Biotechnologie : Terminologie introduite en 1913 Karl Ereky (Ingnieur agricole Hongrois) Il voulait dvelopper la production agricole pour en faire une matire premire pour la production industrielle de molcules par les mthodologies BIOCHIMIQUES naissantes

Mise en uvre de matriel biologique pour la production de biens et ou de services

Avantages des microorganismes : Multiplication rapide -> bonne rentabilit des infrastructures Se dveloppent sur des nutriments renouvelables Grande diversit mtabolique : peuvent tre utilises pour produire beaucoup de molcules Peuvent tre adapts des objectifs productivistes : slection, gnie gntique, transgnse Peuvent produire des molcules trangres (clonage) Facile cultiver, croissance rapide -> peu de risque de contamination Facilit de purification des molcules produites Production temprature modres (nergtiquement conome)

Historique

Mthodes ancestrale utilises depuis le dbut de lhumanit pour la fabrication de fromages, de pain et de boissons alcoolises.

Pratiques empiriques magiques qui permettaient de conserver les aliments (fermentation, vinification)

Des microorganismes alors compltement mconnus taient luvre

Cette phase de proto-biotechnologie (empirique) a dur jusquau XIX sicle

Cest dire, lpoque pastorienne de la dcouverte des microorganismes et de leur caractrisation

Quelques points de repres : Slection des espces vgtales et animales pratiques des lantiquit Distillation XV me sicle Culture des champignons XVII Sicle Prparation industrielle du sucre de betterave (XVIIme sicle) Prparation de molcules capacits pharmacologiques (XVII me sicle) XVIII sicle essor de la chimie : Lavoisier (respiration, photosynthse fermentations) Chaptal (vinification) Berzelius (la catalyse), purification de la premire diastase (amylase) Pasteur : nature biologique de la fermentation et rle des microorganismes; pasteurisation 1876; dfinition dun enzyme : ferment isol dun organisme vivant 1883; Hause socit Carlsberg : dveloppement des cultures pures de levure 1888; cration de lInstitut Pasteur 1912 dcouverte des vitamines -> production industrielle par des microorganismes 1913 Premire prparation denzymes pour la lessive 1915 production de solvants par fermentation anarobie (explosifs)

1940-45 purification des antibiotiques (Fleming 1929, penicillium utiliss comme agent antibactrien des 1870) 1963 commercialisation des premires lessives aux enzymes 1972-74 les premiers OGM (clonage dexognes dans E. coli, vecteurs bactriens : virus et plasmides 1980 Premiers OGM dintrt industriel (production insuline, hormones de croissance, interfron) 1980-81 Transgnse vgtale (Plasmide Ti dAgrobacterium) 1987 Mas transgnique 1994 Tomates transgniques etc

Procaryotes (anucles) : les bactries et les arches (archae)

Les microorganismes utiliss en biotechnologies sont principalement des champignons et des bactries

Exemple de procaryote : une bactrie frquente du

tube digestif de lHomme : Escherichia coli vue en microscopie lectronique,

(Photo F. Sauvager / Universit Rennes).

Exemple de procaryote : archobactrie thermoacidophile (milieu chaud et fortement acide)

Acidianus ambivalens

Microorganismes

Organismes microscopiques souvent unicellulaires

Eucaryotes (nucles) : Champignons, algues, protozoaires

Exemple de protozoaire cili : la paramcie utilise

des cils pour se dplacer et se nourrir Exemple de levure : Saccharomyces cerevisae Elle est utilise dans la fabrication du pain, du vin et de la bire

Exemple dalgues : leuglne

Les bactries sont classes selon :

G+C% : varie de 25 75%

Hybridation des acides nucliques : Cintique de rassociation des ADN dnaturs provenant de 2 gnomes(avant squenage systmatique des gnomes complets) donne une ide de % dhomologies entre gnomes.

Les bactries peuvent aussi tre classes selon :

Analyse phylogntique : tablir une parent entre les organismes et estimer leur temps de divergence

Arbres phylogntiques : reprsentation shmatique de la phylognse (Haekel 1866)

Squenage des gnomes

Etablissement darbre phylogntiques bas sur des donnes de squences.

Principe : Lapparition de mutations tant alatoire et spontane le nombre de mutations (diffrences de squence) qui sparent deux espces mesure le temps qui sest coul depuis leur apparition partir dune espce pr-existante unique.

Cette hypothse revient postuler lexistence dune cellule vivante originale unique quon appelle LUCA pour : Last Universal Common Ancestor)

On raisonne en distance volutive : nombre de substitutions survenues dans les deux lignes depuis leur divergence. Elle est, bien sur, fonction du temps.

Il faut choisir un gne universellement conserv : Systme de transcription, de traduction LARN 16S a t choisi Ses avantages : Prsent dans tous les organismes Structure trs conserve Abondant et facile purifier partir de ribosomes

Principes de la mthode

Aligner plusieurs squences du 16S ayant la mme origine et dnombrer les diffrences.

1 CGUAGACCUGAC (12 mer) X X X 3 diffrences entre les squences; soit une distance volutive de 3/12 = 0,25 2 CCUAGACGUGUC

Si on analyse plus de deux squences (4 : A, B, C et D) on compare les squences 2 2

A-B = 0,3; A-C = 0,44; A-D = 0,61 B-C = 0,31; B-D = 0,46 C-D = 0,43

Puis on tente de construire larbre le plus vraissemblable.

