L’ingénierie des protéines : approche prometteuse pour le développement de nouveaux antimicrobiens

Ismail Fliss et Riadh Hammami

Colloque STELA, 13-14 mai 2013

Colloque STELA, 13-14 mai 2013

Équipe à l’INAF: identification, caractérisation et étude de la relation structure/fonction des bactériocines de bactéries lactiques et des probiotiques.

Équipe du centre de recherche du CHUQ, laboratoire de chimie médicale: synthèse chimique de peptides à activité biologique.

Projet FQRNT-Équipe

Colloque STELA, 13-14 mai 2013

Synthétiser à grande échelle, à partir des séquences peptidiques des bactériocines, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d’action.

Microcine J25

Objectif général

Colloque STELA, 13-14 mai 2013

Peptides ou polypeptides produits naturellement par plusieurs souches bactériennes d’origine alimentaire et environnementale.

Activité antimicrobienne (bactéricide ou bactériostatique) dirigée contre des microorganismes phylogénétiquement proches de la souche productrice.

Bactériocines?

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Phénomène très répandu (lactocoques et lactobacilles);

Large spectre d’activité antimicrobienne;

Résistance à l’acidité et aux traitements thermiques;

150 bactériocines de Gram (+) et 25 de Gram (-): BACTIBASE

Bactériocines

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Nisine est la seule bactériocine acceptée dans plus de 50 pays. Carinobacterium maltaromaticum CB1: agent de bioconservation des produits de charcuteries(Santé Canada, additif alimentaire) C. divergens M35: agent de bioconservation des produits marins fumés (Santé Canada, section des aliments nouveaux ) Pediococcus acidilactici: souche probiotique à usage vétérinaire (Santé Canada, section des produits de santé naturelle)

Statut légal des bactériocines

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Alimentaire: Agents de conservation des aliments( Nisine)

Pharmaceutique: infections de la peau, germes multirésistants

Vétérinaire: Traitement et prévention de la mammite bovine (WIPE OUT® Immucell)

Applications

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Avantages et limites

Limites Avantages

Substances de grade alimentaire

Complètement dégradées dans le

tractus digestif

Forte activité biologique: 103 à 106 fois

supérieure aux autres antimicrobiens

incluant les antibiotiques;

Grande stabilité thermique:

compatible avec divers traitements

thermiques

Spectre d’action étroit

l’instabilité dans les matrices biologiques

(protéases, de pHs extrêmes, de sel).

Faibles rendements de production (10%):

difficulté de les produire à grande

échelle, coûts élevés, etc

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Approche microbiologique: sélection de souches fortement productrice (L. lactis diacetylatis UL719, P. acidilactici UL5), optimisation de procédés de fermentation (système avec cellules immobilisées), et de purification (immunoaffinité). Approche de biologie moléculaire: clonage et production de bactériocines recombinantes

Approche d’ingénierie des protéines: synthèse peptidique (connaissance parfaite des caractéristiques structurales et les liens avec l’activité biologique)

Amélioration des rendements

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Élucider la relation entre les structures primaires et secondaires des bactériocines et leur fonction biologique.

Le but ultime étant d’exploiter les connaissances générées pour synthétiser à grande échelle, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d’action.

Microcine J25

Objectif général

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La microcine J25

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La microcine J25

21 AA Structure unique en Lasso 3 feuillets β (5-7, 11-14 et 18-20)

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La microcine J25

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Relation structure-fonction de la microcine J25

• Plusieurs études de biologie moléculaire et de synthèse chimique ont tenté de produire la microcine J25 ou de dérivés actifs mais sans succès.

• Manque de connaissances sur la relation entre la structure particulière en Lasso de la microcine et de son activité biologique:

- rôle de la boucle 1-8 en N-terminal, - rôle de la queue en C-terminal (avec

ces deux segments : 9-17 et 18-21), - la présence de certains ponts amides

(G1-E8 cyclisation), - La présence de certains AA particuliers.

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GGAGH VPEYF VGIGT PISFYG

La conformation globale particulière en lasso de la microcine est-elle indispensable à l’activité biologique?

J25

C1

C2

C3 GGAGH VPCYF VGIGT PICFYG

CGAGH VPCYF VGIGT PISFYG

CGAGH VPEYF VGIGT PICFYG C8 C18

C1 G1

C8

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Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25

J25 C1 C2 C3

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La séquence complète de la microcine est-elle essentielle à l’activité biologique?

GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G

--YF VGIGT PISFY G

-CYF VGIGT PICFY G

KCYF VGIGT PICFY G

J25

9-21

8-21

7-21

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Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25

J25 7-21

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GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G

GWKGK WKCYF VGIGT PICFY G

J25

WK_7-21

Est-ce que la charge globale nette influence l’activité biologique de la microcine?

