Translocation des protéines

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PHYSIQUE CELLULAIRE - 4 - TRANSLOCATION DES PROTÉINES Jean-Pierre HENRY 21 Mars 2008

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Page 1: Translocation des protéines

PHYSIQUE CELLULAIRE- 4 -

TRANSLOCATION DES PROTÉINES

Jean-Pierre HENRY21 Mars 2008

Page 2: Translocation des protéines

Hypothèse de travail:

Au niveau : reticulum endoplasmique,mitochondries, bactéries, chloroplastes

la translocation est linéaire• La spécificité est donnée par une

préséquence (souvent clivée aprèstranslocation)

• La protéine (précurseur) passe linéairement• Le passage s’effectue au niveau d’un pore

aqueux

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Description biochimique rapide:Mitochondrie

H+ADP ATP

H+

ATP synthase

Respiratorychain

Presequence

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Importation mitochondriale:description biochimique (2)

• Importation post-traductionnelle: synthèsecytoplasmique sur polysomes

• Préséquence :– En N-terminal– Environ 20 résidus, avec résidus basiques et jamais acides

• La préséquence greffée en N-ter d’une protéinepassagère (DHFR) la dirige vers la mitochondrie

• Il existe des compartiments multiples : rôle de lapréséquence

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Importation mitochondriale:description biochimique (3)

PrécurseurProtéineclivée

Mitochondries 0 + +

Protéinase K 0 0 +

• L’importation est signée par: i) la protection contre la protéinase K; ii) laperte de la préséquence

• L’importation requiert: i) de l’ATP mitochondrial et cytosolique; ii) un ΔΨ

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Importation dans le reticulum endoplasmique:description biochimique rapide

•L’importation est co-traductionnelle•Elle nécessite une préséquence en N-ter (séquence leader), àcaractère essentiellement hydrophobe•La préséquence est généralement clivée après l’importation

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LA TRANSLOCATION A LIEU ÀTRAVERS UN CANAL AQUEUX

Mise en évidence sur le reticulumendoplasmique

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La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (1)

Principe: mettre une sondefluorescente à des endroitsdéfinis pour sonderl’environnement

• mARN de longueur définiepour avoir une protéineconnue (1)

• tARN lysine modifié sur NH2par NBD pour avoir unmarqueur à des positionsdéfinies (2)

• Analyse par temps de vie defluorescence (3)

Crawley et al, Cell(1994) 78, 461; Hamman

et al, Cell (1997) 89, 535

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• la terminaison de lasynthèse requiert descodons spécifiques

• en leur absence, lachaîne reste attachée ausite P du ribosome

• l’élongation se fait parun tARN chargé par unacide aminé

• on peut modifier le NH2en position ε d’un tARNchargé par le NBD

Données biologiques

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La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (2)

Résultats:• Ribosomes sans membrane:

– NBD dans l’eau– Accessible à KI (quencher)

• Ribosomes + Membrane– NBD dans l’eau– Accessible à KI après perméabilisation

(SLO), seulement si > 70 résidus– D’après la taille des quenchers, le

canal aurait 40 Å de diamètre

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La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (3)

Conclusions;• La préséquence et la chaîne sont dans un

environnement aqueux, inaccessible à partir ducytoplasme

• Le ribosome et la membrane forment un canalcontinu

• Une longueur minimale est nécessaire pour émergerdu canal

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Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (1)

• On utilise le même protocole:protéine de longueur variablefixée au ribosome (pas determinaison)

• On ajoute un site de N-glycosylation et on cherche lalongueur minimale permettant laglycosylation

• Comme témoin, on ajoute de lapuromycine: libération duribosome et glycosylation

RM: membrane de reticulum

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Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (2)

Résultats:• La glycosylation nécessite 65

résidus entre le ribosome (siteP) et l’enzyme OST

• La microscopie électroniqueindique que cette distance estde 200 Å (ribosome 150 Å +membrane 50Å)

• Soit 200 Å/65 = 3,1 Å/résiduHélice α: 1,5 Å/résiduConformation étendue: 3,5 Å

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MISE EN ÉVIDENCEÉLECTROPHYSIOLOGIQUE DU PORE

• Cas du reticulum• Cas de la mitochondrie

– Membrane externe : le PSC– (Membrane interne : TIM23)

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Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (1)

• On utilise l’approche bicouches planes: mesure du courant entre 2compartiments à potentiel imposé

• On fusionne des microsomes (vésicules de reticulum rugueux) avec labicouche préformée

Simon and Blobel, Cell (1991) 65, 371

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Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (2)

• A V = 0, après la fusion, aucun courant: le pore serait obstruépar les chaînes en croissance bloquées au site P

• La puromycine est une drogue qui force la terminaison: elleinduit le relargage des chaînes et libère le pore.

