Différenciation endothéliale et processus angiogéniques

Pr Philippe NGUYENEA3801 et Laboratoire d’Hématologie

Université de Reims

Champagne Ardenne CHU de ReimsEA3801

Cellule endothéliale

Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µmÉpaisseur :0,3 µm)disposées en mosaïque

- Corps de Weibel Palade (ME)- Facteur Willebrand- PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144)- Synthèse de NO (eNOS)- JAMS/Esélectine/VEGFR2

1 à 6 10 13 cellulesPoids total : 1 kgSurface : 1 à 7 m2

AngiogénèseANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE :• angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin • vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux• artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance)

HypoxieMigration / Prolifération

Différenciation

HIF-1Facteurs de croissance/Cytokines

VEGF, FGF, IGF…

• Cellule progénitrice endothélial : –  endothelial progenitor cell (PEC)

– Différenciation et acquisition d’un phénotype endothélial à partir d’une cellule souche hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997]

– Circulating bone marrow-derived endothelium progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] :• CD34+• Marqueurs phénotypiques : facteur von

Willebrand, Dil-Ac-LDL.

Sang de cordon

1. Isolement des PBMC

3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives

2. Élimination des cellules adhérentes

4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …) 

Isolement des cellules CD34+

Analyse de l’expression membranaire et moléculaire à différent temps de la différenciation:

VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT

Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs endothéliaux (PEC)

Cellule souche CD34+

Progéniteurs endothéliaux

J0 J25-30Facteurs de

croissance

(VEGF…)

Caractérisation des PEC

• Culture cellulaire– À partir de sang de cordon, de sang périphérique

– Support :

• gélatine, fibronectine, collagène de type I

– Facteurs de croissance :

• VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B

– Temps d’obtention – Aspect des colonies :

• Cellules adhérentes « spindle shaped »

• Tapis de cellules fusiformes

précoces

tardives

Phénotype des PEC

• CD133 (AC133) :– Exprimé par la CSH– Absent de la cellule endothéliale mature et

du monocyte– Différenciation endothéliale in vitro

• CD34 : – marqueur de cellule souche hématopoïétique– Présent (faible expression) sur la cellule

endothéliale mature• VEGF-R2 (KDR) :

– Marqueur endothélial

VEGFR2

EPC

HUVEC

CD34

Co

un

tCD34

CD34

EPC

HUVEC

Co

un

t

Phénotypage des PEC par cytométrie en flux

CD34 : PBMC de sang de cordonPEC : en milieu de culture adaptéHUVEC : Cellules endothéliales matures

EA3801

Origine (multiple) des précurseurs endothéliaux

HSC

Progéniteurs Myéloïdes

Progéniteurs Endothéliaux

Hémangioblaste

Monocyte

Progéniteurs endothéliaux circulants

Monocyte

PEC

CD14+

CD14+,CD34low, KDR+

Sous-type myéloïde

CD34+, CD133+, KDR+

« True angioblast »

PEC

CD34+

Leri, Circ Res 2005

Origine et différenciation des progéniteurs endothéliaux, d’après Dimmeler, 2004.

• Mesure de la prolifération• Expansion• Migration cellulaire• Formation de tubes : (Matrigel)Formation de tubes : (Matrigel)• Activité paracrine :

– synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF, GM-CSF

• Modèles animaux :– Implant de Matrigel– Modèle d’ischémie de la patte (ligature de l’artère

fémorale)

Caractérisation des PEC

Rehman, 2003 ; Hur, 2004

X 40

Sources possibles de cellules endothéliales

– Cellules souches : CSH, cellules souches « cardiaques », cellules souches mésenchymateuses,

– Cellules myéloïdes : • CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- :• Acquisition de marqueurs endothéliaux

phénotypiques• Formation de tubes in vitro

– Cellules endothéliales matures :• shedding vasculaire

Mobilisation des « PEC »

Cellules stromales médullaires

Hémangioblaste

cKit+

PEC circulantsPrécurseur hématopoïétiquecirculants

mKitL MMP-9

sKitL

Moelle osseuse

Sang

Barrière endothéliale

D’après Hristov, 2003

Mobilisation des PEC

• Micro-environnement, « niches » :– Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales

• Protéinases :– Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases

matricielles (MMP)– Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par

MMP-9

• Facteurs de croissance– G-CSF, GM-CSF, EPO– SDF-1, VEGF, angiopoïétine

Processus de réparation endothéliale par les PEC

intégration

PEC

CE

CML

TransdifférenciationD’après Hristov, 2003

Matrice extracellulaire

Cellule endothélialeCirculante (CEC)

CD146 +

CD31 +

vWF+

Comparaison CEC versus PEC

• Cellule mature, provenant de la paroi vasculaire

• Témoin d’une lésion vasculaire

• Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31…

• Pas d’expression des marqueurs CD45/CD133

• Pas de potentiel clonogénique

• Progéniteur• Témoin d’une lésion

vasculaire ? D’une régénération ?

• Faible expression de CD146, CD31

• Faible expression de CD45, expression de CD133

• Potentiel clonogénique

CEC PEC

20 cellules/mL

Dimmeler, 2004

Différents phénotypes endothéliaux

• Cellule « tip »– Leader– Filopodes étendus– Signaux de direction– Migration à travers la matrice

extracellulaire• Cellule « stalk »

– Prolifération– Vacuoles créant la lumière

vasculaire– Produit la matrice

• Cellule « phalanx »– Devient quiescent– Monocouche– Jonctions serrées– Contact avec le péricyte

Induction et déstabilisation de la paroi capillaire

• Induction par hypoxie– HIF : complexe hétérodimérique sensible à

l’hypoxie– En hypoxie : dimérisation et activation des

gènes cibles (HRE : promoteurs)

• Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la quiescence endothéliale– NO libéré lors de l’hypoxie : favorise la

perméabilité induite par le VEGF– VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase

(MAPK/PI3K)– Angiopoiétines

Facteurs de croissance angiogéniques

• VEGF– Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2

(flk/KDR) : activité tyrosine kinase– Favorise la migration et la prolifération endothéliale– Augmente la perméabilité vasculaire

• Angiopoïétine-1– Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase)– Effet sur l’engagement des précurseurs

endothéliaux– Effet sur la migration endothéliale– Pas d’effet sur la prolifération endothéliale– Recrutement des péricytes

• Angiopoïétine-2– Expansion cellulaire

• b-FGF– Anti-apoptotique, activation d’Akt

Inhibiteurs de l’angiogénèse

• Angiostatine– 38 kDa, 3 kringles– Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-

élastases et MMP– Induit l’apoptose des cellules endothéliales– Inhibe la prolifération endothéliale

• Endostatine– 20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L,

élastase)– Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de

eNOS)– Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL)

• Thrombospondine-1– Glycoprotéine haut poids moléculaire– Ligand de CD36– Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases)

Progéniteurs de la cellule endothéliale

Source Procédé d’isolement

Marqueurs cellulaires

Moelle osseuse Microbilles CD133+ CD146-, CD133+, CD31-, vWF-,VE-cadhérine -

Sang de cordon Microbilles CD34+ CD133+

Sang périphérique

Microbilles CD34+ Adhésion PBMC

CD133+ ou CD133-

CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante

Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire

EA 3801

Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire

EA 3801