-1

+3

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Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25

J25 WK-7-21

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Liste des peptides synthétisés

Peptide Sequence lien Masse (Da) Charge nette

MccJ25* GGAGHVPEYFVGIGTPISFYG 1-8 2 145.0 -1 C1 CGAGHVPCYFVGIGTPISFYG 1-8 2 145.0 0 C2 CGAGHVPEYFVGIGTPICFYG 1-18 2 145.0 -1 C3 GGAGHVPCYFVGIGTPICFYG 8-18 2 145.0 0

1-8L GGAGHVPE------------- - 723.0 -1 1-10C GGAGHVPEYF----------- 1-8 1033.0 -1

NC1 GGAGHVPCYF-GKG---CFYG 8-18 1717.8 +1 NC2 GGAGHVPCYF-KKK---CFYG 8-18 1861.0 +3 NC3 GGAGHVPCYF-WKW---CFYG 8-18 1976.8 +1

9-21L --------YFVGIGTPISFYG-NH2 - 1420.0 0 9-21C --------YFVGIGTPISFYG 9-18 1420.0 0 8-21C -------CYFVGIGTPICFYG 8-18 1540.0 0 7-21C ------KCYFVGIGTPICFYG 8-18 1668.0 +1

WK_7-21 GWKGKWKCYFVGIGTPICFYG 8-18 2410.0 +3

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Concentrations minimales inhibitrices (CMI) des peptides

Souches CMI (µM)

MccJ25* NC1 NC2 NC3 C1 C3 8-21C 7-21C WK_7_21

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 14028 6.5 - - - 125-250 - - - -

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 8387 0.1 - - 31.3 1.0 15.6-31.3 1.0 7.8-15.6 7.8

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 29628 6.5 - 250 - - - - - -

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 8400 0.8 - - - 62.5-125 - - 125-250 62.5

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 9607 1.6 - - - 250 - - - -

Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 9700 0.4 - - - 250 - - - -

Escherichia coli ATCC 11229 0.2 - - - 62.5 - 125-250 - 250

Escherichia coli ATCC 25922 3.3 - - - 250.0 - - 250 - Escherichia coli ATCC 15144 - - - - - - - - -

Escherichia coli O157 H7 ATCC 35150 - - - - - - - - -

Escherichia coli MC4100 ATCC 35695 6.5 - - - 31.3-62.5 - - 125 -

Escherichia coli DH5a 6.5 - - - - - - - - Escherichia coli LR 05 - - - - >250 - - >250 >250

Listeria ivanovii HPB28 - - - - >250 - - >250 250

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0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

3.00 30.00 300.00

OD

595n

m

Concentration (µM)

7-21C-2S C1-2S C2-2S C3-2S-1 C3-2S-2 1-8L 8-21C-2S 9-21C-2S 9-21L 1-10C

Activité inhibitrice contre E. coli

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Activité inhibitrice contre S. enterica ATCC 8387

0

20

40

60

80

100

MccJ25 C1 C3 NC3 8-21C 7-21C WK_7_21

Inhi

bitio

n (%

)

0.5 µM 7.8 µM

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Activité inhibitrice contre Listeria ivanovii par les peptides actifs à250µM

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 4 8 12 16 20 24

Dens

ité o

ptiq

ue (5

95nm

)

Temps (Heures)

Control C1

7-21C WK_7-21

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Potentiel électrostatique (Face A)

Microcin J25 WK_7-21

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Potentiel électrostatique (Face B)

Microcin J25 WK_7-21

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Structure secondaire

expériences de dichroïsme circulaire :

La structure secondaire des peptides actifs est

très similaire à celle de la microcine J25

(structure en feuillet + coudes β)

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CONCLUSIONS

R1: oui, la structure en Lasso est importante mais non essentielle à l’activité biologique de la microcine.

R2: Non, la boucle joue un rôle important dans l’activité antimicrobienne de la microcine (C1) mais sa délétion n’abolit pas totalement l’activité inhibitrice (7-21)

R3: La substitution de certains acides aminés pour augmenter la charge globale semble améliorer l’activité de la microcine et étendre son spectre d’action pour le Gram+ (WK-7-21)

PERSPECTIVES

Les nouvelles molécules peuvent être synthétisées à grande échelle avec des rendement élevés

Ouvrent la porte à des applications de ces molécules dans plusieurs domaines (alimentaire, médical et vétérinaire) où la recherche de ces nouvelles molécules est de plus en plus urgente.

REMERCIEMENTS

François Bédard

Eric Biron

Pedro Alvares

Muriel Subirade

Fond québécois de recherche sur la nature et les technologies (FQRNT-Équipe)

Destruction of membrane potential

Nucleolytic and related activities

Inhibition of protein synthesis

Out

In

Leakage of cellular content

(ions, ATP)

insertion and pore formation

Nisin

Lipid II

Pediocin

Man-PTS

Electrostatic interactions

Translocation into the cytoplasm (e.g. colicins)

Bacteriocin

OR

Target recognition

Mem

bran

e

e.g. Sakacin

Receptor

or

+ + +

- - - -

-

Attraction électrostatique

Perturbation de la

membrane Insertion bioénergétique

et interaction

Peptides antimicrobiens: Mode d’action général

+ +

D’une manière générale le mode d’action se situe au niveau de la membrane :