Par exemple

C

B

A

D

0,08

0,23

0,08

0,29

0,13

0,01

Feuille Branche

noeud

Anctre commun

Last Universal Common Ancestor (LUCA) (3,5-4 milliards dannes)

Chloroplastes Mitochondries

(ascomycota)

Diversit du mtabolisme bactrien

Les bactries ont besoin dENERGIE pour se multiplier

Elles tirent leur nergie de lenvironnement

Elles utilisent soit le potentiel chimique des molcules disponibles (chimiotrophes) soit lnergie lumineuse (phototrophes)

Elles se sont adaptes des environnements trs divers

Le potentiel chimique des molcules de lenvironnement (SH2) est transfr la cellule grce des couples oxydo-rducteurs (exemple : A-AH2) SH2 + A (oxyd) -> S (oxyd) + AH2 (rduit) + nergie

Chaque couple a un potentiel doxydo-)rduction qui dtermine le sens de la raction Le couple qui a le potentiel le plus lev est oxydant ; il sera rduit lors de la raction. red ox Succinate / fumarate pot redox = +0,02 V H2O / 1/2 O2 pot redox = 0,82 V FADH2 / FAD pot redox = -0,20 V H2 / H+ pot redox = 0

red ox red ox red ox red ox FADH2 + Fumarate -> succinate + FAD succinate + 1/2 O2 -> H2O + fumarate

Les chaines doxydo rductions (transfert dlectrons) permettent la cellule de rcuprer lnergie

SH2

S AH2

A BH2

B

C

CH2

NH2

N

Accepteur final (donneur dlectrons)

Accepteur rduit

Rcupration de lnergie Couplage avec la machinerie de synthse dATP

Le potentiel chimique diminue progressivement

Les bactries utilisent lnergie chimique dun grand nombre de molcules minrales ou organiques

Le shma ci-dessus montre que les bactries ont galement besoin dun ACCEPTEUR final qui peut tre loxygne ou une molcule minrale (lithotrophe) ou organiques (organotrophe). Laccepteur peut tre intracellulaire (fermentation) ou extracellulaire (respiration). La respiration peut tre anarobie si laccepteur nest pas loxygne (NO3-/NO2-; SO42-/H2S; etc)

Les bactries ont galement besoin de MATIRE pour se multiplier (synthse de biomasse) quelles peuvent puiser dans des molcules organiques (htrotrophe) ou minrale (autotrophe) La source dnergie peut galement tre utilise comme source de matire. Cest le cas des bactries Htrotrophes qui oxydent des molcules organiques qui leur fournissent galement carbone et azote. Les bactries chimiotrophes ont besoin de sources de carbone distinctes de leur source dnergie (H2, H2S, NH3 etc;)

Les bactries qui utilisent des sources dnergie minrales faible potentiel chimique ont en gnral un mtabolisme nergtique de type arobie (rentabilit maximum de lnergie interne)

Quelques exemples de sources dnergie et daccepteurs finaux des chanes

doxydo-rduction

Bactries chimiotrophes utilisant une source dnergie minrale (non organique)

Bactries utilisatrice hydrogne H2 est donneur dnergie, laccepteur dH est lOxygne, la source de carbone est le CO2 H2 + 2O2 + CO2 -> molcules organiques (biomasse) + H2O Aquifex, Hydrogenobaculum

Bactries sulfureuses Donneurs dnergie : H2S, S, S2O3-, laccepteur de proton est O2, elle librent de lacide sulfurique (SO42-), elle utilisent CO2 comme source de carbone. Beggiatoa, Thiotrix, Thiobacilles (trs corrosives : maladie de la pierre)

Bactries utilisant le Fer et le Manganse Fe2+ + O2 + H+ -> Fe3+ + H2O Sphaerotilus, Leptothrix, Thiobacillus Sphaerotilus est utilis pour purer leau (elle est prsente dans les boues actives des purateurs) Gallionela prolifre dans les canalisations deau potable quelle peut boucher

Bactries nitrifiantes utilisant les nitrates Elle utilisent NH3 ou les nitrites NO2- commes source dnergie et forment des nitrates (NO2-3) . Laccepteur dhydrogne est toujours O2 et la source de carbone est le CO2. Certaines transforment NH3 en NO2- (nitrites)

Bactries lithotrophes anarobies (laccepteur final dH est extracellulaire et nest pas lO2 :

respiration anarobie)

Sources dnergie : H2S, sulfures, thiosulfates Les accepteurs dH sont principalement : les nitrates, les sulfates te les carbonates.

Nitrates : NO3- -> NO2- NO ou N2

E. coli, Bacilli, Pseudomonas, peuvent avoir ce genre de mtabolisme en anarobie

Mais les vraies bactries dnitrifiantes assurant la dnitrification complte sont peu nombreuses : Thiobacillus denitrificans

Sulfates : Desulfovibrio rduit SO42- (accepteur dH) en sulfures (S2-) puis en hydrogne sulfur (H2S) Source dnergie : Carbone organique et aussi H2.

Carbonates : Bactries mthanognes. Methanobactrium, Methanobacillus, Methanococcus, Methanosarcina

Bactries utilisant les molcules organiques comme sources dnergie et de carbone et lO2 comme accepteur dH2. Elles librent du CO2 (Organotrophes arobies)

Certaines comme Pseudomonas peuvent utiliser juqu 80 molcules diffrentes comme source dnergie alors que Diplococcus glycinophilus nen utilise quune : le glycocolle.

