Dr Ghislaine Descours Laboratoire de Bactériologie, Centre de Biologie Est

DUCIV, 15 octobre 2014

Diagnostic des infections bactériennes : quelle place pour la biologie moléculaire ?

Objectifs

!  Connaître le principe des techniques moléculaires •  PCR universelle versus PCR spécifique •  PCR en point final versus PCR en temps réel

!  Comprendre le délai de rendu des résultats

!  Savoir cibler une demande de PCR •  Apport par rapport aux autres techniques en Bactériologie •  Quand ? Quoi ? Comment ?

!  Avoir un regard critique sur la prescription & les résultats

Méthodes diagnostiques en bactériologie

Culture

TROD Tests rapides à

orientation diagnostique

Biologie moléculaire

Culture

!  Avantages •  Examen direct préalable •  Sensibilité théorique : 1 UFC •  Isolement des souches

" Sensibilité aux antibiotiques " Recherche de facteurs de virulence " Typage, enquêtes épidémiologiques

•  Coût limité

!  Limites •  Bactéries nécessitant un milieu spécifique, fragiles, intracellulaires •  Bactéries à croissance lente : retard au diagnostic •  Infections décapitées par une antibiothérapie préalable

TROD

!  Réactions immunologiques •  Tests immunochromatographiques, ELISA, agglutination,

fluorescence!

!  Avantages •  Délai de réalisation < 1h •  Ajustement thérapeutique immédiat

!  Limites •  Dépendance du développement par fournisseurs •  Sensibilité / spécificité •  Utilisation “détournée” sur des prélèvements profonds

Biologie moléculaire

!  Avantages •  Bactéries à croissance lente, difficilement ou non cultivables •  Non influencée par antibiothérapie / transport

!  Limites •  Contraintes techniques (locaux dédiés) •  Délais incompressibles

•  Mais développement de techniques « clés en main » " Pas de problématique de locaux ou de délais " Coût élevé

Légionellose

Culture : 4 à 10 j Milieux spécifiques Enquête épidémio.

Ag urinaire : 1h

Sensibilité : 90% L. pneumophila sg1

PCR spécifique : < 24h Détection de

toutes les espèces

Se < AgU si Lp1

Méningite à pneumocoque

Culture : 24h

Antibiogramme

Recherche d’Ag solubles : < 1h

(si ED+)

PCR spécifique < 24h Intérêt si

antibiothérapie préalable

Biologie moléculaire en pratique

Unité de Biologie moléculaire CHU, personnel dédié

PCR “maison” ou trousses commerciales

Unité conventionnelle CHG, personnel polyvalent Techniques “clés en main”

Principe des techniques moléculaires

Détection et/ou identification d’un ADN bactérien dans un prélèvement biologique

PCR spécifique

Gène amplifié ciblant une espèce, un genre, un

génogroupe bactérien!

Présomption clinique forte

Résultat : positif / négatif

en 24 h

PCR universelle

Gène commun à toutes les eubactéries :

ARN ribosomique 16S

Sans a priori sur le résultat

Identification par séquençage du produit de PCR

en 48 – 72 h

PCR réalisées au GHE !"#$ %&'($)*+,($ !-.,&/(0('1$!"#$%&'%((%) *+,&)-./) 0123)345%)'2551'6)71"17#8&19#%")

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Quel prélèvement ?

!  Potentiellement tout type de prélèvement

!  PCR universelle •  Site initialement stérile •  Pas sur les prélèvements pour lesquels il existe des seuils de

pathogénicité (urines, LBA!)

!  PCR spécifique •  Bactérie non commensale

" Biopsie cutanée : pas de PCR spécifique Staphylococcus " Gorge : pas de PCR Streptococcus

Quelles conditions ?

!  Recueil du prélèvement •  Liquide de ponction, pus, tissu, biopsie, sang! •  Bannir les écouvillons •  Volume " 200 µL •  Sang sur EDTA (héparine = inhibiteur) •  Ne rien ajouter (liquide, fixateur, milieu de transport!)

