Biotechnologie végétale

Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale

Exemples d’utilisation en recherche fondamentale

Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques

Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes

signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme

Approches pharmacologiques sur plantules

Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires

Zhu et al.

Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire

Hypersensitive Response (HR)

Interactions plantes / pathogènes

HR

Mort cellulaire

Circonscription du pathogène

SAR

Systemic Acquired Resistance :

« Immunisation des plantes »

Réaction rapide

À plus long terme …

Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac

3 jours d’infection

Nécroses = mort cellulaire

Restriction de la propagation du virus

Lam et al. (2001) Nature

Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells

Composés phénoliques(autofluorescence)

Mort cellulaire(Bleu Evans)

Callose

H2O2

Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible

Inconvénients du modèle plante entière

Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante

Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments

Mesures de flux difficiles Utilisation difficile d’inhibiteurs

Utilisation de suspensions cellulaires

Quantification de la mort cellulaire

Utilisation d’inhibiteurs Petites quantités Rapidité d’absorption

Facilités d’extraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS,

NO…) Activités enzymatiques Extractions d’ARN

Estimation de la mort cellulaire

Colorants des cellules vivantes :

Fluoresceine diacétate Rouge neutre

des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de

propidium

Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie

Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea

H2O Cryptogéine

Prélèvements et comptage de la mort

cellulaire au cours du traitement

Cryptogéine

heures

% mortalité

Témoin

Recherche d’évènements précoces

Cryptogéine

heures

% mortalité

Témoin

Que se passe-t-il pendant ces premières heures?

Synthèse des composés phénoliques

H2O

Cry 50 µM

Transcription du gène codant la PAL

Zhang et al. 1998 Plant Cell

Suivi des concentrations ioniques intracellulaires

Exemple du calcium

Sondes calciques

Pénétration des sondes

Problème : sondes chargées négativement, imperméantes

Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM)

Les molécules pénètrent les cellules Action d’esterases endogènes Libération des formes actives dans le

cytoplasme

Inconvénients

Sensibilité au pH : Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique

plus qualitatif que réellement quantitatif

Suivi du calcium intracellulaire

Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

Ca2+

Ca2+

Ca2+

coelentérazine

apoaequorine

++ O2

Ca2+

Ca2+

Ca2+

+ CO2

+λ=469nm

calcium

Mode d’action de la coelentérazine

Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium

Temps (min)

Cry (0.5 mM Ca2+)

Cry (0.4 mM Ca2+)

Cry (0.3 mM Ca2+)

Cry (0.2 mM Ca2+)

Cry (0.1 mM Ca2+)Cry (0.1 mM Ca2+)

0 10 20 30 40

2,4

[Ca

2+]

cyt

(µM

)

Lecourieux et al. 2002 Plant Cell

Elaboration d’un modèle de signalisation cellulaire

Modèle très simplifié d’une voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana)

Cry Ca2+

Phosphorylations (kinases)

NO3-

NADPH NADP

H2O2

Mort cellulaire

Utilisation de protoplastes en recherche

Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques

Étude de transports membranaires

Minéraux, H2O

Absorption racinaire

Trafic vasculaire

Relations Source / Puit

Photoassimilats

Étude de transports membranaires

Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale

Les protoplastes : un modèle simple et pertinent

Étude de transports membranaires

Traceurs isotopiques

Sondes fluorescentes

Electrophysiologie

Traceurs isotopiques

Ni

Ni

Ni

Ni

Incubation protoplastes +

63Ni 10 µM

5 mn

CaCa

Ca

Ca

Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s

Filtre 0.45µM

Comptage 63Ni dans le filtre = Ni intracellulaire

Ni

Ni

NiNi

Sondes fluorescentes

Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd)

Lindberg et al. (2004) Planta

Utilisation des protoplastes en électrophysiologie

Caractérisation de canaux voltage- dépendants

Voltage Clamp

Patch Clamp

Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ?

Voltage Clamp

Une électrode enregistre les modifications de tensions

La seconde impose une tension et corrige les variations

Protoplaste

Enregistrement des courants ioniques

Patch Clamp

Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite

•forte résistance : mesure de courants faibles

•étude d’un petit nombre de canaux

Patch Clamp : principes

•Imposition d’un potentiel membranaire

•Mesure d’un courant100 pA

75 ms

Assmann (2001) Plant Physiol.

mV

pA

Adressage des protéines

Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP

Canaux et transporteurs membranaires

Souvent : faible niveau d’expression

Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire

Exemple d’une P-ATPase

ATP

ADPP

N

CPC

N

CPC

GFP Greffage d’une GFP sur une partie soluble

Green Fluorescent Protein

Aequorea victoria

Stucture « cannette de feuillets β »

Spécificité de la GFP:

pas de groupement prosthétique synthétisé séparément

modification d’acides aminés de la chaîne polypeptidique

Hexapeptide :FSYGVQ

Expression transitoire : principe

Insérer un fragment d’ADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin

Observation directe de l’expression

Pas forcément d’intégration chromosomique

Construction HMA4::GFP

HMA4GFP2x35S

Ori coliAmpi

Réplication et sélection dans E. coli

Protéine de fusionPromoteur

Transformation de protoplaste

Préparer de grandes quantités de plasmide

Transformation MaMg :

Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl2 (15 mM)

Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane

Transformation de protoplastes

Dans 300 µl de tampon

106 protoplastes

10 µg de plasmide

100 µg de « DNA carrier »

0-2 °C

300 µl PEG 40%

30 min sur glace

Rinçage par dilution /

sédimentation :

NaCl, CaCl2,

Glucose

Expression

Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri

Incuber 4-48 heures à l’obscurité

Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)

Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4

Témoin : GFP soluble

AtHMA4::GFP

Verret et al. (2004) FEBS Lett.

Thomine et al. (2003) Plant J.

Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3

Isolation de protoplastes spécifiques d’une assise tissulaire

Gène rapporteur GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’une assise tissulaire

Prom GFP

Tri des protoplastes

exprimant la GFP par cytométrie en

flux

Isolement de protoplastes de racines

Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.

Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent

Electrophysiologie

Transcriptomique

Protéomique

Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent

Tri par cytométrie en flux

Fluorescence GFP

Contre marquage IP

Nawy et al. 2005 Plant Cell

Hybridation sur puces à ADN

Nawy et al. 2005 Plant Cell