Certaines bactries (Acetomonas, Acetobactre) noxydent pas compltement la molcule utilise comme source dnergie. Elles librent de lacide actique et aussi de lacide fumarique, de lacide citrique etc

Un grand nombre de bactries peuvent changer de mtabolisme suivant leur environnement : des lithotrophes anarobies peuvent devenir organotrophes anarobies en prsence de certaines molcules organiques

Certaines bactries utilisent des molcules organiques intracellulaires comme accepteur dH2

Ce type de mtabolisme anarobie sappelle fermentation.

Il y a plusieurs types de fermentation dans differents types de cellules : fermentation alcoolique ( Ethanol), homolactique, mixte, htrolactique, butyrique, actobutyrique, propionique

Toutes ces voies ncessitent lintervention dun accepteur de protons (NAD+/NADH+H+) qui rduit laccepteur organique final.

Mtabolites primaires

Biomasse

Mtabolites Primaires et Secondaires

Mtabolites secondaires

Un exemple de mtabolite primaire lthanol

Lalcool est produit par Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergiensis partir de sucres assimilables : le glucose, le fructose, le saccharose (Glu (alpha 1-4) Fru), le maltose (Glu (alpha 1-4) Glu), le maltotriose (Glu (alpha 1-4) Glu (alpha 1-4) Glu).

S. c. produit 0,51 g dthanol partir de 1g de glucose dans des conditions anarobies. 90% du glucose est transform en thanol et 10% sert faire de la biomasse.

Lalcool industriel : les biocarburants (voir cours Mme Buffard)

Alcool alimentaire : boissons alcoolises

Cest une mthode trs ancienne dj pratique plusieurs sicles avant notre re pour conserver les aliments.

De nombreuses boissons sont fabriques partir de diffrents produits naturels (essentiellement des produits agricoles) contenant des sucres ou des polysaccharides.

Le vin

La quasi totalit des vins sont obtenus partir des raisins produits par les nombreuses varits de Vitis vitifera; on parle de cpages, il y en a environ 5000.

La nature dun vin est fonction du cpage, de la nature du sol, des conditions climatiques et du mode de vinification

La fermentation des fruits est un phnomne spontan du la prsence de levure indignes leur surface

Le jus de raisin qui a une teneur trs forte en sucre est un de ceux qui fermentent le plus facilement

La vinification consiste contrler le phnomne naturel. Les premiers exemples de domestication de la vigne datent du IVme sicle avant JC en Grce, Egypte, Rome et en Gaule. Elle sest ensuite dveloppe dans les rgions tempres

Origine tymologique : le sanscrit Vna qui dsignait un liquide sucr en Inde. La racine a t conserve dans de nombreuses langues. Le vin a ses divinits : Bacchus (Rome), Dionysos (Grce).

La religion catholique a beaucoup oeuvre au maintien de la culture de la vigne dans les monastres.

XIX sicle; le philloxera (insecte qui sattaque au racines des plantes) a dcim les vignes europennes. Les vignes actuelles sont des cpages europens grffs sur des portes greffes amricains (vitis ripana et vitis rupestris).

Un des aspects de la vinification consiste prparer un mot contenant les lments ncessaires la confection du vin tout en vitant dextraire les molcules lorigine de qualits organoleptiques indsirables

Les diffrentes structures du grains de raisin (pellicules, pulpe, ppins) contiennent des lments diffrents

Ppins : lments phnoliques qui participent la vinification des vins rouges et substances huileuses indsirables

Pellicule : anthocyanes et composs volatiles responsables de la couleur et de lodeur des raisins qui peuvent tre plus ou moins extraits lors de la prparation des mots

La pulpe est compose de grosses cellules vgtales entoures de parois cellulosiques qui constituent 75 85% du grain de raisin.

Le grain de raisin contient entre 150 et 250 g/l de sucres. Jusqu 300 g/l dans certains cpages tels que le muscat. Les baies concentres par la croissance de moisissures ( pourritures ) peuvent dpasser cette concentration

Le glucose et le fructose sont en quantit peu prs quivalentes. Ils sont trs largement majoritaires; on trouve aussi un peu de saccharose de xylose, de rhamnose de maltose et de raffinose

La rpartition des sucres dans la grain nest pas homogne; ils sont plus abondants proximit des ppins

Les principaux acides organiques du grain sont les acides tartrique, malique et citrique. Leur concentration est plus importante vers la surface.

Azote et substances azotes : NH4, protines et peptides

Lazote ammoniacal (NH4) facilite beaucoup la croissance des levures lors de la fermentation

Substances odorantes. Principalement localises dans la pellicules elles varient avec les cpages quelles caractrisent Certaines sont prsentes dans le raisin (terpnes) alors que dautres vont acqurir leur caractre odorant la suite de transformations qui se font au cours de la vinification

La vinification

Prparation du substrat

Le raisin est grapp et cras (foul). On peut garder qqs rafles qui fournissent des tanins. Il ne faut pas craser les ppins

Vins blancs / vins rouges Le vin blanc est en gnral prpar partir de raisin blanc mais on peut obtenir du vin blanc avec du raisin Noir. Le vin rouge est toujours obtenu partir de raisin noir.

