Post on 26-Jan-2021
Exploration des réponsesimmunitaires
ED L3Février 2015
Tissus
MicrobesBactéries, virusparasites, champignons
AgressionPlaie, effractionInflammation
Macrophage
Polynucléaire N
Lymphocytes T
NK
Immunité Innée Immunité adaptative
Périphérie Organes lymphoïdesGanglion
Monocyte
Lymphocyte B
Plasmocyte
CD4 CD8
Réponse immunitaire
Cellulaire
HumoraleCellule Dendritique
Phagocytose Migration
Complément
Immunité Innée/adaptative
Leucocytes
Polynucléaires neutrophilesPolynucléaires éosinophilesPolynucléaires basophiles
Lymphocytes
Monocytes
Hémogramme
4 000 - 10 000/mm3
1 700 - 7 00050 - 5000 – 50
1 500 - 4 000
100 - 1000
Immunitéinnée
Immunitéinnée
Immunitéadaptative
Leucocytes
Polynucléaires neutrophilesPolynucléaires éosinophilesPolynucléaires basophiles
Lymphocytes
Monocytes
4 000 - 10 000/mm3
1 700 - 7 00050 - 5000 – 50
1 500 - 4 000
100 - 1000
Barrière cutanéo-muqueuseSubstance bactéricide, pH
Phagocytes: PNN, monocyte
Cellules NK
Cellules dendritiques
Système du complément
Cytokines (interféron)
Immunité innée
NFS
Immunophénotypage
Exploration du complément
Immunité Innée: exploration du complément
Voie classique Voie alterne
Voie des lectines
Complexed’attaque
membranaire
Mesure fonctionnelle: CH50
Mesure protéine du complément:- C3- C4
Immunité Innée: exploration du complément
GR de mouton+ Ac anti GR de mouton+ Sérum du sujet
Voie classique
Activation du complexe terminal
GR de lapin+ Sérum du sujet
Voie Alterne
DO50%
Mesure fonctionnelle: CH50
Lyse du GRMesure de l’Hb libérée
Augmentation: processus inflammatoireDiminution: consommation, déficit
Cellule NK
CD2 CD16CD56
RécepteursInhibiteurs
Récepteursactivateurs+
<
Cellule NK
CMH I
NK activée
CMH II
CD25
CelluleTumorale
Ouinfectée
CMH I
Cellule modifiéetuée
Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifique des molécules distribuées sélectivement sur les NK).
Exploration fonctionnelle (cytolyse).
Immunité innée: cellules NK
Etude en cytométrie en flux: CD3- CD56+ (quantitative)
Immunité innée: cellules NK
Etude fonctionnelleMesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif
Marquer les cellules ciblesavec du Na251CrO4
Ajouter les cellules NK (ou T cytotoxiques) aux cellules cibles marquées
Les cellules tuées libèrentDu chrome radioactif
Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites
Ontogenèse lymphocytes T et B
Immunité adaptative
Immunité adaptative
Lymphocyte Bproduction Ac
Lymphocyte Tproliférationcytotoxicité
• NFS
• Cytométrie en flux– Phénotypage lymphocytaire T et B– Marqueurs d’activation lymphocytaire– Marqueurs cellules naïves/cellules
mémoires
• Tests fonctionnels– Prolifération– Production de cytokines– Test de cytotoxicité– Production d’anticorps
Immunité adaptative: cytométrie en flux
Immunité adaptative: cytométrie en flux
• Lymphocytes T: CD3+: 50 - 80%900 – 3000/mm3
• Ly T4: CD3+ CD4+: 32 - 52%450 – 1500/mm3
• Ly T8: CD3+ CD8+: 20 – 40%300 – 1000/mm3
• Lymphocytes B: CD19+: 5 – 20%100 – 450/mm3
Isolement des lymphocytes
- gradient de densité- récupération d’un anneau cellulaire contenant lymphocytes et monocytes
Centrifugation sur unmilieu de séparation de densité Ficoll-Hypaque
Cellules mononuclées
GR, PNN
Exploration immunité humorale
• Cytométrie en flux: • nombre de LB• marqueur de différenciation
• LB naïfs: CD27-/ IgM+/ IgD+• LB mémoire avant commutation: CD27+/IgM+/IgD+• LB mémoire après commutation: CD27+/IgM-/IgD-
• Prolifération
• Etude production d’anticorps• EPP• Dosage des Ig
• Réponse vaccinale
In vitro
In vivo
Exploration immunité humorale in vitro
Dosage des gammaglobulines
Dosage des classes d’Ig:- IgG 6.6-12.8- IgA 0.7-3.4- IgM 0.5-2.1
Dosage des sous-classes d’Ig:- IgG1 3-12.8- IgG2 0.4-6.3- IgG3 0.12-1.14- IgG4
Exploration immunité humorale in vivo
Réponse vaccinale: Sérologies pré et post vaccinales
• Diphtérie• Tétanos• Pneumocoque• Haemophilus
Immunité adaptative: cellulaire
• Cytométrie en flux: • phénotypage lymphocytaire T: CD3, CD4, CD8• marqueurs d’activation lymphocytaire: HLA-DR• marqueur de différenciation
