine, protéines adaptatrices)

Mais…

Endocytose toujours possible dans chc

Pas d'homologue de dynamine

Clc-GFP

Sensibilité aux mutants affectant le cytosquelette d'actine

Sla1p-GFP Kaksonen et al. Cell 2005

Kymographes: fluorescence de

la ligne en fonction du temps

Saccharomyces Cervisae : un bon modèle d'étude de l'endocytose?

Un système modèle pour les études génétiques

Existence de nombreux homologues des protéines de l'endocytose

(clathrine, protéines adaptatrices)

Mais…

Endocytose toujours possible dans chc

Pas d'homologue de dynamine

Clc-GFP

Sensibilité aux mutants affectant le cytosquelette d'actine

Sla1p-GFP Kaksonen et al. Cell 2005

Kymographes: fluorescence de

la ligne en fonction du temps

Convergence des modèles: implication de la clathrine dans la levure

Microscopie TIRF pour visualiser les patchs membranaires

Kaksonen et al. Cell 2005

Utilisation de la microscopie deux couleurs (et les mutants) pour définir

des "modules protéiques" impliqués dans l'endocytose

Kaksonen et al. Cell 2005

Un rôle de l'actine dans l'endocytose des cellules de mammifère?

Oui Lamaze C, Fujimoto LM, Yin HL, Schmid SL. (1997) The actin cytoskeleton is required for receptor-mediated

endocytosis in mammalian cells. J Biol Chem 1997;272: 20332–20335.

Mais… l’image est beaucoup moins claire par la suite: Fujimoto LM, Roth R, Heuser JE, Schmid SL (2000). Actin assembly plays a variable, but not

obligatoryrole in receptor-mediated endocytosis in mammalian cells. Traffic 2000;1: 161-171.

Une convergence possible: influence de la tension membranaire

Aghamohammadzadeh & Ayscough, Nat Cell Biol 2009

Les étapes de la formation des vésicules recouvertes de clathrine

recrutement invagination constriction fission mouvement déshabillage

200 nm

Comment déformer localement une membrane ?

Elaboration de systèmes reconstituant in vitro la formation de vésicules, puits, tubules

McMahon & Gallop, Nature 2005

L’epsine s’insère dans la membrane Forme des tubules

S’associe à la

clathrine en

agrégats bombés

Ford et al. Nature 2002

De nombreuses protéines peuvent induire des tubules membranaires

De nombreuses protéines peuvent induire des tubules membranaires

Liposomes + dynamin + GTP + GTPγS

Takei et al. Cell 1998

Domaine BAR de amphiphysine

Peter et al. Science 2004

De nombreux domaines incurvés avec des tailles différentes

Itoh et al. Dev Cell 2005 ; Frost et al. Cell 2008

La dynamine ne fait pas que former des tubules

Après application de GTP, les tubules se fracturent

Quelque chose doit « retenir » la vésicule pour que la dynamine fracture le tubule. L’actine ?

Roux et al. Nature 2007

Quel est le comportement de ces protéines dans les cellules ?

Problème : visualiser la formation des vésicules recouvertes de clathrine dans des cellules

5 mm

Cellule (Swiss 3T3) transfectée avec clathrine-DsRed

clathrin

actin

Observation d’événements d’endocytose dans les cellules vivantes

Endocytose : mouvement de la vésicule loin de la membrane plasmique

Observation par microscopie à onde évanescente (microscopie TIRF)

Merrifield et al. Nature Cell Biol 2002

extracellular pH 7.4

pH 7.4 TfR-pHl pH 5.5

5.5

2 s

Direct detection of endocytic vesicle formation in live cells

TfR-pHl: récepteur de la transferrine fusionné à la pHluorine

Endocytose : formation d’une vésicule

clathrin-

dsRed

TfR-pHl

*

*

Tfnr-phl

pH 5.5 7.4 merge clathrin dsRed

1 min

Observation d’événements d’endocytose dans les cellules vivantes

Merrifield, Perrais & Zenisek Cell 2005

Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule

Dyn1-mCherry TfR-pHl

TfR pH 7.4

pH 5.5

dynamin1

time -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 s

Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule

Dyn1-mCherry TfR-pHl

0

500

1000

1500

2000

fluo (

au)

dynamin1

0

200

400

600

800

-90 -60 -30 0 30 60 90

time (s)

fluo (

au)