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Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (3)

• Conductances mesurées après addition de 100 ou 0,3 µM depuromycine

• A 0,3 µM, on distingue des évènements quantiques, d’unevaleur unitaire d’environ 200 pS dans les conditions ioniquesutilisées (canal de grande taille)

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Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (4)

• L’addition de KCl à 300mM de concentration finaledécroche les ribosomes dela membrane microsomiale

• On observe alors unefermeture du canal

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LE SYSTÈME D’IMPORTATION DE LAMEMBRANE EXTERNE DE LA

MITOCHONDRIE (TOM)

Le « Peptide Sensitive Channel »PSC

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La méthode d’observation initiale

Une autre méthode d’observation:le « dip-tip »

• Le bain contient des fragmentsmembranaires (vésicules) avecdes canaux; une monocouche seforme en surface

• Une pipette de patch-clamp estsortie du bain: formation d’unemonocouche à la pointe

• La pipette est rentrée dans lebain : apposition desmonocouches

Thieffry et al (1988) EMBO J ,7, 1449

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• Activité rapide

• Canal de grande taille;220 pS

• Structure dimérique

• Faible sélectivitécationique

• Dépendance vis-à-visdu potentiel

Le PSC de mitochondries de corticosurrénales

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Dépendance (/potentiel) de la probabilitéd’observation des 3 états

Etat 3 (dimère)

Etat 2 (monomère)

Etat 1 (fermé)

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Caractéristiques du PSC

• Le PSC est présent sur toutes les mitochondriestestées

• Il peut prendre des formes différentes: chez la levure,il n’y a pas les fermetures longues

• Il est présent uniquement sur la membrane externedes mitochondries

• Il est observable par d’autres techniques comme lesbicouches planes ou le patch-clamp de vésiculesgéantes

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Le PSC est inhibé par des peptides basiquescomme les préséquences mitochondriales

NOTRTGAECKQTMLTQRpRIHBYESNKGCIKRCIHPKIVHRKCNCKIReduced MCDYESYGGFLRRGFKVVTDynorphin B

PEPTIDES

YESMLSKLASLQTVAALRRGLRTSVASATSVATKKTE

(1-34) p-Ornithineaminotransferase

YESMLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRpL4(1-22)YESMLSLRQSIRFFKPATRpL4(1-16)

YESMLSLRQSIRFFKYpL4(1-12)YCyt c oxidase subunit4PRESEQUENCES

PSCINHIBITION

SEQUENCEPEPTIDES

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Effet de préséquences sur le PSC de levure

• Le canal est observé parDip-tip, puis transféré dansun bain contenant le peptide

• (haut) Fermetures induitespar une préséquence de 16résidus; l’effet est maximal à+ 10 mV

• A - 50 mV, les fermeturessont plus nombreuses, maisleur durée est plus courte

• (bas) Durée des fermeturespour le peptide de 16 résiduset pour un peptide de 13résidus

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Interprétation du blocage

• A V > 0, le peptide cationique estfaiblement attiré dans le canal :blocages peu nombreux

• Quand V diminue, le nombre maisaussi la durée des blocage augmentent

• A V = 10 mV, l’attraction est suffisantepour que le peptide franchisse le canal :la durée des blocages diminue

• A V < 0, le nombre des blocagescontinue à augmenter et leur durée àdiminuer

• Les peptides d’adressage passent àtravers le PSC

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Les fermetures proviennent d’interactions avecdes peptides

• Le transfert d’un PSC de levure maintenu à - 30 mV dans un bain contenantune préséquence de 22 résidus montre des fermetures rapides (passage dupeptide) et après lavage, des fermetures longues, mimant le PSC demammifère

• L’opération peut être répétée : les « portes » ne sont pas covalentes

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Schéma d’interprétation des fermetures du PSC

Trypsin

Cytosol

Intermembrane spacePSC

Presequence Modèle:

• le système detranslocation comportedes sites de liaison surles 2 faces

• Chez les mammifères,on isole le PSC avec despeptides-signal liés

• Ces peptides donnentdes fermetures

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Energétique et vectorialité du transportmitochondrial

