Post on 03-Apr-2015
CONTAMINANTS ALIMENTAIRES
ET CIBLES CELLULAIRES
Exemple des pesticides
Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre
planplan
• Généralités Généralités (définition, classification, DJA, LMR, expositions)(définition, classification, DJA, LMR, expositions)
• Des facteurs de risque pour la santé chez l’hommeDes facteurs de risque pour la santé chez l’homme
• Les cibles cellulaires Les cibles cellulaires
• Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités● Définition
toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole
● Classification selon leur activité biologique- les insecticides- les fongicides -les herbicides- les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…)
● Classification par famille chimique:
- Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.)
- Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion)
- Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)
- pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "
- Tous les produits phytosanitaires sont soumis à une Autorisation de Mise sur le Marché
- Les études toxicologiques et écotoxicologiques sont réalisées par l’industriel
- L’analyse du dossier toxicologique est assurée par des experts indépendants, nommés dans différentes commissions
Les procédures d'évaluation du risque
Evaluation du risqueDose journalière admissible DJALimite maximale de résidus LMR Persistance
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
● Les limites maximales de résidus (LMRs en mg/kg) dans les denrées sont établies par couple "matière active-denrée" à partir des données toxicologiques et agronomiques. Elles reflètent les bonnes pratiques agricoles (utilisation des quantités minimales nécessaires pour protéger efficacement les cultures), qui aboutissent à des niveaux de résidus acceptables, c'est-à-dire sans effet sur la santé.
● La dose journalière admissible (DJA en mg/kg/j) pour l’homme est déterminée pour chaque substance active retenue, : la quantité maximale de produit pouvant être absorbée quotidiennement par l’homme au cours de toute sa vie, sans apparition d’effet quelconque. Pour cela, on se base sur une dose sans effet (DSE) tirée d’études toxicologiques menées sur des animaux (dans le cadre du dossier d’homologation).
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
dosePas d’effet toxique Zone de toxicité
Dose sans effet : DSE
Eff
et t
oxiq
ue
Dose toxiqueDSE
(pour l’animal)DJA
(mg/kg/jour chez l’homme)
LMR(aliment, mg/kg)
dose journalière acceptable (DJA)limite maximale de résidu (LMR)
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
Persistance
• Généralement appréciée en calculant la demi-vie du composé, c'est-à-dire le temps nécessaire pour que disparaisse la moitié de la quantité (ou de la concentration) de résidus présents dans le milieu (ou l'organisme)
2 joursGlyphosate
130 joursParathion
2 ansLindane
15 ansDDT
Demi-viePolluant
La persistence d’un composé dépend aussi du type de sol
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
- Les plans de contrôle sont plus nombreux et mieux organisés
- Les agriculteurs sont mieux informés et formés
- Interdiction des substances les plus dangereuses
- Les tonnages utilisés tendent à diminuer
- Réduction de moitié du nombre de substances homologuées (800 en 1990; 489 en 2005) 2600 préparations commerciales
règlementations sévères
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
• Usage agricole (90%)
- 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) • Usage non agricole (10%)
- traitement des parasites dans la maison- traitement des bois et textiles- soins des animaux- traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
Exposition professionnelle Exposition professionnelle • 1.3 millions de personnes
professionnellement exposées en France • X2 avec les retraités
Exposition non professionnelleExposition non professionnelle :• La population en générale
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
Exposition via l’environnement et l’alimentationExposition via l’environnement et l’alimentation
Transfert (absorption, volatilisation) vers eau de surface, air, sols (eaux profondes)RétentionDégradation
EAUX-332 pesticides détectés entre 2001 et 2003 dans les eaux de distribution, de surface et souterraines sauf les eaux montagneuses - 9 familles chimiques différentes mais surtout les triazines (herbicide)- recherche limitée par les seuils de détection- quelques dépassement ponctuel de la LMR (triazine, urée substituée (diuron) et organochlorés)- augmentation de la présence de métabolites de pesticides (DEA/atrazine)
AIR- Aucune norme pour réglementer les teneurs en pesticides dans l’air ambiant- Associations agrées de la qualité de l’air (AASQA)- présence de pesticides à la fois dans l’air urbain ou rural (Folpel (fongicide vigne)
SOLS- Pas de dispositif de surveillance pour caractériser la contamination diffuse des sols par les pesticides
Pesticides : généralitésPesticides : généralités
les alimentsles aliments
Commission des Communautés Européennes Recherche de 500 substances actives dans 47 500 échantillons
Direction Générale Concurrence Consommation et Répression des Fraudes (DGCCRFF 2003)
►Très peu de non- conformité pour les denrées animales
► Parmi les fruits et légumes étudiés (3000 échantillons, 236 pesticides)
- 50% ne porte pas de résidus des pesticides recherchés.
