Compter des Microorganismes

Méthodes

• Comptes viables• Nombre le plus probable• Comptes directs

Nombre le Plus probable: NPP

– Fondé sur les statistiques de probabilités– Test présomptif fondé sur des caractéristiques

données– Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP)

• Commencer avec un bouillon pour déceler les caractéristiques désirées

• Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes

-1 -2 -3 -4 -5 -6Dilution

3 Tubes/Dilution

1 ml de chaque Dilution dans chaque Tube

Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

NPP- Suite• Les résultats

– -1 -2 -3 -4 -5 -6– 3 3 2 1 0 0 - No de tubes (+)

• Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme• Choisir la série la moins dilué qui sont tous négatifs

– Dans cet exemple (-5)• Obtenir les résultats des 3 dilutions précédente

– Dans cet exemple (-2, -3, et -4)– Determiner le nombre de tubes positifs pour chacune

de ces dilutions• Dans cet exemple (3, 2, 1 respectivement)

• Determiner le NPP sur le tableau de NPP

NPP = 1.5 UFC/ml pour la dilution 10-3

NPP

• Calculs– Si 3, 2,1 Donc le résultat est: 1.5/ml or g– Puisque ceci est une estimé pour la dilution de 10-3

nous devons multiplier par 1 000– Notre résultat

• 1.5 UFC/g ou ml• 1.5 x 103 UFC/g ou ml

Comptes Directes

• L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage

• Le nombre de cellules est compté• Le nombre de cellules dans le volume donné

est déterminé

Comptes sur Hémacytomètre

• Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes, chacune d’un volume de 0.1 mm3 quand elles sont recouverte d’une lamelle

Application à la Lame d’Hémacytomètre

• Remplir la cellule avec la suspension a être compté

• Laisser la cellule se remplir par capillarité

• Ne pas forcer le remplissage avec de la pression

Lamelle

Déterminer le Compte Direct

11

• Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants– 8, 8 et 5

• Déterminer la moyenne– (8 + 8 + 5)/3 =7– Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct (suite)

12

• Calculer le volume d’un carré:= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml

• Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré– Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

1mm

1mmDepth: 0.1mm

•Avantages:– Rapide– Culture pas nécessaire– Aucune info préalable nécessaire

• Limitations:– Ne distingue pas vivant de mort– Difficile de distinguer bactéries de détritus

Problème

• Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

Microscopie

Colorations

Coloration Différentielle Coloration de Gram

Divise les bactéries en deux groupesGram Négatives & Gram Positives

Gram Positives

• Colorées Bleu – Bacille

• Genres Bacillus et Clostridium– Coccus

• Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

Gram Négatives

• Colorées Rouges– Bacille:

• Genres Escherichia, Salmonella, Proteus, etc.

– Coccus: • Genres Neisseria, Pneumococcus et Meningococcus

Paroi Cellulaire

19

ParoiPeptidoglycane

MembranePlasmique

Couche deLipopolysaccharide

Absente

Gram + Vs Gram -

Méthode - Coloration Primaire

1. Coloration avec le cristal violet2. Ajout d’iode de Gram (Mordant)

+

Gram positif Gram Négatif

- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS

+ + + + + + + + + + + + + +

Méthode - Étape Différentielle

3. Lavage à alcool

Gram positif Gram Négatif

- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS

+ + + + + + + + + + + + + +

Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé

Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé

Méthode - Contre Coloration

4. Coloration avec la Safranine

22Gram positif Gram Négatif

- - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique - - - - - - - - - - - - - - - Paroi :peptidoglycane LPS

+ + + + + + +

+

+ + + + + + + + + + + + + +

Sommaire

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Fixation

Coloration primaireViolet de cristal

Contre colorationSafranine

LavageDécoloration

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante

• Coloration diagnostique de Mycobactérium– Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre– Paroi cellulaire avec acide mycoïque

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Méthode

• Principe: – Contenu élevé de composés similaires aux cires

dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

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Méthode (Suite)

• La paroi est rendue perméable par la chaleur• Coloration avec de la fuchsine basique

– Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable

• Colorant est piégé

• Lavage avec de l’alcool acide– Étape différentielle

• Mycobactéries retiennent le colorant• Autres bactéries perdent le colorant

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Coloration de Spores

• Spores:– Cellule bactérienne différentiée– Résistante à la chaleur, la déshydratation, les

ultraviolets, et différents traitements chimiques– Typique des bacilles Gram positifs

• Genres Bacillus et Clostridium– Conditions défavorables induisent la sporogénèse

• Différenciation de cellule végétative à l’endospore

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Coloration au Vert de Malachite

• Perméabilisation des spores par la chaleur• Coloration primaire au vert de malachite• Lavage• Contre coloration à la safranine 28

Cellules végétatives

Spores

Endospore

Sporangium