!  Nombre de prélèvements •  Conditions identiques à la culture

" Multiplier le nombre de prélèvement en orthopédie " Culture et PCR sur un même prélèvement

!  Acheminement au laboratoire •  t° ambiante, +4°C, -20°C

Du prélèvement au résultat!

Différentes étapes

Prélèvement

Lyse cellulaire + extraction d’ADN

manuelle ou automatisée Amplification

et

détection de l’ADN amplifié Séquençage

(PCR universelle) et analyse de la séquence Simultanée :

PCR en temps réel

Après : PCR en

point final

4 heures 1 série quotidienne

24 – 48 heures

1 heure Validation du résultat

10 min

3 heures

Polymerase Chain Reaction

ADN cible : 1 copie

Dénaturation

Hybridation des amorces

Elongation (dNTP, polymérase)

30 à 40 cycles

soit

230 à 240 copies

Détection de l’ADN amplifié N

ombr

e de

cop

ies

Nombre de cycles

Détection en temps réel Marqueur

fluorescent

Détection en point final

Gel migration

Cycle Seuil Cycle

threshold (Ct)

Quantité d’ADN

Détection en point final

!  Gel migration des produits de PCR !  Vérification de la taille attendue

Détection en temps réel

SybrGreen™

Liaison non spécifique à l’ADN db

Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db – # ADN sb)

Economique et facile

!  Reporter fluorescent E1"3&U(%)V)

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Détection en temps réel

SybrGreen™

Liaison non spécifique à l’ADN db

Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db – # ADN sb)

Economique et facile

Sondes spécifiques

Liaison spécifique des sondes à l’ADN db

Multiplexage (! cibles)

Coût plus élevé Développement plus délicat

!  Reporter fluorescent

La PCR universelle

L’ARNr 16S

!  Codé en opéron !  Nombre de copies du gènes variable en fonction de l’espèce

bactérienne (1 à 10) !  Structure et fonction conservée chez toutes les bactéries !  Pas de transfert horizontal !  Nombreuses séquences déposées dans les bases de données

L’ARNr 16S

Séquences conservées chez toutes les bactéries

Amorces

Séquences spécifiques d’un genre / d’une espèce

“Signature” après séquençage du produit

de PCR

2$$$$$$$$$$$$322$$$$$$$$$$$$422$$$$$$$$$$$$$522$$$$$$$$$$$$$622$$$$$$$$$$$$$$7222$$$$$$$$$$$$$$7322$$$$$$$$$$$$7422$$$$$7822$$$$9+$

L’ARNr 16S

Séquences conservées chez toutes les bactéries

Amorces

Séquences spécifiques d’un genre / d’une espèce

“Signature” après séquençage du produit

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Etape 1. PCR en point final

!  PCR Migration des produits de PCR

Témoin négatif

Marqueur de poids moléculaire

Témoin positif

Patients

Etape 2. Séquençage des positifs

!  Technique Big Dye® Terminator

!  PCR avec produit de PCR + amorce + polymérase + dNTP (3’OH) en compétition avec ddNTP* interrupteurs (3’H) : ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP Pool de brins d’ADN de taille variable

!  Purification du produit de PCR !  Électrophorèse capillaire

Etape 2. Séquençage des positifs

!  CTTGCACTGC !  CTTGCACTGCG !  CTTGCACTGCGA !  CTTGCACTGCGAT !  CTTGCACTGCGATT !  CTTGCACTGCGATTA !  CTTGCACTGCGATTAC

Séquence ARNr 16S : CGATTAC

Chromatogramme

Etape 3. Comparaison avec une base de données = alignement de la séquence

!  Le Bibi PQB •  BioInformatic Bacterial Identification Prokaryote Quick Identification •  https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibiPQP/lebibiPQP.cgi

•  Incrémentée tous les 3 mois (GenBank) •  Informations contrôlées (espèce) : DSMZ database

