CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre.

CONTAMINANTS ALIMENTAIRES

ET CIBLES CELLULAIRES

Exemple des pesticides

Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre

planplan

• Généralités Généralités (définition, classification, DJA, LMR, expositions)(définition, classification, DJA, LMR, expositions)

• Des facteurs de risque pour la santé chez l’hommeDes facteurs de risque pour la santé chez l’homme

• Les cibles cellulaires Les cibles cellulaires

• Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités● Définition

toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole

● Classification selon leur activité biologique- les insecticides- les fongicides -les herbicides- les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…)

● Classification par famille chimique:

- Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.)

- Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion)

- Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)

- pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

- Tous les produits phytosanitaires sont soumis à une Autorisation de Mise sur le Marché

- Les études toxicologiques et écotoxicologiques sont réalisées par l’industriel

- L’analyse du dossier toxicologique est assurée par des experts indépendants, nommés dans différentes commissions

Les procédures d'évaluation du risque

Evaluation du risqueDose journalière admissible DJALimite maximale de résidus LMR Persistance

Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités

● Les limites maximales de résidus (LMRs en mg/kg) dans les denrées sont établies par couple "matière active-denrée" à partir des données toxicologiques et agronomiques. Elles reflètent les bonnes pratiques agricoles (utilisation des quantités minimales nécessaires pour protéger efficacement les cultures), qui aboutissent à des niveaux de résidus acceptables, c'est-à-dire sans effet sur la santé.

● La dose journalière admissible (DJA en mg/kg/j) pour l’homme est déterminée pour chaque substance active retenue, : la quantité maximale de produit pouvant être absorbée quotidiennement par l’homme au cours de toute sa vie, sans apparition d’effet quelconque. Pour cela, on se base sur une dose sans effet (DSE) tirée d’études toxicologiques menées sur des animaux (dans le cadre du dossier d’homologation).


dosePas d’effet toxique Zone de toxicité

Dose sans effet : DSE

Eff

et t

oxiq

ue

Dose toxiqueDSE

(pour l’animal)DJA

(mg/kg/jour chez l’homme)

LMR(aliment, mg/kg)

dose journalière acceptable (DJA)limite maximale de résidu (LMR)


Persistance

• Généralement appréciée en calculant la demi-vie du composé, c'est-à-dire le temps nécessaire pour que disparaisse la moitié de la quantité (ou de la concentration) de résidus présents dans le milieu (ou l'organisme)

2 joursGlyphosate

130 joursParathion

2 ansLindane

15 ansDDT

Demi-viePolluant

La persistence d’un composé dépend aussi du type de sol


- Les plans de contrôle sont plus nombreux et mieux organisés

- Les agriculteurs sont mieux informés et formés

- Interdiction des substances les plus dangereuses

- Les tonnages utilisés tendent à diminuer

- Réduction de moitié du nombre de substances homologuées (800 en 1990; 489 en 2005) 2600 préparations commerciales

règlementations sévères


• Usage agricole (90%)

- 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) • Usage non agricole (10%)

- traitement des parasites dans la maison- traitement des bois et textiles- soins des animaux- traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts


Exposition professionnelle Exposition professionnelle • 1.3 millions de personnes

professionnellement exposées en France • X2 avec les retraités

Exposition non professionnelleExposition non professionnelle :• La population en générale


Exposition via l’environnement et l’alimentationExposition via l’environnement et l’alimentation

Transfert (absorption, volatilisation) vers eau de surface, air, sols (eaux profondes)RétentionDégradation

EAUX-332 pesticides détectés entre 2001 et 2003 dans les eaux de distribution, de surface et souterraines sauf les eaux montagneuses - 9 familles chimiques différentes mais surtout les triazines (herbicide)- recherche limitée par les seuils de détection- quelques dépassement ponctuel de la LMR (triazine, urée substituée (diuron) et organochlorés)- augmentation de la présence de métabolites de pesticides (DEA/atrazine)

AIR- Aucune norme pour réglementer les teneurs en pesticides dans l’air ambiant- Associations agrées de la qualité de l’air (AASQA)- présence de pesticides à la fois dans l’air urbain ou rural (Folpel (fongicide vigne)

SOLS- Pas de dispositif de surveillance pour caractériser la contamination diffuse des sols par les pesticides

Pesticides : généralitésPesticides : généralités

les alimentsles aliments

Commission des Communautés Européennes Recherche de 500 substances actives dans 47 500 échantillons

Direction Générale Concurrence Consommation et Répression des Fraudes (DGCCRFF 2003)

►Très peu de non- conformité pour les denrées animales

► Parmi les fruits et légumes étudiés (3000 échantillons, 236 pesticides)

- 50% ne porte pas de résidus des pesticides recherchés.

