La Triploïdie chez la moule bleue

permet-elle un meilleur attachement

?

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Présenté par: Kevin Osterheld

Directeur: Réjean TremblayCo-Directeur: Luc Comeau

ACRDP Project Number 17-G-03

Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Problématique: Affaiblissement du byssus/Décrochage

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Problématique: Affaiblissement du byssus/Décrochage

Impacts du décrochage

• Perte des moules/production/bénéfices

• Augmentation des concentrations de moules

• Prend du temps

• Production de déchets (moules)

• Consommation de nourriture → ↗ compétition

•↗ apport matière organique au fond

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Besoins énergétiques pour la gamétogénèse et la byssogénèse

Gamétogénèse

• Coût des dépenses énergétiques 50-90%

• Forte consommation des lipides

• Énergie via alimentation, mais aussi forte utilisation des réserves énergétiques

Byssogénèse

• Coût des dépenses énergétiques 8-15%

• Importante utilisation du budget carbon et azote (44 and 21%)

• Production durant toute l’année

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

• Coût énergétique de la gamétogénèse• > 50% de l’énergie

• Coût énergétique de la de la byssogénèse• Jusqu’à 8-15% de l’énergie

• Jusqu’à 44% du carbone

• Jusqu’à 21% de l’azote

• Réduction de la force d’attachement (~ 32% après 1 semaine) (Lachance et al. 2008)

• Diamètre plus fin

• Changement de la composition en acides aminés (ex.↓histidine)

Gamétogénèse/ponte

Coûts de la gamétogénèse et effets sur le byssus

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

• Facteurs individuels• Réserves énergétiques

• Nombre de fibres

• Diamètre des fibres

• Composition et qualité des fibres• Acides Aminés

• Métaux

• Stade de développement • Jeunes/petites moules → Plus grand

nombre de fibres

• Grandes moules → Plus grande force des fibres (qualité)

• Facteurs environnementaux• Vélocité et température de l’eau

• Effet des vagues

• Disponibilité de la nourriture

• …

Facteurs influençant la force d’attachement du byssus

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Impacts de la triploïdie chez les bivalves

• Réduction de la fertilité/stérilité• Déformation des gamètes

•↘ Investissement dans la reproduction

• Redistribution du budget énergétique

•↗ Croissance

• Meilleur système immunitaire

• Meilleure qualité de chair (toute l’année)

• Plus d’énergie disponible pour la byssogénèse ?

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Réserves Énergétiques

Cro

issa

nce

Gam

éto

gén

èse

Bys

sogé

nès

e

2n: Faible Gamétogénèse

2n: Forte Gamétogénèse

3n: Toute l’année

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Réserves Énergétiques

Réserves Énergétiques

Cro

issa

nce

Gam

éto

gén

èse

Bys

sogé

nès

e

Cro

issa

nce

Gam

éto

gén

èse

Bys

sogé

nès

e

Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Extrusion of polar body in mouse cell

https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Oocyte_Meiosis_Movie_1

Extrusion des globules polaires et importance pour la triploïdie

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

•Chocs ChimiquesAvantages:

• Efficace• Relativement facile

d’utilisation

Désavantages:• Utilisation de

produits chimiques• Opinion publique• Forte mortalité

•Chocs Thermiques

Avantages:• Facile d’utilisation • Non toxique/chimique• Opinion publique

Désavantage:

• Efficacité modérée

Méthodes d’induction de la triploïdie chez les bivalves

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Objectif principal

• Déterminer si la triploïdie chez la moule bleue permet une relocalisation de l’énergie pour la production d’un meilleur byssus

avec plus de force

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

1) Produire et améliorer la production de moules triploïdes

2) Comparer la croissance et la survie des moules diploïdes et triploïdes

3) Mesurer et comparer le potentiel de croissance des moules diploïdes et triploïdes

4) Comparer la production de byssus des moules diploïdes et triploïdes

Objectifs

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Récupération des gamètes et fécondation

Prélèvement des géniteurs sur IPE

Mai

nte

nu

à 1

2°C

Conditionné pour la ponte Récupération des gamètes

Ponte

Fertilisation (1 oeuf/10 sperm.)

