Post on 03-Apr-2015
Anaïs BrassierInterne de pédiatrie ParisMaster 2 de génétique
Hôpital Necker Enfants MaladesInserm Unité 781Y. De Keyzer; P.de Lonlay; A.Munnich
Maladie rare d’intoxication endogène Maladie du catabolisme des acides aminés
ramifiés de transmission autosomique récessive
Liée à un déficit enzymatique en propionyl CoA carboxylase (PCC)
Bloc enzymatique sur la voie de dégradation de 4 acides aminés essentiels (valine, isoleucine, méthionine, thréonine)
La PCC convertit le propionyl CoA en méthylmalonyl CoA puis transformation en succinyl CoA qui rejoint le cycle de Krebs (CK)
Principal but du CK: synthèse de NADH utilisé par la chaîne respiratoire mitochondriale (CR)
Cycle de Krebs
Forme typique (déficit enzymatique complet): révélation néonatale par un coma progressif avec acido- cétose et hyperammoniémie
Décès rapide en l’absence de traitement
Formes plus tardives (déficit enzymatique partiel): présentations neurodigestives très variables
Formes rares d’AP sensibles à la biotine (B8: cofacteur de la PCC)
Non spécifiques:
Acidose métabolique à TA augmenté Cétose Hyperlactacidémie Hyperammoniémie
Spécifiques:
CAO urinaire: accumulation de métabolites toxiques en amont du déficit (3 OH propionate, tiglyglycine, méthylcitrate, et propionylglycine)
Diagnostic de certitude = diagnostic moléculaire: recherche du déficit enzymatique par séquençage de l’ADN (sur sang ou fibroblastes)
Complications viscérales à long terme fréquentes et graves: Myocardiopathies Insuffisance rénale Pancréatite Complications neurologiques: nécrose aigüe des
noyaux gris centraux (Sd de Leigh); syndrome cérebelleux; régression psychomotrice, mouvements anormaux et convulsions
Pronostic à long terme difficile et incertain: morbidité et mortalité élevées
Rôle toxique connu du propionyl CoA sur certaines enzymes mitochondriales
Complications neurologiques tardives survenant même en cas de contrôle des précurseurs du propionate (régime hypoprotidique suivi limitant l’apport des précurseurs de l’acide propionique)
autre mécanisme physiopathologique…
mécanismes mal élucidés, mais probablement liés à un dysfonctionnement énergétique mitochondrial:
Une accumulation de métabolites toxiques en amont du bloc enzymatique
Un déficit en succinyl CoA en aval du bloc enzymatique
Cycle de Krebs
Le succinyl CoA est un substrat anaplérotique important du CK, impliqué directement dans la synthèse de NADH
Donc: en cas de déficit en succinyl CoA Dysfonctionnement du CK Et déficit secondaire de la CR mitochondriale
Hypothèse: augmenter les réserves de substrats anaplérotiques pour restaurer en partie l’acitivité du CK et le fonctionnement de la CR afin de prévenir les complications tardives de l’AP
Étudier l’efficacité de traitements anaplérotiques in vitro en contournant la voie du propionate pour restaurer l’activité de la CR
Création d’un modèle de cellules hépatocytaires humaines (HepG2) rendues déficientes en PCCA (pas de lignées d’hépatocytes de patients atteints d’AP et le plus souvent les fibroblastes
n’expriment pas le déficit enzymatique) par l’expression de RNAi spécifiques du gène
• synthèse de 4 RNAi ciblant plusieurs régions spécifiques des ARN m de la PCCA (logiciel internet) replacés dans oligonudléotide de 97nt (comportant les motifs de la structure miRNA ) :
miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA
97 nt
miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA
miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA
EcoRI XhoI
130 nt• Sous clonage des oligonucléotides contenant le RNAi dans un plasmide d’expression
EcoR I
Xho I+ E. coliTMP TMP-miPCCA
Ligation Transformation
• amplification par PCR de ces oligonucléotides
Promotor = CMV TRE = Tetracycline Responsive Element (Tet-On) Puromycine resistance (promotor pgk) Expression GFP (IRES)
Carte du vecteur• Transfection des plasmides recombinants dans les cellules
hepG2
• Sélection des clones HepG2 contenant le plasmide ( par puromycine) avec la plus forte diminution d’expression de PCCA
TRE pCMV
Palindrome du microRNA
pPGK puromycine IRES GFP
miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA
Micro RNA repliéRNAi
Hybridation ARNm=> “inactivation”
Traitement des clones par doxycycline (0,1 à & µg/ml pendant 15 jours): induction de l’expression des miRNA spécifiques de la PCCA ( système TETon)
Inhibition de la PCCA:
Caractérisation des clones au niveau protéique: analyse de la PPCA par Western Blot et par dosage de l’activité enzymatique (carboxylation du propionyl CoA avec du C14
et mesure du méthylmalonyl CoA C14 produit)
Mesure de l’activité de la CR mitochondriale par des techniques de spectrophotométrie
Traitements des clones avec la plus forte diminution d’expression de la PCCA, par des substrats anaplérotiques (citrate, aspartate…) pendant 48 à 96h
Comparaison de l’activité de la CR avant et après les traitements anaplérotiques
Sélection de clones stables contenant le plasmide par puromycine
Validation du modèle hépatocytaire par 2 clones indépendants montrant une forte inhibition de la PPCA sous traitement par doxycycline associés à une activité enzymatique très faible ( activité résiduelle de 4 %)
PuromycineSelection
Leonard J 1995, J Inherit Metab Dis 18:430-434 Mardach R, et al. 2005, Mol Genet Metab 85:286-90 Ostergaard E, et al. 2007, Brain 130:853-61 Schwab M, et al. 2006, Biochem J 398:107-12 Yano S, et al. 2003, J Inherit Metab Dis 26:481-8 Brusque M, et al. 2002, Neurochem Int 40:593-601 Alberio S, et al. 2007, Mitochondrion 7:6-12 Spinazzola A, et al. 2006, Nat Genet 38:570-5 Elpeleg O, et al. 2005, Am J Hum Genet 76:1081-6 Mochel F, et al. 2005, Mol Genet Metab 84:305-12 Roe C, et al. 2002, J Clin Invest 110:259-69
citrate
cis-aconitate
isocitrate
-ketoglutarate
succincylCoA
succinate
fumarate
malate
oxaloacétate
acétyl CoA H2O
H2O
CO2
+
CO2 +
Coenzyme A
+ CoA ADP
FADH2
NADH
NADHH2O
NADH
ATP
SDHComplexe II
pyruvate
glucose