Agenda

• Généralités

• Microscopie photonique

• Microscopie électronique

• Microscopie à fluorescence

GÉNÉRALITÉS SUR LA MICROSCOPIE

TD CytologieMICROSCOPIE

“Kitab al-Manazir , le livre des optiques, el Hasan Ibn al-Haytham - donne une

expression « المظامالبيت » ce qui signifie camera obscura

1 Qu’est ce qu’un microscope?

GÉNÉRALITÉS SUR LA MICROSCOPIE

TD CytologieMICROSCOPIE

Instrument qui: - donne une image grossie d’un petit objet (grossisement)

- sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)

- rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

2.1 L’optique/ principe

Structure du microscope optique TD CytologieMICROSCOPIE

Laser

Lampe UV

…

Absorbants

Diffusants

Dépolarisants

Fluorescents

…

Objectifs

Lentilles

…

Caméras

Photodiodes

…

Différents type de microscope optique: Une comparaison

Type de microscope Type de microscope

Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,

Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction

Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées

Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,

Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules

Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.

M I C R O S C O P I E O P T I Q U E

Microscope champs claire: la lumière diffuse à travers le spécimen, donnant un peu de contraste, la coloration de l’objet augmente le contraste mais oblige a fixer les cellules (non viable) ce qui détruit ou bien alter les composants

Microscope à champs obscur: la lumière est difractée à un certain angle vers le spécimen, une lentille condensatrice transmet seulement la lumière réfléchis par l’objet, le champs est noir tendis que le spécimen est plus clair que celui ci

à contraste de phase : les composants du microscope passe les ondes lumineuse hors phase, ce qui produit une différence en contraste et luminescence quand les ondes lumineuse se recombines

a différentiel –contraste –interférence : la lumière polarisée est scindée en deux faisceaux qui ont un trajectoire légèrement diffèrent à travers l’échantillon. La combinaison de ces deux faisceaux, produit un meilleur contraste, spécialement sur les cotés du spécimen

Fluorescence: les colorations fluorescentes absorbe la lumière à une longueur d’onde précise ensuite émettent à une autre longueur d’onde, le filtre ne transmet que la lumière émise

Microscope confocal: la lumière d’un laser est focalisé sur un point en scannant la coloration fluorescente de l’échantillons en deux démentions, ce procédure est appliqué sur un seul plans optique de l’échantillon, tout les autres plans sont exclus Plusieurs plans scannés sont utilisé aussi pour reconstituer une image en 3 D

M I C R O S C O P I E E L E C T R O N I Q U E

Microscope électronique à transmission MET: utilisation d’un faisceau d’électrons « traversant l’échantillon »

Microscope électronique à balayage MEB: utilisation d’un faisceau d’électrons « balayant la surface de l’échantillon,

2.1 L’optique

Structure du microscope optique TD CytologieMICROSCOPIE

l’imagerie microscopique

Structure du microscope optique TD CytologieMICROSCOPIE

Pierre Roux

(CNRS)

Image en microscopie optique selon la technique « Nomarski » qui permet d’améliorer la netteté et le relief.

Cette séquence a été filmée à raison d’une image toutes les 3 secondes, pour une durée d’environ 5 minutes.

Il s’agit ici d’une cellule de type embryonnaire de souris.

Cette cellule émet des extensions, appelées filopodes, en forme de filaments. La membrane forme ensuite des

replis, les lamellipodes, pour rejoindre les filopodes. Ces extensions permettent à la cellule de se déplacer par

reptation. C’est le cytosquelette d’actine qui permet la formation des filopodes et des lamellipodes.

Vidéo montrant l'apoptose d'un ostéoclaste en microscopie optique à contraste de phase. Un ostéoclaste entre en

apoptose, d'autres ostéoclastes sont attirés et phagocytent les débris.

Description: L'ostéoclaste situé en haut à droite (> 5 noyaux) entre en apoptose. On remarque les deux petits ostéoclastes,

ou macrophages, attirés pour "nettoyer" la zone et finalement phagocyter l'ostéoclaste mort. Le macrophage qui a

phagocyté les débris cellulaires finira par se diviser. Deux larges ostéoclastes (sur le coté gauche) vont aussi migrer (mais

lentement) vers le corps apoptotique (séquence de 16 heures).

Cellule Procaryote

Structure cellulaire4.2 Cellule procaryote

3. Le pouvoir de séparation varie directement selon le(s) paramètre(s) suivant(s)

a) Vrai : n caractérise un milieu translucide

b) Vrai : α = demi angle du cône de vision de l’objet par l’objectif du microscope.

c) Faux : grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire

d) Vrai : λ = longueur d’onde

e) Faux.

Pouvoir de séparation = Pouvoir de résolution = 0,61λ/n sin α

Or n= c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse

de la lumière dans le milieu.

a, b, d

4. A propos du microscope optique, quelles sont les propositions vraies et

uniquement les propositions vraies

a) VRAI : Deux lentilles convergentes.

b) VRAI

c) FAUX : Objectif et oculaire.

d) FAUX : le grossissement maximal est de l’ordre de x1000 à x2000.

e) VRAI

f) FAUX

a, b, e

Les Objectifs de Microscope

Structure du microscope optique TD CytologieMICROSCOPIE

Élément le plus important du microscope,

détermine la qualité de l’image

qu’on peut obtenir (forme l’image primaire)

5. Concernant les différents types de microscopes optiques, indiquer la (ou les) proposition (s) exacte (s) :

b) Faux : l’objet observé devient une source lumineuse, d’où une annulation du gain de pouvoir de résolution : on ne

peut distinguer précisément la forme et la taille de la structure. Attention : le microscope à fond noir ne permet de voir

que des petits objets et pas de grosses cellules.

c) Faux : le froid n’est pas un fixateur, il permet seulement de durcir la préparation et de la conserver, il n’y a pas de

fixation.

d) Faux : le stéréomicroscope travaille en réflexion et permet l’observation de cellules vivantes ou d’objets fixés.

e) Faux : il présente une inversion entre objectif et condenseur.

F

a) Faux : pour l’observation de cultures cellulaires, le microscope droit permet un grossissement utile de x5 (ce qui

n’est pas suffisant), le microscope inversé permet un grossissement utile de x40, le grossissement de la loupe

binoculaire est de x80. Pour une coupe le grossissement utile du microscope droit est de x 1250.

6. A propos du microscope électronique, quelles sont les propositions vraies et uniquement les propositions vraies

A, C

a) VRAI

b) FAUX : le microscope électronique à transmission et le microscope électronique à balayage.

c) VRAI

d) FAUX : Les coupes réalisées pour la microscopie électronique à transmission sont plus fines que les

coupes réalisées pour le microscope optique.

e) FAUX : Pas de coupe au MEB donc pas d’inclusion !

f) FAUX

structure

Microscope électronique TD CytologieMICROSCOPIE

l’imagerie microscopique

Structure du microscope électronique TD CytologieMICROSCOPIE

G=1 (à 25cm)

R=100μm

G=1000

R= 0,2μm

G=250000

R= 2.10-4μm

L’ultrastructure cellulaire en microscope électronique TD CytologieMICROSCOPIE

a) Cellule cancéreuse , humaine (b) Grains de pollen

c) Cellule intestinale (d) Mitochondrion

FIGURE Microscopie electronique

Imagerie MEB (a) cancer du sein (b) Grains de pollen du tournesol.

Imagerie MET(c) cellules épithéliales de l intestin du chat (d) Mitochondrie du pancréas de chauvesouris

X400 X20.000

lymphocyteInfiltrat

inflammatoire