Etape 4. Interprétation des séquences

Identification de genre si > 97 % Identification d’espèce si > 99 % Prevotella spp

(T : sequence type, TT : strain type, GenBank ID)

Un abcès pulmonaire stérile en culture

> 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis

Un abcès pulmonaire stérile en culture

> 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis Streptococcus gordonii

PCR spécifique Streptococcus (gène tuf)

Un LCR stérile

!  Double voire triple séquence •  Ininterprétable •  Pluri microbien ? Contaminé ? •  Rendu négatif

PCR 16S très faiblement positive

Une biopsie osseuse stérile chez une patiente aux antécédents d’infection à S. epidermidis

!  Double séquence

!  Alignement : S. aureus, 96% •  Similarité < 97%, non rendue

!  PCR spécifique Staphylococcus •  Double séquence

!  PCR spécifique S. aureus +

Des nodules pulmonaires stériles chez une enfant de 12 ans

Séquence non répertoriée dans notre base de données

Famille des Bacteroidetes

Amplification et séquençage d’un autre fragment de l’ADNr 16S, mais pas plus d’information à partir des

banques de données

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1500

Etape 5. Rendu des résultats

!  Contrôle négatif et positif de PCR 16S •  Détection de contaminants et inhibiteurs dans le mix

!  Contrôle d’extraction •  Amplification parallèle du gène de la $-globine (eucaryote) •  Toujours positif •  Si négatif

" Prélèvement acellulaire : intra-oculaire, LCR " Présence d’inhibiteurs de PCR

!  Interprétation de la séquence •  Confrontation des données cliniques et biologiques •  Distinguer un contaminant d’un pathogène •  Une PCR négative d’exclut pas un diagnostic

PCR universelle

!  Avantages •  Amplification de tous les ADN bactériens

!  Inconvénients •  Pouvoir discriminant inter-espèces parfois limité

" Staphylococcus et Streptococcus •  Pouvoir discriminant inter-genres parfois limité

" Mycobactéries, entérobactéries! •  Amplification des contaminants •  Biais des banques de données

" Séquences surreprésentées, erronées, inconnues

Solution = PCR spécifiques

Les PCR spécifiques

!  Amorces spécifiques d’un genre / d’une espèce bactérienne

PCR spécifiques

!  PCR « semi-spécifiques » Staphylococcus & Streptococcus •  Gène tuf •  Gel migration •  Suivie d’un séquençage pour identification d’espèce

!  PCR spécifique •  En point final ou en temps réel

Patients : 400 pb

Témoin + : 600 pb

PCR spécifiques en temps réel

!  Développement de techniques “clés en main” •  Lyse, extraction, PCR et interprétation dans un système

automatisé et fermé de paillasse en % 1 heure •  Détection par des sondes spécifiques •  Intégration au secteur de Bactériologie conventionnelle

!  Domaines divers •  Infections associées aux soins

SARM, ERV, carbapénémases, toxines de C. difficile •  Résistance du BK à la rifampicine (rpoB) •  Portage de S. aureus, Streptocoque du groupe B! •  IST : Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae

!  Evaluer les performances et le coût

Exemple : GeneXpert MTB/RIF

PCR spécifiques en temps réel au GHE

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!  Apport

•  PCR sur prélèvements pluri-microbiens " Complément de 16S si double

séquence " Bordetella " Clostridium difficile

•  PCR combinées " Francisella / Bartonella henselae

•  Sensibilité > PCR 16S " S. aureus > Staph > 16S " K. kingae > 16S

Cas cliniques & données de la littérature

Une polyarthrite bien particulière!

!  Homme de 61 ans !  PAR atypique diagnostiquée en 2005

•  Mono-arthrite genou droit •  Extension aux mains, poignets, épaules, genoux, pieds,

chevilles, sans lésion structurale érosive typique •  FR, anti-CCP, ACAN + •  Corticothérapie + méthotrexate

!  Consultation en cardiologie sur avis du rhumatologue •  Dyspnée d’effort + œdèmes MI depuis un mois •  Important syndrome inflammatoire biologique •  Doute sur un souffle cardiaque systolique apyrétique

Une polyarthrite bien particulière!