- 44 % contiennent des résidus avec une valeur <LMR
-6.6% contiennent des résidus avec une valeur >LMR
- 23.7% contiennent plusieurs résidus
Selon l’OMS, pour les non professionnels la principale source d’exposition - alimentation 80%- eau 10%
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
6
3
55
5
3
3
4
6
1
6
8
salade= 6 pesticides différentspoisson = 3 tomates= 5blé = 5Vin = 5Produits laitiers = 3Fraises = 4pommes= 3 Poivrons = 8
Etc..
Pour le consommateurExposition chronique à de
faibles doses de pesticides en mélange
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de pathologies graves comme :- certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson -certaines déficiences au niveau du développement cérébral - Des troubles de l’immunité-Des troubles de la reproduction-Des perturbations endocriniennes
Études épidémiologiques dans les populations exposées
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
• Les cancers hématopoïétiques sont avec les tumeurs du cerveau, les cancers les plus fréquemment retrouvés chez les enfants dans les populations exposées .
• La survenue d’autres types de cancers (tumeurs cérébrales, tumeurs germinales) ou des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité ont été rapportés.
Exposition professionnelle des parents
seraient associées à diverses pathologies chez les enfants
Effet de l’ exposition professionnelle des parents sur la santé des enfants
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules
humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesElimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la prolifération de la survie
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
pesticides
Dommages à l’ADN
la génotoxicité
REPARATION ADN
Ralentissement du cycle cellulaire
Système d’excision et réparation des dommages
Système enzymatique de réparations des cassures
•Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG),• les coupures simples et doubles brins,• les adduits à l’ADN
• Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006)
• Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005)
• Dans les cellules fibroblastiques de rat le mancozeb (fongicide, dithiocarbamate) induit des cassures simples brins après une heure d’exposition à de faibles doses (Calviello G., et al, 2005).
• Oxydation de la l’ADN dans le foie de rat (8 oxoDg) après traitement des animaux avec un mélange de 15 pesticides (0.75 à 10 mg/kg) (M. Lodovici et al, 1994)
30 000 lésions spontanées / jour/ cellule
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotiques
mutation
RNA, Protéines
Cellule transformée Stimulation de la prolifération
de la cellule transformée
Promotion
tumeur
Accumulation d’anomalies génétiques
définitives dans des gènes contrôlant la survie
et la prolifération
Initiation
Conséquence de la génotoxicité des pesticides ?
Réparation de l ’ADN
Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants
ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules.
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotiques
mutation
Réparation de l ’ADN
Cellules transformées
initiation
promotion
tumeur
ARNProtéines
Mort cellulaire programmée
Ex Mancozeb induit une génotoxicité dans les cellules fibroblastiques de rat en culture qui conduit à l’induction de la mort cellulaire programmée (Calviello et al, 2005)
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
mort cellulaire programmée apoptose
Processus physiologique de régulation du nombre de cellules
■ Au cours du développement embryonnaire,
■ Dans la défense immunitaire
■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »
modifications structurales• Plusieurs étapes en cascade,
dont les effets sont visualisables dans les cellules : – flip-flop de la
phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique
– Boursouflure membranaire
– fragmentation de l'ADN nucléaire
– fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques
Apoptose Modifications biochimiques
P53 Independent pathways
Ca++
Modification de la répartition des phospholipides membranaires
Hydrolase Cytosolique inactives
Hydrolase Cytosolique actives
P53 Dependent pathways
Lésions irréversibles des protéines cytosoliques
Ex le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases(Saleh AM et al, 2003)
Ex le paraquat dichloride, un herbicide, induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004)
Hydrolyze des enzymesde réparation de l'ADN (PARP)Et des enzymes de structure :
gelsoline lamineFragmentation de l'ADN
Cascade d'activation d'enzymes
APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
la génotoxicité d’un xénobiotique peut être due à son pouvoir pro-
oxydant qui conduit à une variation du statut oxydo-réducteur de la
cellule
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur : définition
ROS espèces oxygénées réactives
Echec régulationstatut redox
Stress oxydant
Attaque lipide, DNA, protéines
O2
Chaine
mitochondriale
InflammationDéfenses
cellulaires
PROTECTION
Initiation
Promotion: expansion clonaleCroissance et Instabilité génétique
tumeur
Dégâts cellulairesMutation DNA
apoptose
RéparationDNA
Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase)glutathionAnti-oxydants vit E, C
cytoP450
Facteurs environnementauxRadiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques
Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.)jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides• La vinclozoline ou l’iprodione (fongicide) diminue le taux de glutathion
intracellulaire, et augmente le taux de radicaux libres dans les cellules HepG2 après une heure de traitement à 25 ou 100µg/ml. Radice S et al, 1998.
• Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006
• Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006.
• Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007.
• L’alachlore et le chlorpyrifos (insecticides), induisent in vitro (cellules PC12 neuronales) un stress oxydant conduisant à une peroxydation lipidique, des cassures simples et double brins de l’ADN, ainsi qu’à une induction de protéine heat shock. Bagchi D., et al, 1996
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la survie de la prolifération
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
La transduction du signal
La transduction du signalTout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulairevia une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase)
Cascade de phosphorylationdéphosphorylation
La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)
La transduction du signal peut se faire soit via- La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires-Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine)- L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation
Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Les intermédiaires
Ex : Le glyphosate, un herbicide, retarde l’activation du complexe CDK1/cycline B (Marc J, et val, 2001)
Ex : L’endosulfan, la dieldrine active la voie des MAP kinases (ERK1 et 2). Bulayeva NN et al, 2004
EX les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005.
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la prolifération de la survie
Toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches
Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire
EstimationEstimation de la viabilitéde la viabilité
• MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm)
• Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes
Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire
GénotoxicitéGénotoxicité
I Comet assay
mesure des cassures induites -directement par un agent génotoxique,- indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.
- Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent.
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
GénotoxicitéGénotoxicité
les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds
GénotoxicitéGénotoxicité
Taux de mutation du gène HPRT (hypoxanthine phosphoribosyltransferase)
Voie de recyclage des nucléotides puriques à partir d’hypoxanthine et guanine (ou de ses analogues)La perte de ces fonctions (mutation inactivante du gène) permet aux cellules de proliférer en présence de 6-Thioguanine
HPRT normal + 6-thioguanine → cytotoxicitéHPRT muté + 6-thioguanine → croissance normale
Stress oxydantStress oxydant• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives
avec les radicaux libres• Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant
- SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2- Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2- Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG
• Dosage des taux de glutathion• Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg
dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)
• marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
Signalisation cellulaireSignalisation cellulaire• Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en
fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
• Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire
Plateforme Biopuces
Génopôle Toulouse Midi Pyrénées
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulairemoléculaire : signalisation cellulaire
Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité defluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN
Sub G0/G1Cellules apoptotiques
G1
G2/M
Cytométrie en flux
Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelingDétection des fragments d’ADN en marquant l’extrémité terminal des acides nucléiques avec un dUTP qui sera ensuite identifié par un marquage fluorescent
DNA Laddermigration de l’ADN sur gel d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit qu’une seule bande.
Cells containing DNA strand nicks characteristic of apoptosis are detected by TUNEL and fluoresce green, while necrotic cells are stained with red-fluorescent propidium iodide
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
conclusionconclusion
• Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules.
• Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement
• Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses
Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre
lpayrast@toulouse.inra.frlpayrast@toulouse.inra.fr
• les homologues Bcl-2 influencent notamment l’intégrité des mitochondries et régissent ainsi la formation de l’apoptosome.
• Les homologues suppresseurs (anti-apoptotiques) d’apoptose • peuvent lier et séquestrer APAF-1, et inhiber les homologues
activateurs (pro-apoptotiques)susceptibles de provoquer l’ouverture de pores dans la membrane mitochondriale : cette ouverture, quand elle intervient, entraîne la libération du cytochrome c et des inhibiteurs d’IAP
• dans le cytosol.• D’autres homologues pro-apoptotiques, dits sensibilisateurs, ont pour
fonction • d’inhiber les homologues anti-apoptotiques ; certains d’entre eux
interagissent également avec des activateurs pour potentialiser les fonctions de ces derniers. Le facteur APAF-1 et le cytochromec peuvent alors coopérer pour dimériser la pro-CASP-9, formant ainsi l’apoptosome et la mettant aussitôt en activation. Il s’ensuivra une cascade amplificatrice d’activation de caspases effectrices.
GénotoxicitéGénotoxicité
• Test des micronoyaux cytokinesis-block micronucleus(CBMN ) dans les lymphocytes humainsExamens les noyaux interphasiques de lymphocytes exposés à des substances
génotoxiques, après une culture cellulaire et l'obtention de lymphocytes binucléés - estimation des cassures- perte de chromosomes
• FISH : fluorescent in situ hybridization: réarrangements chromosomiques