Vins rouges : le raisin cras contenant encore des rafles, les pellicules et les ppins est incorpor directement dans la cuve de fermentation

Vin blanc : le raisin est grapp, foul et lgrement press. Les rafles et les ppins sont enlevs et les grains restant sont nouveau presss. Les pellicules et les ppins sont finalement spars du mot par soutirage ou centrifugation avant la fermentation.

La fermentation

La fermentation en rouge dure de 3 21 jours et se fait de 25 30C. Il ne faut pas dpasser cette temprature au dessus de laquelle on risque dextraire des quantits excessives de tanins ou autres molcules des pellicules et des ppins

La fermentation en blanc peut se faire jusqu 36 38C (pas de risque dextraction des molcules qui pourraient dvelopper de mauvaises odeurs)

Les mots contiennent des bactries dont il faut restreindre la croissance. Ceci est ralis en ajoutant du SO2 qui a galement lavantage dempcher loxydation.

Les levures indignes prsentes la surface du raison ne permettent pas dobtenir plus de 4 5 degrs dalcool

Pratiquement la fermentation est dclenche par laddition de levures commerciales slectionnes raison de 1 5 106 par ml. Ceci plusieurs avantages : le premier est le contrle et la reproductibilit de la vinification. De plus, elle permet un dmarrage rapide de la fermentation qui limite la croissance bactrienne et loxydation grce un dgagement rapide de CO2

Un peu doxygne est ncessaire au dveloppement des levures (mot lgrement ar lorsquil est transfr dans la cuve de fermentation).

La forte concentration des mots en acide (pH 3 3,9) les protge galement contre le dveloppement des bactries

La croissance des levures est galement facilite par laddition de molcules telles que lacide olque, linolique ncessaires la synthse des acides gras et des strols de la membrane

Les levures ajoutes sont trs caractrises. Elles sont commercialises sous forme de levures sches actives (LSA) par des levuristes . Des souches de levure diffrentes sont utilises pour faire des vins diffrents.

En plus de lalcool et le CO2 la fermentation des hexoses par la levure produit de nombreuses autres molcules; par exemple : le glycrol, lacide lactique, lactaldhyde, lacide succinique, et quelques autres alcools. Le bilan global est:

180 g de glucose -> 83,6 g de CO2 + 87,4 g dthanol + 8,1 g de molcules diverses + 1 g de levure

Le degr final dalcool est fonction de la teneur en sucre : 1degr = 18g/l (vin rouge) et 17 g/l (blanc)

Les levures classiques ne tolrent pas plus de 12 14 degrs dalcool; elles ne se dveloppent plus et ne fermentent plus. On ne dpasse habituellement pas 14 15 degrs. Certaines levures slectionnes peuvent supporter 18 20 dalcool.

Les acides amins et les protines du jus de raisin sont indispensables la croissance de la levure

Certains vins sont le sige dune deuxime fermentation malolactique qui transforme le diacide acide malique (COOH- CH2-HCOH-COOH) en acide lactique (CH3- CH2-HCOH-COOH) monoacide. Elle a lieu dans des vins acides vendangs prcocement quand le raisin nest pas compltement mur (pH 3 3,5). Elle est en gnral amorce par Leuconostoc oenos. Les bactries lactiques dgradent galement lacide citrique les vins rouges doivent en gnral subir une fermentation lactique

Quelques variantes. Les Sauternes : On utilise des levures particulires qui utilisent prfrentiellement le fructose. Les sucres restant confre le got spcifique ces vins.

Vins ross : Comme les vins rouges mais macration plus courte : 1 2 jours au lieu de 4 5 jours pour les vins rouges. La macration peut durer jusqu 15 jours pour les vins colors trs taniques.

Champagne Il tait fabriqu dans des rgions septentrionales ou le raisin est peu sucr et la fermentation lente

Le raisin est ramass tt et le pressage est lger : clatement de faon rcuprer prfrentiellement la pulpe la plus riche en sucre (temprature lente)

Fermentation dclenche par levures commerciales, pas de fermentation malolactique

Le vin est mis en bouteille, on rajoute du sucre et des levures et la fermentation se poursuit 10C pendant 4 mois en bouteilles

Il faut ensuite liminer les levures : les bouteilles renverses, le goulot congels et le bouchon retir. Les levures accumules dans le goulot sont extraites, le volume est rajust et les bouteilles rebouches. Lopration est ralise au froid afin que le gaz carbonique produit au cours de la fermentation secondaire ne schappe pas ; il reste soluble.

Dans la mthode originale on najoutait pas de levure. Le vin tait seulement mis en bouteille avant la fin de la premire fermentation

Les dernires tapes

Aprs fermentation le fin est filtr. Cette tape est prcde de la clarification afin de limiter les troubles et dpts qui sont un inconvnient commercial. Les troubles sont dus la formation dagrgats dus loxydation du fer la modification des protines par les tanins temprature leve au cours de la fermentation

On peut dcanter et transvaser le vin. On peut aider la floculation en ajoutant des colles charges positivement : sang de buf, casine, glatine, blanc duf.