• Pour une protéine de la matrice, transport à travers 2 membranes; lessystèmes d’importation sont couplés de manière dynamique

• Des chaperons cytosoliques maintiennent la protéine déroulée à l’extérieur• Le potentiel facilite le passage de la préséquence• Des chaperons mitochondriaux capturent la protéine importée, biaisent le

mouvement brownien et facilitent la renaturation

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Principe du cliquet brownien

• La chaîne déroulée est soumise aumouvement brownien au cours deson passage à travers le pore

• Dés leur translocation, lesséquences sont prises en chargepar des chaperons ou des enzymes

• Ces liaisons ou modificationsempêchent le retour de la chaîne etdonnent la directionalité

• Dans le reticulum, le ribosomepousse la chaîne synthétisée et elleest prise en charge en trans

Remarque: au niveau du reticulum, il existe aussi des protéines transportéespost-traductionnellement. Chez les bactéries, le mode post-traductionnel estdominant

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Biochimie simplifiée des systèmesd’importation mitochondriaux

• Les 2 systèmes TOM et TIM ontété purifiés et reconstitués enmembrane

• Les activités « canal » de TOM etTIM sont portées par,respectivement, TOM40 et TIM23

• TOM purifié et reconstitué al’activité PSC (Kunkele et al(1998) J Biol Chem 273, 31032)

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Vision biochimique plus complète

• TOM: le canal (TOM40, PSC)s’associe avec des récepteursdifférents selon la protéine etsa destination

• TIM: il existe un secondsystème, responsable del’insertion dans la membraneinterne

• TIM23: il existe tout unsystème ATP-dépendant pour« tirer » sur la protéine

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Morphologie du système TOM purifié

• TOM purifié à partir de mitochondries de Neurospora• Présence de 2 dépressions avec des diamètres de 20 Â ,

compatibles avec la conductance du PSC• Le PSC, comme TOM, a une structure dimérique

Kunkele et al (1998) Cell, 93, 1009

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UN SYSTÈME DE LA MEMBRANEINTERNE (TIM)

Activité canal de TIM23

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Activité canal de TIM23

TIM23 (levure), purifié et reconstituéen bicouche, est un canal

• Grande taille (> 150 pS)• Cationique (sélectivité PK+/PCl- = 16)• Ouverture induite symétriquement

par le potentiel• Fermeture à temps longs

Truscott et al (2001) Nature Struc Biol, 8, 1074

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Le canal de TIM23 est bloqué par despréséquences

• Activité testée par une rampede potentiel, milieuasymétrique en KCl (gradient x10, bicouches planes)

• L’addition de préséquence ducôté espace intermembranaire(KCl faible) entraîne unefermeture (a)

• Addition du côté matriciel, peud’effet (b)

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Effet d’une préséquence et de TIM50

Activité de TIM23, bicouche plane, V =0, gradient de KCl

• TIM23 seul, courant dû au gradientde K+

• La partie soluble du partenaire TIM50présent dans l’espaceintermembranaire ferme le canal

• La présequence mise du même côtéavec TIM50 donne des ouverturesrapides

• L’activité canal est régulée par unpartenaire: ouvertures brèvespermettant le maintien du Δµ H+

Meinecke et al (2006) Science, 312, 1523

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TRANSLOCATION DANS LERETICULUM ENDOPLASMIQUE

Rôle central de Sec61:• Trouvé dans les microsomes de chien et de levure• Homologue de SecY permettant la sécrétion des

protéines chez E coli• Possède des résidus hydrophiles dans des segments

transmembranaires

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Rôle de Sec61: Biochimie

• Purification à partir des microsomes de chien– Solubilisation(digitonine) de membranes avec des

ribosomes– Détachement des ribosomes par la puromycine– Purification

• Membranes déplétées en Sec61: perte du transport;la reconstitution restaure le transport

• Purification des autres activités pour avoir le systèmeminimal

• Activité minimale : Sec61, Récepteur de SRP(SRPr),et , pour certaines protéines TRAM

Gorlich and Rapoport (1993) Cell, 615-630

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DONNÉES STRUCTURALES

Structure atomique d’un analogue de Sec 61:Le canal de translocation des protéines d’une

Archeubactérie

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Organisation générale

• Le complexe est équivalent à Sec61 ; 3 sous-unités: α avec 10 TM, β et γchacun 1 TM