TfR pH 7.4

pH 5.5

dynamin1

time -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 s

Recrutement de la dynamine au moment de la formation de la vésicule

250

200

150

100

50

0

-80 -40 0 40 80

250

200

150

100

50

0

1000

800

600

400

200

0

TfR, pH 7.4

TfR, pH 5.5

dynamin1

flu

o

flu

o

co

rre

cte

d flu

o

350

300

250

200

150

100

50

0

-80 -40 0 40 80

400

300

200

100

0

1000

800

600

400

200

0

8 cells, 1297 events,

548 terminal, 578 non terminal

non terminal

terminal

TfR, pH 7.4

TfR, pH 5.5

dynamin

flu

o

flu

o

co

rre

cte

d flu

o

Recrutement de la dynamine au moment de la scission

time (s)

dynamin1

dynamin2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-60 -40 -20 0 20 40

dynaminsyndapinendophilin

time (s)

norm

al. f

luo

correlation distance = 1 – correlation coefficient

0 ≤ correlation distance ≤ 2

Comparaison des profils de recrutement de protéines

Une carte du recrutement de protéines associées

Taylor, Perrais & Merrifield, PloS Biology 2011

Une vision « actuelle » du recrutement des protéines associées

à la formation des vésicules

McMahon & Boucrot, Nat Rev Mol Cell Biol 2011

Conner & Schmid, Nature 2003

La voie dépendant de la clathrine n’est pas la seule :

Les différentes voies d’entrée dans la cellule

Stan, 2002

Les cavéoles : une autre voie d’endocytose ?

Richter et al. Traffic 2008

Congélation à haute pression et tomographie

Coupe fine après fixation chimique Replique de platine, surface cytoplasmique

Endocytose par les caveoles faible, mais peut être stimulée

Cholera toxin: des modes d’entrée plus variables

Un excès de cholesterol stimule l’endocytose

des cargos des caveoles

Singh et al. Mol Biol Cell 2003

Un autre rôle des caveoles, la régulation de la tension membranaire

Sinha et al. Cell 2011

Les caveoles permettent de conserver la tension membranaire

Un choc osmotique provoque l’aplatissement des caveoles

Recherche de protéines impliquées dans la formation des caveoles

Purification de membranes résistantes aux détergents

(MRD, contenant les caveoles) dans souris WT et Cav1-/-

Protéines (identifiées par spectrométrie de masse) enrichies

dans les MRD: 8 au total

PTRF (polymerase-I transcript release factor)

SDPR (serum deprivation response protein)

Deux autres genes forment une « famille »

SRBC (sdr related gene product that binds to C-kinase)

MURC (muscle restricted coiled coil protein)

Hill et al. Cell 2008

Influence des SDPR, PTRF (Cavin1 et 2) dans la formation des cavéoles

Surexpression (10x) des protéines SDPR et PTRF

Hansen et al. 2009

Autres voies d’endocytose

Voie indépendante de la dynamine (dynamin1,2-/-)

Ferguson et al. Dev Cell 2009

Un même récepteur peut utiliser deux voies d’endocytose en parallèle

Exemple: récepteur de l’EGF

Sigismund et al. PNAS 2005; Dev Cell 2008

Des protéines exogènes (pathogènes) peuvent induire la formation de tubules

Römer et al. Nature 2007

Dans les cellules

(sans dynamine) Dans les vésicules géantes

Après l’endocytose: déterminants moléculaires des organelles

1. Les protéines Rab

Stenmark, Nat Rev Mol Cell Biol 2009

2. Les phosphoinositides

Vicinanza et al., EMBO J 2008

Maturation des endosomes

OCRL1

APPL1

WDFY2

EEA1 Rab5

PI(3)P

PI(4,5)P2 -> PI(4)P

Zoncu et al. Cell 2009

Recrutement successifs de marqueurs dans les cellules vivantes

La dégradation du PI(3)P stabilise APPL1

Outils moléculaires pour interférer avec les phosphoinositides

Zoncu et al. Cell 2009

La stabilisation des endosomes APPL1 augmente la signalisation de EGFR

1.5 ng/ml

Zoncu et al. Cell 2009

Après l’endocytose: recyclage, dégradation, trafic vers d’autres compartiments

Grant & Donaldson, Nat Rev MolCellBiol 2009

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