CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre...

CONTAMINANTS ALIMENTAIRES

ET CIBLES CELLULAIRES

Exemple des pesticides

Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre [email protected]@toulouse.inra.fr

• Des facteurs de risque pour la santé Des facteurs de risque pour la santé chez l’hommechez l’homme

• Mécanisme d’action de la toxicité des Mécanisme d’action de la toxicité des pesticides :Les cibles cellulairespesticides :Les cibles cellulaires

• Les approches en toxicologie cellulaire Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire

Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités● Définition

toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole

● Classification selon leur activité biologique- les insecticides- les fongicides -les herbicides- les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…)

● Classification par famille chimique:

- Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.)

- Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion)

- Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)

- pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

• Usage agricole (90%)

- 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) • Usage non agricole (10%)

- traitement des parasites dans la maison- traitement des bois et textiles- soins des animaux- traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts

Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités

Exposition professionnelle Exposition professionnelle • Population définie

1.3 millions de personnes professionnellement

exposées en France (X2 avec les retraités)

• Molécules définies• Temps d’exposition défini

Exposition non professionnelleExposition non professionnelle 80% via l’alimentation

Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités

Exposition alimentaire -Mélange de résidus-long terme-Faibles doses

L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de troubles de la santé

- Certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - Certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson - Certaines déficiences au niveau du développement cérébral - Des troubles de l’immunité- Des troubles de la reproduction- Des perturbations endocriniennes

Études épidémiologiques dans les populations professionnellement exposées

Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques

• Les cancers hématopoïétiques tumeurs du cerveau,

• des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité

Exposition professionnelle des parents pendant la période prénatale

associées à diverses pathologies chez les enfants


Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules

humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire


Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesElimination du conjugué

les systèmes de détoxification

xénobiotique

s

Mort cellulaire programmée

Transduction du signalStatut oxydo-réducteur

la génotoxicité

La régulation de la prolifération de la survie

Elimination du conjugué


pesticides

la génotoxicité

REPARATION ADN

Ralentissement du cycle cellulaire

Système d’excision et réparation des dommages

Système enzymatique de réparations des cassures

•Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG),• les coupures simples et doubles brins,• les adduits à l’ADN

• Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006)

• Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005)

• Dans les cellules RTG2, l’alachlore induit des cassures d’ADN (Parra JM, 2010)

30 000 lésions spontanées / jour/ cellule

Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides



xénobiotiques

mutation

RNA, Protéines

Cellule transformée Stimulation de la prolifération

de la cellule transformée

Promotion

tumeur

Accumulation d’anomalies génétiques

définitives dans des gènes contrôlant la survie

et la prolifération

Initiation

Conséquence de la génotoxicité des pesticides ?

Réparation de l ’ADN

Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants

ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules.




xénobiotiques

mutation

Réparation de l ’ADN

Cellules transformées

initiation

promotion

tumeur

ARNProtéines


Ex Methoxychlor induit une atrophie du thymus via l’induction de l’apoptose dans les thymocytes.Fukuyama T, 2010, 2010

Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose

mort cellulaire programmée apoptose

Processus physiologique de régulation du nombre de cellules

■ Au cours du développement embryonnaire,

■ Dans la défense immunitaire

■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif


Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »

modifications structurales• Plusieurs étapes en cascade,

dont les effets sont visualisables dans les cellules : – flip-flop de la

phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique

– Boursouflure membranaire

– fragmentation de l'ADN nucléaire

– fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques

Apoptose Modifications biochimiques

P53 Independent pathways

Ca++

Modification de la répartition des phospholipides membranaires

Hydrolase Cytosolique inactives

Hydrolase Cytosolique actives

P53 Dependent pathways

Lésions irréversibles des protéines cytosoliques

• Le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003).

• le paraquat dichloride, un herbicide,induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004)

• Le diazinon active l’apoptose via l’activation des caspases dans les cellules de teratocarcinome humain (Aluigi MG, 2010)

Hydrolyze des enzymesde réparation de l'ADN (PARP)Et des enzymes de structure :

gelsoline lamineFragmentation de l'ADN

Cascade d'activation d'enzymes

APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.


la toxicité d’un xénobiotique peut être due à une variation du statut

oxydo-réducteur de la cellule


Statut oxydo-réducteur : définition

ROS espèces oxygénées réactives

Echec régulationstatut redox

Stress oxydant

Attaque lipide, DNA, protéines

O2

Chaine

mitochondriale

InflammationDéfenses

cellulaires

PROTECTION

Initiation

Promotion: expansion clonaleCroissance et Instabilité génétique

tumeur

Dégâts cellulairesMutation DNA

apoptose

RéparationDNA

Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase)glutathionAnti-oxydants vit E, C

cytoP450

Facteurs environnementauxRadiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques

Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.)jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux


Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides

• Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta

RK et al, 2006

• Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006.

• Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007.

• Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in human hepatocytes. Liu H, Liu J, Xu L, Zhou S, Li L, Liu W. Toxicology. 2010 .

• Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production by Fusarium graminearum. Audenaert K, Callewaert E, Höfte M, De Saeger S, Haesaert G. BMC Microbiol. 2010

• Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human lymphocytes (in vitro). Michałowicz J.Arch Toxicol. 2010

• Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures.Fischer LR, Glass JD. Acta Neuropathol. 2010


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20688129































































xénobiotique

s



la génotoxicité

La régulation de la survie de la prolifération


La transduction du signal

La transduction du signalTout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire• via une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) • dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) i.e. les intermédiaires de la signalisation

Cascade de phosphorylationdéphosphorylation

La transduction du signal peut se faire soit via- La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires

- Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine)

- L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation

Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation


Les intermédiaires

• Les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005.

• L’isocarbophos, un organophosphoré, induit la production de ROS, l’activation de la voie dépendante de la JNK et l’apoptose dans les cellules HepG2. Liu H, 2010


La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :

•en les activant directement (exemple : facteur AP-1)

•en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)



xénobiotique

s



la génotoxicité

La régulation de la prolifération de la survie

Toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches

Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire

EstimationEstimation de la viabilitéde la viabilité

• MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm)

• Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes

Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire

GénotoxicitéGénotoxicité

Comet assay

mesure des cassures simples et doubles brins induites - directement par un agent génotoxique,- indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.

- Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent.

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire

les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds

Stress oxydantStress oxydant• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les

radicaux libres

• Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant- SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2- Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2- Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG

• Dosage des taux de glutathion

• Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)

• Mise en évidence marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps


Signalisation cellulaireSignalisation cellulaire• Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en

fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire


• Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire

Plateforme Biopuces

Génopôle Toulouse Midi Pyrénées

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulairemoléculaire : signalisation cellulaire

Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité defluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN

Sub G0/G1Cellules apoptotiques

G1

G2/M

Cytométrie en flux

Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose

DNA Laddermigration de l’ADN sur gel

d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du

gel dans le cas de cellules apoptotiques

sinon on ne voit qu’une seule bande.


Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)


conclusionconclusion

• Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules humaines.

• Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement

• Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses

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