On rajoute parfois des enzymes (enzymes pectinolytiques, glucanases qui facilitent la filtration

On ajoute parfois des enzymes protolytiques au dbut de la fermentation pour librer des acides amins qui facilitent la croissance des levures

Le vieillissement Les esters (raction des acides avec les alcools) vont se former au cours du temps Certains de ces esters, trs odorants (et volatiles) sont indsirables

Les vins peuvent tre conservs en bouteille ou en ft (toujours en chne). Le bois cde ses tanins au vin, la conservation en ft permet loxydation. Les grands vins sont vieillis en fts ou ils acquirent un fumet bois Loxydation est arrte lors de la mise en bouteille. Le got des vins rouges volue lentement en bouteille probablement cause de processus de rduction Les vins blancs ne doivent pas soxyder : ils sont vieillis en bouteille.

Tentatives damlioration des procds industriels de fabrique du vin

Slection des souches pures de levure. Il est cependant parfois impossible de reproduire avec une levure les proprits des levures indignes utilises pour la vinification de certains vins

Tentatives damlioration gntiques; TRES rglement (ne peuvent tre utilises comme donneur que des gnes dorganismes normalement utiliss dans la fabrication du vin)

On essaye de modifier les levures afin de mieux contrler lacidit, damliorer le rendement alcoolique, la floculation (production denzymes extracellulaires) ou les proprits organoleptiques. Exemples : levures capables de faire la fermentation malolactique (clonage denzymes bactriens), construction de levure surproduisant du glycrol (auto clonage des gnes de levure en multicopies)

La bire

Les matriaux vgtaux utiliss ne sont pas directement utilisables par la levure. Ils contiennent des polysaccharides qui doivent tre transforms en sucres fermentescibles

Il sagit essentiellement de lamidon (polyglucose) contenu dans les graines de crales : orge, seigne, Millet, Sorgo mais aussi de pommes de terres et de betteraves.

La bire est essentiellement faite partir dorge. Mais elle peut galement contenir dautres crales (voir ci-dessous)

Le premire tape consiste dgrader lamidon dorge ou dautres crales laide damylases. Les amylases sont obtenues en faisant germer les graines

Le maltage

Le malt est de lorge dont la germination a t arrte un stade prcoce. Il est prpar par un malteur Aprs la rcolte lorge est conserv 2 mois en dormance avant dtre malt. La premire tape est le trempage : priodes de trempages de 10 heures entrecoupes dtapes de passage lair libre. Elle est ralise 10C et dure 2 3 jours. Les graines humidifies (d dhumidit passe de 10-12% 44-50%) sont tales dans des germoirs ; la temprature est de 15C. Il y a apparition dune plantule et de radicelles (petite plante). Les graines sont rgulirement remues afin de favoriser loxygnation et dempcher lentremlement des radicelles. La germination est arrte aprs environ une semaine pendant laquelle il y a eu synthse d!- et de "-amylases ainsi que de glucanases, xylanases, peptidases, pectases capables de dgrader la parroi de la graine qui sera ainsi fragilise. Cest le malt vert . A ce stade la graine a perdu environ 5% de son amidon utilis comme nergie et source de nutriments pour le dveloppement de la graine. Elle contient un excs damylase capable de dgrader 2 fois la quantit damidon contenue dans la graine. Le touraillage pour but de stopper la germination. Le malte vert est dshydrat (dessiccation) dans un four ventil 45 pendant une trentaine dheures. Le d dhumidit est ramen environ 4%. Dans ces conditions, les enzymes sont inactifs mais nont pas t dnaturs

Trempage

Germination

Tourraillage, coup de feu

Le malteur procde alors un coup de feu (chauffage 85C-10C) de 1 4 heures qui dtermine ltat final du malte; le malt ple (coup de feu court) est utilis pour les bires les plus courantes, le malt ambr (coup de feu plus long et chaud) qui apporte couleur et arme, et enfin le malt torrfi utilis pour les bires irlandaises.

Le malt est ensuite commercialisable (les radicelles sont utilises pour lalimentation des animaux). Cest un produit inerte qui peut tre stock et transport.

Le brassage

La premire tape est la saccharification qui consiste dgrader lamidon du malt avec les enzymes synthtises au cours du maltage. Les grains de malt sont concasss en prsence deau chaude; on obtient la mache laquelle on peut ajouter dautres crales non maltes (mas, riz, bl*). Un des objectifs est de rduire les cots. Un exemple : une bire blanche contenant du bl (Hoegaardeen, Louvain, B). Elle contient 50 60

% dorge malt, 25/50% de malt de froment, 10 50% de froment non malt et 0,1 5% davoine

ou de sarrasin.

En France, lappellation bire implique que la mache contient au moins 50% de malt dorge. Il y a plusieurs procds dinfusion (monopaliers, multipaliers, chauffage direct) qui ont tous pour objectifs de favoriser lactivit des diffrents enzymes contenu dans le malt. Linfusion multipaliers dcrites ci-dessous est trs utilise dans le nord de la France. La mache (malt concass mlang de leau et port 45C) est port des paliers successifs de 64C puis 72C par addition deau bouillante. Le volume dorigine est le plus faible possible afin que la mache finale (le brassin) ne soit pas trop dilue aprs ces oprations. Dautres mthodes consistent prlever une partie de la mache qui est 45C, la porter bullition et la rajouter au reste de la mache afin dobtenir une temprature de 64C. On peut procder de la mme manire pour atteindre le palier de temprature suivant. Lbullition lavantage de glatiner lamidon qui nest pas trs soluble : le brassin est un mlange trs visqueux quil faut brasser pour lhomogniser. Les diffrents paliers correspondent aux tempratures optimales de diffrents denzymes. Ie temps dincubation ces tempratures laisse aux enzymes le temps dagir sur les composants de la mache avant quune lvation de temprature ne les inactive.