- 44 % contiennent des résidus avec une valeur <LMR

-6.6% contiennent des résidus avec une valeur >LMR

- 23.7% contiennent plusieurs résidus

Selon l’OMS, pour les non professionnels la principale source d’exposition - alimentation 80%- eau 10%


6

3

55

5

3

3

4

6

1

6

8

salade= 6 pesticides différentspoisson = 3 tomates= 5blé = 5Vin = 5Produits laitiers = 3Fraises = 4pommes= 3 Poivrons = 8

Etc..

Pour le consommateurExposition chronique à de

faibles doses de pesticides en mélange


L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de pathologies graves comme :- certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson -certaines déficiences au niveau du développement cérébral - Des troubles de l’immunité-Des troubles de la reproduction-Des perturbations endocriniennes

Études épidémiologiques dans les populations exposées

Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques

• Les cancers hématopoïétiques sont avec les tumeurs du cerveau, les cancers les plus fréquemment retrouvés chez les enfants dans les populations exposées .

• La survenue d’autres types de cancers (tumeurs cérébrales, tumeurs germinales) ou des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité ont été rapportés.

Exposition professionnelle des parents

seraient associées à diverses pathologies chez les enfants

Effet de l’ exposition professionnelle des parents sur la santé des enfants


Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules

humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire


Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesElimination du conjugué

les systèmes de détoxification

xénobiotique

s

Mort cellulaire programmée

Transduction du signalStatut oxydo-réducteur

la génotoxicité

La régulation de la prolifération de la survie

Elimination du conjugué


pesticides

Dommages à l’ADN

la génotoxicité

REPARATION ADN

Ralentissement du cycle cellulaire

Système d’excision et réparation des dommages

Système enzymatique de réparations des cassures

•Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG),• les coupures simples et doubles brins,• les adduits à l’ADN

• Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006)

• Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005)

• Dans les cellules fibroblastiques de rat le mancozeb (fongicide, dithiocarbamate) induit des cassures simples brins après une heure d’exposition à de faibles doses (Calviello G., et al, 2005).

• Oxydation de la l’ADN dans le foie de rat (8 oxoDg) après traitement des animaux avec un mélange de 15 pesticides (0.75 à 10 mg/kg) (M. Lodovici et al, 1994)

30 000 lésions spontanées / jour/ cellule

Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides



xénobiotiques

mutation

RNA, Protéines

Cellule transformée Stimulation de la prolifération

de la cellule transformée

Promotion

tumeur

Accumulation d’anomalies génétiques

définitives dans des gènes contrôlant la survie

et la prolifération

Initiation

Conséquence de la génotoxicité des pesticides ?

Réparation de l ’ADN

Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants

ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules.




xénobiotiques

mutation

Réparation de l ’ADN

Cellules transformées

initiation

promotion

tumeur

ARNProtéines


Ex Mancozeb induit une génotoxicité dans les cellules fibroblastiques de rat en culture qui conduit à l’induction de la mort cellulaire programmée (Calviello et al, 2005)

Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose

mort cellulaire programmée apoptose

Processus physiologique de régulation du nombre de cellules

■ Au cours du développement embryonnaire,

■ Dans la défense immunitaire

■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif


Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »

modifications structurales• Plusieurs étapes en cascade,

dont les effets sont visualisables dans les cellules : – flip-flop de la

phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique

– Boursouflure membranaire

– fragmentation de l'ADN nucléaire

– fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques

Apoptose Modifications biochimiques

P53 Independent pathways

Ca++

Modification de la répartition des phospholipides membranaires

Hydrolase Cytosolique inactives

Hydrolase Cytosolique actives

P53 Dependent pathways

Lésions irréversibles des protéines cytosoliques

Ex le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases(Saleh AM et al, 2003)

Ex le paraquat dichloride, un herbicide, induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004)

Hydrolyze des enzymesde réparation de l'ADN (PARP)Et des enzymes de structure :

gelsoline lamineFragmentation de l'ADN

Cascade d'activation d'enzymes

APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.


la génotoxicité d’un xénobiotique peut être due à son pouvoir pro-

oxydant qui conduit à une variation du statut oxydo-réducteur de la

cellule


Statut oxydo-réducteur : définition

ROS espèces oxygénées réactives

Echec régulationstatut redox

Stress oxydant

Attaque lipide, DNA, protéines

O2

Chaine

mitochondriale

InflammationDéfenses

cellulaires

PROTECTION

Initiation

Promotion: expansion clonaleCroissance et Instabilité génétique

tumeur

Dégâts cellulairesMutation DNA

apoptose

RéparationDNA

Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase)glutathionAnti-oxydants vit E, C

cytoP450

Facteurs environnementauxRadiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques

Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.)jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux


Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides• La vinclozoline ou l’iprodione (fongicide) diminue le taux de glutathion

intracellulaire, et augmente le taux de radicaux libres dans les cellules HepG2 après une heure de traitement à 25 ou 100µg/ml. Radice S et al, 1998.

• Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006

• Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006.

• Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007.

• L’alachlore et le chlorpyrifos (insecticides), induisent in vitro (cellules PC12 neuronales) un stress oxydant conduisant à une peroxydation lipidique, des cassures simples et double brins de l’ADN, ainsi qu’à une induction de protéine heat shock. Bagchi D., et al, 1996




xénobiotique

s



la génotoxicité

La régulation de la survie de la prolifération


La transduction du signal

La transduction du signalTout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulairevia une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase)

Cascade de phosphorylationdéphosphorylation

La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)

La transduction du signal peut se faire soit via- La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires-Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine)- L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation

Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation


Les intermédiaires

Ex : Le glyphosate, un herbicide, retarde l’activation du complexe CDK1/cycline B (Marc J, et val, 2001)

Ex : L’endosulfan, la dieldrine active la voie des MAP kinases (ERK1 et 2). Bulayeva NN et al, 2004

EX les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005.




xénobiotique

s



la génotoxicité

La régulation de la prolifération de la survie

Toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches

Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire

EstimationEstimation de la viabilitéde la viabilité

• MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm)

• Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes

Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire

GénotoxicitéGénotoxicité

I Comet assay

mesure des cassures induites -directement par un agent génotoxique,- indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.

- Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent.

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire


les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds


Taux de mutation du gène HPRT (hypoxanthine phosphoribosyltransferase)

Voie de recyclage des nucléotides puriques à partir d’hypoxanthine et guanine (ou de ses analogues)La perte de ces fonctions (mutation inactivante du gène) permet aux cellules de proliférer en présence de 6-Thioguanine

HPRT normal + 6-thioguanine → cytotoxicitéHPRT muté + 6-thioguanine → croissance normale

Stress oxydantStress oxydant• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives

avec les radicaux libres• Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant

- SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2- Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2- Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG

• Dosage des taux de glutathion• Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg

dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)

• marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps


Signalisation cellulaireSignalisation cellulaire• Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en

fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire


• Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire

Plateforme Biopuces

Génopôle Toulouse Midi Pyrénées

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulairemoléculaire : signalisation cellulaire

Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité defluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN

Sub G0/G1Cellules apoptotiques

G1

G2/M

Cytométrie en flux

Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .

Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelingDétection des fragments d’ADN en marquant l’extrémité terminal des acides nucléiques avec un dUTP qui sera ensuite identifié par un marquage fluorescent

DNA Laddermigration de l’ADN sur gel d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit qu’une seule bande.

Cells containing DNA strand nicks characteristic of apoptosis are detected by TUNEL and fluoresce green, while necrotic cells are stained with red-fluorescent propidium iodide


Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)


conclusionconclusion

• Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules.

• Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement

• Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses

Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre

[email protected]@toulouse.inra.fr

• les homologues Bcl-2 influencent notamment l’intégrité des mitochondries et régissent ainsi la formation de l’apoptosome.

• Les homologues suppresseurs (anti-apoptotiques) d’apoptose • peuvent lier et séquestrer APAF-1, et inhiber les homologues

activateurs (pro-apoptotiques)susceptibles de provoquer l’ouverture de pores dans la membrane mitochondriale : cette ouverture, quand elle intervient, entraîne la libération du cytochrome c et des inhibiteurs d’IAP

• dans le cytosol.• D’autres homologues pro-apoptotiques, dits sensibilisateurs, ont pour

fonction • d’inhiber les homologues anti-apoptotiques ; certains d’entre eux

interagissent également avec des activateurs pour potentialiser les fonctions de ces derniers. Le facteur APAF-1 et le cytochromec peuvent alors coopérer pour dimériser la pro-CASP-9, formant ainsi l’apoptosome et la mettant aussitôt en activation. Il s’ensuivra une cascade amplificatrice d’activation de caspases effectrices.


• Test des micronoyaux cytokinesis-block micronucleus(CBMN ) dans les lymphocytes humainsExamens les noyaux interphasiques de lymphocytes exposés à des substances

génotoxiques, après une culture cellulaire et l'obtention de lymphocytes binucléés - estimation des cassures- perte de chromosomes

• FISH : fluorescent in situ hybridization: réarrangements chromosomiques

CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre.

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