Après une période spécifique post-fertilisation: Application du

traitement pour induire la triploïdie

Comptage des gamètes

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Induction de la triploïdie :Mesure de l’efficacité du traitement par cytomètrie de flux

Diploïde

Diploïde

Triploïde

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Induction de la triploïdie :

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

% T

rip

loïd

es

Croissance et survie des larves diploïdes/triploïdes

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

(Group 1) (Group 2)

• Conditionnement des moules diploïdes/triploïdes (Pernet et al. 2008)

• 18°C

• Bas, haut régime

• Potentiel de croissance• Investissement pour la croissance

• SG = EF – (R + Ex)

Investissement métabolique : Potentiel de croissance

• SG = Potentiel de croissance• E

F = Énergie assimilée par ingestion; estimée comme

le clearance rate• R = Énergie perdue via la respiration• Ex = Énergie perdue via l’excrétion

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Potentiel de croissance

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SFG

Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Mesure de la production des fibres de byssus

Après 3 jours: Comptage des fibres de byssus

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Moules soumises à un flux d’eau continu (10 m/s) pendant 3 jours

TriploïdeDiploïde

Différence dans la production des fibres (Diploïdes/Triploïdes)

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

TriploïdeDiploïde

• Les chocs chimiques sont plus efficaces pour induire la triploïdie chez M.edulis.

• Les larves de moules triploïdes ont un avantage de croissance.

• Il y a une tendance pour un meilleur potentiel de croissance des moules triploïdes juveniles.

• Les moules triploïdes produisent 1.5-2x plus de fibres de byssus.

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Problématique Introduction Méthodes/Résultats Conclusion

Conclusion

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Merci de votre attention!

Questions?

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Statistics

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• Chapter 1 : T-test• Assumption of normality and homoscedasticity : Shapiro-Wilk’s and Bartlett’s test respectively

• Chapter 2 : Two ways ANOVA (scope for growth, VO2 measurement); T-test (Lipids, glycogene, and protein contents)• Assumption of normality and homoscedasticity : Shapiro-Wilk’s and Bartlett’s test respectively

• Chapter 3 : Two ways ANOVA • Assumption of normality and homoscedasticity : Shapiro-Wilk’s and Bartlett’s test respectively

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Tensiometry and byssus resistance

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Shell weight and shell resistance of diploid and triploid mussels

Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

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Sample 6-DMAP 400µM (78% triploids) after 8 months

• Increase of triploids/diploids ratio• Better survival

• Better use of energetic resources

• Better food assimilation

• Better resistance to stress

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Ploidy levels after 5 days and 8 months

Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

Shell weight and shell resistance of diploid and triploid mussels

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Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

Filtration and food assimilation

• Every 20min algae content is measured (during 1h)

Filtration Collection of feces

Dry at 70ᵒC and weighted

Burn at 450ᵒC and weighted

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Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

Larvae survival until settlement

Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

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Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

• Measurement of gametes development during the reproductive cycle

• Measurement of lipids, glycogen, proteins contents

• Measurement of VO2

• Measurement of scope for growth

Energetic investment

Diploid Triploid

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Filtration and food assimilation

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Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

Alternate for 8h-16h

AQUABOX

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Metabolic investment: Mussels’ VO2

measurment

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Modified from Arnold et al. 2013

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

From Smeathers and Vincent 1978

• Byssus is produce by the byssal gland in the foot1) Root of the byssus2) The stem3) Ring threads4) Corrugated proximal part of the

byssal threads5) Smooth distal part of the byssal

threads6) Adhesive disc or Adhesive plate

Composition of byssal threads

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1) Amino acid content determined based on the pool of 10-15 threads/ind

2) Hydrolyzation of byssal proteins and extraction (Bouhlel et al 2017)

3) Measurement of amino acids with ‘’Water Acquity ultra-performance liquid Chromatography’’ (UPLC)

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Composition of amino acids

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• Heat Shock• Highly efficient• No toxicity• Mortality

• Working temperatures: 25-30°C

• Cold Shock• Modest efficency• No toxicity• Lower mortality

• Working temperature: 1°C

Thermic Treatments:

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Methods for triploidy induction in bivalves

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Triploid (3n)

Inhibition of 1st polar body (2n)

Inhibition of 2scd polar body

(2n)

Thermic shock

Chemical treatments

6-DMAP (200-400µM)

CB (0.5-1 mg/L)

Cold shock (1 °C)

Heat shock (27 °C)

Breeding

4n♂ x

2n♀

Tetraploid (4n)

Inhibition of both polar

bodies (2n x 2n)

Breeding (3n x 2n) + inhibition scd

polar body

Inhibition of the 1st

mitosisTriploid (3n)

Inhibition of 1st polar body (2n)

Inhibition of 2scd polar body

(2n)

Thermic shock

Chemical treatments

6-DMAP (200-400µM)

Cold shock (1 °C)

Heat shock (27 °C)

Inhibition of both polar

bodies (2n x 2n)

Inhibition of the 1st

mitosis

Tetraploid (4n)

Summary of technics for triploidy’s induction

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Induction of triploidy Larval development Size and weight Fiber production Metabolism