Les diffrents paliers Emptage : 45-55C, pH 3,8 5,9 pendant 10-30 minutes. Les protases agissent, elle liminent des protines indsirables et insolubles et fournissent des acides amins. Une grande partie des protines responsable du trouble de la bire sont limines cette tape Saccharification : 55C-65C pH 5 5,5 pendant 30 60 minutes. Les !-amylases dgradent lamidon. Lamidon est un polymre linaire (amylose) structure branche.

Les !-amylases attaquent les extrmits de lamylose, elles librent des molcules de maltose assimilables. Les "-amylases librent des dextrines Le palier de saccharification favorise lactivit des !-amylases

Le palier suivant : 68-72C pH 5,3, 5,7 pendant 30 90 minutes seule l#"-amylase est encore active elle libre des dextrines non fermentescibles. Cette tape favorise le corps de la bire.

Le dernier palier 80C pendant 10 15 minutes inactive compltement les enzymes.

Le mot est ensuite filtr (percolation = filtration lente sous pression) : les dchets dresches sont rcuprs comme aliments pour le btail

Laromatisation par le houblon (inflorescences femelles) est faite cette tape (2heures). Le houblon donne une saveur amre due la lupuline. Il tait lorigine ajout pour ses proprits antibiotiques favorisant la conservation de la bire

liaisons "1-4 liaisons "1-6

"-amylases

!-amylases

Dresches

La fermentation

Le mot est ensemens avec des levures (107 cellules/ml) qui proviennent en gnral dune fermentation prcdente. Il y a plusieurs types de fermentations qui dpendent des levures utilises

Fermentation basses. Elles sont ralises 5-14C par saccharomyces uvarum (anciennement carlsbergensis). La fermentation dure une dizaine de jours. Les levures sdimentent au fond de la cuve ou elles peuvent tre rcupres. Types de bires : lager (de lagern : stocker en allemand). Elles sont conserves

Les fermentations hautes. Sont ralises 15-25C par saccharomyces cerevisiae. Elles durent de 4 8 jours. Types de bire ale, stout (UK). Les levures remontent la surface du mot pendant la fermentation. Les degrs dalcool sont suprieurs ceux obtenus par la fermentation basse.

Fermentation spontanes : Brettanomyces bruxellencis, ou B. lambic. Ensemencement naturel du mot par les levures indignes. Procd limit une rgion de Belgique qui produit la bire Lambic.

A la fin de la fermentation 70% de lamidon a t transform en sucres fermentescibles qui ont t compltement utiliss par la levure. Le reste est sous forme de dextrines.

La bire est finalement clarifie (filtration) sur Kiesellgurh (diatomes fossiles) et mises en bouteilles. Elle doit tre conserve labri de loxygne et des contaminations bactriennes. Quelques bires de grande consommation sont pasteuriss pour faciliter la conservation

Certaines bires subissent des fermentations secondaires: bires de garde du nord de la France. Ce sont le plus souvent des fermentations hautes (d alcool lev : 7-8) qui ne sont pas filtres. La fermentation continue en bouteille fermes (garde).

Garde (0C)

Filtration

Amlioration des procds

Levures surproductrices de !-glucanases (fabrique mais non autorise) Levures produisant des amylases -clonage de la glucoamylase de Saccharomyces dicistaticus (libre du glucose et coupe les liaisons "1-6) dans S. uvarum -clonage des gnes de la glucoamylase, de l#"-amylase et de la pullulanase (glucanase spcifique des liaisons "1-6; le pullulane est un polymre de glucoses relis par des liaisons "1-6) Elimination se produits secondaires indsirables; le diactyl ralenti le murissement de la bire. Ceci est ralis en faisant exprimer lactolactate carboxylase qui limine lactolactate utilis pour former le diactyl - une protine de bl la puro-indoline est ajoute (10g/ml) pour stabiliser la mousse. A linverse les lipides dstabilisent la mousse.

Un autre exemple impliquant une distillation : le Whisky

La fabrication du whisky utilise galement du malt comme source damidon et denzymes Le procd de prparation du malt est trs proche de celui dcrit pour la bire Germination : humidification, graines tales sur une paisseur de 20-30cms et retournes rgulirement pendant une semaine 12 jours. Touraillage : chauffage dans un four qui peut tre chauff la tourbe (Ecosse Irelande). La prsence de tourbe dans le combustible modifie la saveur du malt

Le malt livr la distillerie est dans un premier temps broy sous forme de farine grossire appele Grist

Le Grist est ensuite rhydrat (1 volume de grist + 4 volume dH2O). Lorigine de leau est trs importante.

Comme pour la bire, la conversion de lamidon en sucres fermentescibles est ralise par paliers (3) entre 65 et 95C. Les cuves font 25000 litres. Le mot est ensuite spar en drafts (dchets) recycls pour lalimentation du btail. Cette opration est appele brassage car le mlange trs visqueux doit tre brass pour lhomogniser et faciliter lcoulement du mot Le mot est ensuite mis en cuve dinox (autrefois en bois (pin ou mlze) et la levure est ajoute On obtient un bier 8 degrs dalcool.