!  Endocardite infectieuse •  Echographie cardiaque : •  Végétation cardiaque massive

de 24 mm •  Body-Scan normal •  Anémie à 10,9 g/dL

!  Indication chirurgicale de RVA en urgence pour risque embolique

Une polyarthrite bien particulière!

!  Suites rapidement favorables •  Muté en chirurgie à J4

!  Laboratoire •  Anatomopathologie : absence d’EI •  Bactériologie

" Examen direct : pas de germe " Culture : stérile " Hémocultures négatives

EI silencieuse à hémocultures négatives chez un patient immunodéprimé

•  Augmentin® + gentamycine

Une polyarthrite bien particulière!

!  PCR universelle •  Tropheryma whipplei (bactérie intracellulaire cultivable sur fibroblastes) •  Relecture anapath de la végétation avec colorations spéciales (PAS) :

négative

!  Relais Bactrim Forte + Plaquenil, 12 mois !  Arrêt corticoïdes et méthotrexate

!  Disparition totale des douleurs articulaires

!  Autres prélèvements •  Biopsie duodénale à J7 : négative •  Biopsie digestive, sang, selles, salive : négatives à 12 mois

Apport de la PCR dans le diagnostic des EI à hémocutures négatives

!  759 patients présentant une EI à hémocultures négatives •  Etiologie dans 62,7 % des cas •  Sérologie (principalement Coxiella et Bartonella) : 47,7 % •  PCR sur valve ou sang (sérologie négative) : 14,4 %

" Streptococcus, T. whipplei, Bartonella, Staphylococcus " Sensibilité PCR sur valve : 66,1 % " Sensibilité PCR sur sang : 13,6 %

•  Immunohistochimie •  Etiologies non infectieuses

!  Coxiella : sensibilité sérologie > PCR

Limites de la PCR dans les EI!

Limites de la PCR dans les EI!

Persistance de PCR positives sous antibiothérapie

Particulièrement Streptococcus

66 % 60 %

Limites de la PCR dans les EI!

! et jusqu’à plusieurs années après !

Cas n°2

Une fièvre résistante aux anti-pyrétiques

!  Enfant de 9 ans !  Consultation MT

•  Hyperthermie (39,2°C), céphalées intenses depuis 48h, raideur de nuque, photophobie

Transport privé en urgences vers les urgences pédiatriques sans antibiothérapie : méningite ?

!  Urgences pédiatriques •  Purpura pétéchial non nécrotique (pied) •  Constantes hémodynamiques stables •  Glasgow 8, mutation en réanimation •  Injection de C3G

Bilan biologique

!  Biochimie – Hématologie •  Leucocytes = 10,50 G/L •  CRP = 288 mg/L •  Plaquettes = 135 G/L, TP = 36%

!  TDM cérébrale : œdème diffus

!  Bactériologie •  Hémocultures •  Tube EDTA •  Pas de ponction lombaire (troubles de

la vigilance + troubles hémostase)

PCR spécifique N. meningitidis

!  PCR spécifique en temps réel multiplex •  Tous génogroupes + B + C + contrôle interne

!  Réalisée •  En urgence sur le tube de sang EDTA •  Sur la PL réalisée à distance

" Examen macroscopique : trouble " Examen direct : très rares cocci à Gram négatif " Leucocytes : 10 800 M éléments/L, PNN : 98% " Protéinorachie : 6,63 g/L " Glycorachie : 0,3 mmol/L " Culture négative

!  Positive pour N. meningitidis génogroupe B

PCR = diagnostic en urgence

!  Méningites •  PCR spécifique Méningocoque •  PCR spécifique Pneumocoque •  PCR spécifique Listeria