Metal composition of byssal threads

1) Metal composition analysed based on the content of 20 mg of dry byssal threads

2) Digestion of byssal threads with a solution of HNO

3 and H

2O

2 at 90°C

3) Metal composition measured by Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) (Bouhlel et al 2017)

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

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Byssus is composed of collagen like proteins: PreCols

• PreCol-P• Elastic proximal region• Protein is flanked by elastin-like domains

• PreCol-D• Rigid distal region• Structure similar to silk-fibroin sequence

• PreCol-NG• Whole thread• Hybrid preCol• Properties of preCol-P and -D

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Composition of byssal threads

Modified from Arnold et al. 2013

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Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Use of tetraploids for induction of triploidy

• Breeding• 4n males x 2n females = 3n

• Induction of tetraploidy• Inhibition of both polar bodies• Breeding of 3n x 2n + 2scd polar body

inhibition

• Inhibition of first mitotic cycle

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• Byssal threads and preCols are rich in histidine content

• Histidine is important for metal binding

• Metals (Fe, Cu, Zn) are important to maintain the properties of the treads• Resistance and elasticity

• Plays a major role in sacrificial bounds and stabilisation of inter-/intra-molecular preCols

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Factor influencing the attachment strength of byssal threads

From Reinecke et al 2016

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• Chemical shock

Advantages:• Efficient

• Relatively easy to handle

Disadvantages:• Use of chemicals

• Public opinion

• High mortality

• Thermic shock

Advantages:

• Relatively efficient

• Easy to handle

• Non toxic/chemicals

• Public opinion

Disadvantages:• Medium efficiency

• Pressure shock

Advantages:

• Non toxic/chemicals

• Public opinion

Disadvantages:• Medium/low efficiency

• Hard to handle

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Methods for triploidy induction in bivalves

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• Cytochalasin B (CB)• Highly efficient• Soluble in DMSO• Toxic • High mortality

• Working conc.: 0.5-1 mg/L

• 6-(Dimethylamino)purine (6-DMAP)• Good efficency• Soluble in water• Low/no toxicity

• Working conc.: 200-400 µM

Chemical Treatments:

VS

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Methods for triploidy induction in bivalves

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• Tension is lower than threshold• Threads are resilient

• Distal region stays rigid

• Tension-rigidity behavior mostly driven by proximal region

• Threshold is exceeded• Reduction of rigidity

• Distal region is deformed• Dissipate energy

• Loss of energy during load cycle

Problematic Introduction Chapter 1 Chapter 2 Chapter 3

Threads behavior depends on tension

From Reinecke et al 2016

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Exemple: effects of treatments for polar bodies inhibition•CB : affects formation of microfilaments/inhibit actin polymerisation

•6-DMAP: inhibits female pronuclear condensation (affects chromosome)

•Heat: affects inhibits formation of microtubule

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Diff growth diploid/triploid

•Triploid grow faster, particularly after 1st year once mature

• Further, they can also grow faster before sexual maturation

• In low growing zones, there is no growth difference between dip/trip

•Hypothesis (Guo and Allen 1994): cell volume is bigger with triploid and thus they need more energy, that’s why they don’t grow more than diploid in region where food is limiting

•Diploid and triploid have different pattern of glycogen use

•Triploid may have a growth advantage during stressing events

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Supplementary info

• In invertebrates neutral lipids (particularly triacylglycerols) are important for storage during nutritional or environmental stress

• Larval growth success has been associated with the sterol composition in food. (Bivalves are unable to synthetise de novo the sterols)

•Embryon’s development depends of lipids provided from the mother

• Larvae use low/few carbohydrate for their development. Most of their energy comes from lipids and proteins

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Supplementary info

• Le facteur commun entre toutes les protéines adhésives est la présence de hauts niveaux de l’acide aminé 3,4-dihydroxyphenol-L-alanine (DOPA)

•DOPA sont des composants clef supposé etre responsable de la chemisorption des polymères au substrat sous l’eau via des cross-linking covalent de l’adhésif

•Byssal precursor proteins derive from holocrine secretion of underlying glandular tissue consisting of the accossory and ‘’white’’ or ‘’collagen’’ glands

• Byssus can resist water velocity over 10m/s and acceleration over 400 m/s^2

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Supplementary info: gametogenesis and sterility•Gametogenesis state will be measured with Marteli Scale

•Reduced fertility is due to appariment’s trouble during meiosis

•Gametogenesis impacts the VO2 consumption

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Supplementary info:

•DNA stain for flow cytometry : propidium iodide (50uM/mL)

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50

51Modified from Gosling 2015