Le bier sera utilis tel quel pour tre distill

Les distilleurs apportent une grande importance la forme de lalambic et au cuivre dont il est fait Le whisky peut tre distill 2 3 fois

Le whisky est ensuite vieilli dans des futs de chne, le plus souvent usags, pendant au moins 3 ans. Cest le temps minimum pour mriter lappellation whisky.

Les fts usags peuvent confrer au whisky un got particulier qui dpend de la nature de lalcool qui y avait t prpar. Par exemple du Sherry (Xeres). Ces grands futs (420-520 litres) parmi les plus chers sont dabord utiliss (lous) pour lever du Xeres avant dtre utiliss pour faire vieillir du Whisky. Les distilleries utilisent galement des fts ayant contenu du madre, du porto, du sauterne, du bordeaux, du calvados du rhum pour enrichir la palette gustative des whiskys. Le vieillissement peut commencer dans des fts ayant contenu du Bourbon amricain avant dtre transfr dans les fts mentionnes plus haut.

Le vieillissement cause une vaporation (le chne est poreux). La teneur en alcool la sortie de lalambic est de 70%. Elle diminue avec le temps cest la part des anges Le whisky est ensuite embouteill. Le whisky est stable en bouteille. Le titre est ajust 40% en alcool avec de leau. Certains whisky titrent 43 ou 46 pour des problmes de lgislation.

Dautres crales sont employes pour faire du whisky : Pure malt = 100% malt dorge; Le bourbon amricain contient du malt dorge et du seigle. On peut y ajouter des pommes de terre, de la betterave ou de lavoine. Les whisky cossais et irlandais peuvent contenir du bl

Beaucoup dacides amins sont produits par voie fermentaire

Le glutamate (agent de sapidit), qqs acides amins doivent tre ajouts aux aliments dorigine vgtale (lysine) ils sont essentiels pour lhomme

Prparation du glutamate.

Bactrie : Corynbactrium glutamicum Milieu de culture (amidon ou extraits de betterave : on utilise la mlasse qui est un rsidu des sucreries). Il faut ajouter des sels dammonium car les acides amins contiennent de lazote. LUre peut tre utilise Le pH est maintenu 7-8 en ajoutant du NH3 gazeux.

Lacide glutamique est secrt dans le milieu, ltape limitante est la scrtion. Lapport dacides gras favorise la production de Glu; peut tre en modifiant les proprits de la membrane. Laddition de pnicilline (en quantit subltale) qui perturbe la synthse des enveloppes bactriennes favorise la production de Glu; peut tre en augmentant la porosit des membranes.

La souche industrielle est mute dans le cycle de Krebs (ceto-glutarate deshydrognase). Le cycle du glyoxylate shunte le cycle. Cette mutation favorise la transformation de lisocitrate en"cetoglutarate puis la synthse de glutamate.

Prparation de la lysine

Cest la mme bactrie qui est utilise mais elle est modifie dans a voie mtabolique qui aboutit la synthse de lysine, methionine, thronine et isoleucine.

La lysine est scrte on obtient jusqu 40g/l de lysine.

Les antibiotiques

On connat environ 8000 antibiotiques et on en dcouvre plusieurs chaque anne. Une cinquantaine sont utiliss des fins thrapeutiques

Les antibiotiques sont des mtabolites secondaires dont la synthse drive de celle de mtabolites primaires (voir diapo)

La plupart sont synthtiss partir de champignons (penicillium) ou de bactries (bacilli, actynomyctes) (voir tableau)

Les antibiotiques se rpartissent en plusieurs catgories dpendantes de leur nature chimlque

Les plus populaires sont les !-lactams qui sont des drivs dacides amin. La valine donne le cycle !-lactam Les principaux (pnicillines (la cystine donne le cycle thiazolidine), cphalosporines, cphalines) Ils agissent en inhibant la synthse du peptidiglycane (ils empchent la transpeptidation qui forme le rseau du peptidoglycane)

Penicilline G (la premire isole) active contre la gram+. Nouvelles pnicillines actives contre le gram-

Le penicillium produit plusieurs penicillines naturelles (G, F, K, X) parmi lesquelles seule la penicilline G est utilisable en thrapeutique. On peut influencer la synthse des pnicillines en ajoutant dans le milieu des molcules qui seront incorpores comme chane latrale (penicilllines G, V et 0 byosynthtiques voir tableau). Les trois sont utilisables.

On produit galement des penicillines semi-synthtiques partir de lacide 6-aminopenicillanique sur lequel on greffe des radicaux (voir tableau)

Ils existe de nombreux autres !-lactams (tableau) et on en cre des nouveaux par voie chimique (tableau)

Production de penicilline

La dcouverte 1929 Alexander Fleming : colonie de Staphylococcus aureus lyses par un moisissure contaminant la boite dagar. La penicilline est toujours lantibiotique le plus facile utiliser.

La souche originale est Pnicillium notatum. Elle produisait 1,2 mg/l (2 IU) de pnicilline. La recherche dautres souches conduit la lidentification de Penicillium chrysogenum NRRL-1951 qui tait plus approprie pour les cultures submerges. Elle produisait 120 IU/ml. La recherche de variants a permis disoler la souche B25 produisant 3 fois plus. Une premire mutagnse aux UV a donn une souche X1612 (500 IU/ml). Elle a t suivie par une mutagnse chimique qui a permis disoler la souche Wisconsin Wis Q176 qui produisait 900 IU/ml.