• LT naïfs: CD45RA+/CD62L+• LT central mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L+• LT effecteur mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L-• LT revertant: CD45RA+ ou RO-/CD62L-
• Prolifération
• Production de cytokine• Elisa• Elispot
• Test de cytotoxicité
•Test d’hypersensibilité retardée
In vitro
In vivo
Exploration immunité cellulaire: prolifération
• Activateurs non spécifiques: mitogènes polyclonaux
• phytohémagglutinine ou PHA: lymphocytes T• Concanavaline ou ConA: lymphocytes T• pokeweed mitogen ou PWM: lymphocytes T (et B)
Induisent la mitose de beaucoup de Ly de spécificité différente= prolifération polyclonale
• Activateurs spécifiques
• Antigène de vaccination: tuberculine, anatoxine tétanique• Antigène de l’environnement: streptocoque, CMV
Exploration immunité cellulaire: prolifération
Mesure de la prolifération par incorporation de thymidine tritiée 3TH (radioactive)
Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif)par rapport à sujets sains témoins
Exploration immunité cellulaire: prolifération
CFSE: marqueur fluorescent, rentre dans le cytoplasmeA chaque division cellulaire, la fluorescence diminue de moitié dans chaque cellule fille
Mesure de la prolifération en cytométrie en flux après marquage au CFSE
Immunité Innée
Orientation de la réponse immunitaire
Cytokines: orientation de la réponse immunitairecellulaire
T CD4Naïf
GATA-3STAT-6
T-betSTAT-4
RORgTSTAT-3
FoxP3
IFNγ
IL4
IL17
TGFβ1
Cellulaire(pathogènes à xIntracellulaire
Humorale(pathogènes à xExtracellulaire
Neutrophile(pathogènes à xExtracellulaire
Régulation Négative
TH1
TH2
TH17
Treg
IL12
IL4
TGFβ1
TGFβ1IL6
Thymocyte
Polarisation de la réponse T
Cytokines: orientation de la réponse immunitairecellulaire
Activation des cellules en culturenon spécifique / spécifique
Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h
- Dosage Immunoenzymatique- Dosage Cytométrie en flux
Quantification des cellulesCD4+/CD8+ productrices- Cytométrie en flux- ELISPOT
Mesure production de cytokines par cellules immunitaires
Exploration immunité cellulaire
Exploration immunité cellulaire
Production de cytokines
Activation de cellules en culture (non spécifique ou spécifique)
Récolte du surnageant de culture après 24-48h
Dosage ELISA ou en CMF
Exploration immunité cellulaire
Production de cytokine: ELISPOT
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
IFNγ
Peptidesou antigène
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Y Y
PAL PAL
substratjaune
violet
Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulation- par des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiques- par des Ag ou des peptides de 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques
Exemple du Quantiféron
Exploration immunité cellulaire
Hypersensibilité retardéeExemple du test à la tuberculine
Injection intra-dermique de tuberculine (extrait de Mycobactérium tuberculosis)
Immunité à médiation cellulaire
Réponse locale (papule rouge indurée) à lire 72h après:5mm: réaction positive: contact antérieurphlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection
Histologie: lymphocytes T et nombreux monocytes/macrophages
Immunité adaptative: cellulaire
Hypersensibilité retardéeExemple du test à la tuberculine
Traduction histologique: granulomeprésence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages
Exploration des réponses�immunitairesDiapositive numéro 2Diapositive numéro 3Diapositive numéro 4Diapositive numéro 5Diapositive numéro 6Diapositive numéro 7Diapositive numéro 8Diapositive numéro 9Diapositive numéro 10Diapositive numéro 11Diapositive numéro 12Diapositive numéro 13Diapositive numéro 14Diapositive numéro 15Diapositive numéro 16Diapositive numéro 17Diapositive numéro 18Diapositive numéro 19Diapositive numéro 20Diapositive numéro 21Diapositive numéro 22Diapositive numéro 23Diapositive numéro 24Diapositive numéro 25Diapositive numéro 26Diapositive numéro 27Diapositive numéro 28Diapositive numéro 29Diapositive numéro 30