!  PCR Méningocoque = diagnostic + typage

!  Délai de rendu des résultats > PCR universelle •  Retour d’expérience de notre laboratoire •  Jamais positive si leucocytes < 200 /µL

Cas n°3

Cas n°3

!  Patient de 28 ans, sans antécédent

!  Survenue brutale d’une douleur basithoracique gauche dans la journée avec dyspnée progressivement croissante

!  Examen clinique •  Apyrétique (37,6°C) •  Ni toux, ni expectoration, ni signe extra-respiratoire •  Discrets crépitants en base gauche pulmonaire •  FC = 90/min •  PA = 110/60 mmHg •  Sa(02) = 93%

Bilan d’entrée

!  Biologie •  CRP à 36 mg/L •  Leucocytes 13,9 G/L avec 11,8 G/L PNN •  Ionogramme, bilans hépatique, rénal, cardiaque normaux

!  Imagerie •  Radiologie pulmonaire : pneumopathie du lobe inférieur gauche

associée à des opacités alvéolaires de la base droite •  Scanner : volumineuse condensation parenchymateuse du lobe

inférieur gauche (5 cm de largeur) sans épanchement

Amoxicilline per os + hospitalisation en Pneumologie

Evolution dans les 72 h

Admission 48 h 72 h

Température (°C) 37,6 38,4 39,5

Toux Absence Apparition d’une toux, expectorations blanchâtres

Douleur thoracique et dyspnée + ++ +++

morphine

Fréquence respiratoire (cycles/min) normale 38

Saturation (O2) 93% (air) 93% (air) 89% (10 L O2)

PAS (mm Hg) 110 90

Leucocytes (G/L) 13,9 13,1 3

CRP (mg/L) 36 210 323

Switch Auhmentin / Tavanic puis C3G / Rovamycine / Tavanic Mutation en USI, puis en Réanimation (CHU) : diagnostic de légionellose, ECMO

Evolution en réanimation

!  Persistance de PCR positives sous antibiothérapie •  Legionella : PCR habituellement négativée en < 2 semaines

(Korosec et al., Scand J Infect Dis., 2006)

Abcès pulmonaire

!  Chirurgie thoracique à J42 et évolution favorable !  PCR universelle sur l’abcès : double séquence (Fusobacterium / culture) !  PCR spécifique Legionella : +++ !  Antibiothérapie totale : 3 mois

Persistance de PCR positives / LBA = complications

PCR quantitative sur LBA : un marqueur prognostique dans les légionelloses

!  Charge bactérienne à l’admission corrélée à la sévérité des légionelloses !  Limites : standardisation des prélèvements pulmonaires

En conclusion!

Complémentarité des méthodes diagnostiques en Bactériologie

!  Connaître les performances de chaque technique •  Limite de détection, sensibilité et spécificité, indications •  Degré d’urgence clinique •  La PCR n’est pas forcément la technique la plus sensible !

!  Intégrer les méthodes de biologie moléculaire (BM) dans un algorithme diagnostique

!  Evaluer les kits commercialisés

!  Association •  Techniques « maison » & kits commerciaux •  Kits « clés en main » & kits conventionnels

Connaître les limites de la PCR

!  Faux positifs •  Pas de différenciation contaminant / pathogène •  N’est pas toujours le témoin d’une infection active

!  Faux négatifs •  Un résultat négatif n’exclut pas un diagnostic

" Cas avec culture + (rares colonies) / PCR –

!  PCR ! méthode de vérification d’un résultat de culture douteux

Au delà d’un outil strictement diagnostique

!  Outil pronostique •  PCR quantitative

!  Typage bactérien

!  Recherche de facteurs de virulence •  C. difficile / souche épidémique O27 •  S. aureus / PVL!

!  Recherche de résistance •  Sondes détectant les mutations associées à la résistance •  SARM, BK / rifampicine, H. pylori / clarithromycine!

Merci pour votre attention

Des questions ? ghislaine.descours@univ-lyon1.fr