• (à gauche) vue depuis le cytosol; (à droite) vue en coupe• (à gauche) forme générale d’un carré, limité sur 3 côtés par βγ• (à droite) partie importante dans la membrane; dans le cytosol, on trouve les

extrèmités et 2 boucles d’ancrage du ribosomeVan den berg et al (2004)Nature,427, 36

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Pseudo-axe de symétrie

• Il y a un pseudo axe de symétrie dans le plan de la membrane• Les TM 1-5 et 6-10 occupent des positions symétriques• On distingue une face avant (à gauche) susceptible de s’ouvrir

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Eléments importants de la structure

• En coupe, structure en sablier hydrophile au milieu de la membrane• Le TM2 a une structure originale: 2 demi-hélices avec TM2a fermant la

structure (plug)• TM2a pourrait se coller contre γ dans la forme ouverte• Au milieu de la membrane, rétrécissement (pore ring) de 20-25 Å à 5-8 Å;

anneau hydrophobe (presse-étoupe)

Page 44: Translocation des protéines

Vue synthétique

Le schéma met en évidenceles points importants:

• La structure en sablier• L’existence d’un anneau

central au niveau durétrécissement

• La présence d’unbouchon obstruant lepore central

• Le canal au repos estfermé

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Le canal au repos est fermé (1)

• La protéine purifiée est inséréedans un dispositif debicouches planes (sanssolvant)

• Pas d’ouverture de canaux (onestime qu’il y a plus de 106

protéines dans la membrane)• Le contrôle est la membrane

seule• Le canal fermé est

imperméant aux ions et à H20

Saparov et al (2007) Mol Cell 26, 501

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Le canal au repos est fermé (2)

• Des cystéines sont introduites en position 67 et 120• En présence de l’oxydant, un pont disulfure se

forme, qui bloque le canal dans la position ouverte• Avec le réducteur, re-fermeture.

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Ouverture latérale du canal (1)

• La structure est capable de s’ouvrir sur sa face avant, entre TM2b et TM7: ily aurait une « respiration » du complexe

• La préséquence hydrophobe se collerait sur l’interface TM2b/TM7; pendantune ouverture; elle passerait dans la phase membranaire

Page 48: Translocation des protéines

Ouverture latérale du canal (2)

• Modélisation moléculaire(10-20 ns)

• L’ouverture nécessite uneforce de 2-3 nN

• Cette force estprincipalement due àl’interaction avec les lipides

• Durant l’ouverture, il n’y apas d’influx de lipides

• La relaxation est spontanée

Gumbart and Schulten(2007)Biochemistry 46, 11147

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Schéma de translocation des protéinessolubles (1)

• La préséquence (hydrophobe) selie à l’interface TM2/7, à l’avant

• La structure s’ouvre mettant lapréséquence dans les lipides

• Ce mécanisme déclenche lemouvement de TM2a et l’ouverturedu pore

• La préséquence est clivée et lachaîne rentre dans la lumière

• Le pore se referme

Page 50: Translocation des protéines

Schéma de translocation des protéinessolubles (2); dynamique moléculaire

Le peptide (bleu) est (Ala)10

Gumbart and Schulten (2006) Biophys J, 90, 2356

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INSERTION DES PROTÉINESMEMBRANAIRES

Rôle de Sec61

Page 52: Translocation des protéines

Insertion des protéines membranaires

• Le système Sec61 joue un rôle important dansl’insertion des protéines membranaires en hélice α

• Le segment transmembranaire joue le rôle deséquence-signal nonclivée

• Dans le cas des protéines polytopiques (plusieurssegments transmembranaires), l’insertion se faitsegment transmembranaire après segmenttransmembranaire

Page 53: Translocation des protéines

Sec61 et l’insertion des protéines membranaires

• La séquence-signal pourrait se fixer sur le site hydrophobe dans les 2orientations (selon la séquence)

• Si la séquence n’est pas clivée, on aura une insertion selon les 2orientations

• Dans les 2 cas, la chaîne doit sortir du canal ribosomial

Page 54: Translocation des protéines

Sec61 et l’insertion des protéines membranairesprotéines polytopiques

• Les séquences TM àinsérer servent deséquence-signalinternes non clivées

• A chaque fois, on doitavoir l’ouverture ducomplexe Sec61 etl’ouverture du canalribosomial