Lamlioration de la souche industrielle a pu tre encore amliore la suite de la dcouverte de la voie de biosynthse qui a permis dimaginer des mthodes de slections diffrentes

Lamlioration des connaissance du cycle de dveloppement de Penicillium c. et de son mode de reproduction a permis damliorer les croisements par les mthodes de fusion dhyphes haplodes, recombinaison mitotique, et fusions de protoplastes.

Ces techniques de plus en plus sophistiques ont abouti lobtention dune souche produisant 85000 IU/ml; soit plus de 700 fois plus que la souche de P. c. dorigine. Environ 40 000 fois plus que la Souche P. n. de Fleming.

Lamlioration des souches industrielle dj performantes est difficile. Il est en effet compliqu de diffrencier une souche qui produirait 1000 IU (soit un peu plus de 1%) de plus que la souche actuellement utilise.

Haplode

Production Industrielle de penicilline La pnicilline est synthtise partir de la valine et de la cystine. Lefficacit de la synthse dpend de lapport de val et de souffre. La lysine rtroinhibe la synthse de pnicilline. Il y a galement un effet de rpression catabolique par le glucose

La production se fait sur un extrait de bl ou de mas (riche en protines), enrichi en ammoniaque et en sels. La source de carbone est le glucose, le lactose ou la mlasse (sous produit de sucreries). La production se fait dans un racteur (batch) agit de 2,5 105 litres partir dune ampoule de spores

Le racteur est strilis la vapeur. Il est aliment avec un milieu strile et en oxygne strilis par filtration Il faut dvelopper un inoculum de taille suffisante qui puisse se dvelopper dans un trs grand volume. Cela est ralis en effectuant des cultures successives dans les fermenteurs de tailles croissantes. La premire prculture est faite dans un erlen de 1 litre. Les bactries en phase exponentielles sont transfres dans un fermenteur plus grand de 10 L o la culture continue jusqu tre transfre dans un rcipient de 103 L puis 104 L puis enfin le fermenteur final.

La fermentation est troitement surveille : le glucose est ajout en continu, le pH est contrl; elle dure 6 8 jours. La temprature peut varier au cours de la fermentation pour favoriser le dveloppement du myclium (30C) ou la production dantibiotique (25C)

Larrt de la fermentation et la rcupration des produits est base sur quatre critres mesure de la concentration de pnicilline rduction de la consommation de glucose rduction de 02 dissout tendance forte un changement de pH

Autres antibiotiques

Aminoglucosides : streptomycines, kanamycine, gentamycine, neomycine Actives contre les bactries gram- A permis de lutter efficacement contre la tuberculose (avance majeur) Inconvnients : beaucoup de rsistantes dues des mutations des protines ribosomales Supplant par pnicillines actives sir gram-

Macrolides : Erythromycine, olandomycine, ttracyclines Trs utilises, large spectres sur gram+ et -

Problme des spectres daction (voir tableau)

Mycobacterium tuberculosis Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Bordetella pertussis

Amylose (linaire) Amylopectine (branch) ~ 40000 rsidus glucose

liaisons "1-4 liaisons "1-6

"-amylases

!-amylases

gluco-amylases

Prpare partir de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou Aspergillus oryzae. Lenzyme thermostable 110C de B. Licheniformis permet de raliser en une tape la liqufaction ( haute temprature = 110C) et la dgradation de lamidon.

La gluco-amylase qui coupe les liaisons "1-6 est isole de champignons filamenteux : Aspergillus niger ou orizae

Lamidon est dgrad jusqu diffrents stades

Hydrolyse partielle faible -> malto dextrines (aliments pour bbs) Hydrolyse partielle -> Sirop de glucose + maltose (Confiserie biscuiterie) -> Sirop de glucose (Confiserie, brasserie, confiturerie, boissons

Hydrolyse totale -> Sirop de glucose 90-99% Concentration et cristallisation (Alimentation, Fermentation, Pharmacie : excipients)

Isomrisation sous forme de fructose (Boisson, ptisserie, biscuiterie, confiserie, confitures

hydrognation -> sorbitol (plastifiants, textile, papeterie, dittique, vitamine C)

Lhydrolyse de glucose modifie plusieurs proprits de lamidon

pouvoir sucrant

fermentescibilit

viscosit

pouvoir liant

Lisomrisation du glucose en fructose augmente le pouvoir sucrant

Le pouvoir sucrant du glucose est faible par rapport celui du saccharose (canne sucre et betterave) et du fructose (saccharose = glucose + fructose)

pouvoir dulcorant relatif glucose 68 saccharose 100 fructose 120 150

Le glucose est incub en prsence de glucose isomrase isole de Bacillus coagulens ou de Streptomyces murinus. Dans la cellule cet enzyme est une xylose-isomrase dont lactivit est dvoye en remplaant le Mn2+ par des ions Co2+. Elle est fixe sur une rsine et introduite dans des colonnes (racteurs) sur lequelles ont fait passer le glucose..

La raction sarrre quand 55% du glucose est transform en fructose. Cest ce mlange : HFCS 55 (High Fructose Corn Syrup) prpar partir de Mas (mais aussi partir de bl) qui est utilis pour prparer les soft drinks (Coca, Pepsi).

Le fructose peut tre purifi par chromatographie (HFCS 90) pour tre utilis en patisserie

Saccharose