1Le nucléosomeLe nucléosome

ADN et chromosomes

ADN et chromosomes

2

Plan

I - Structure et fonction de l'ADNII - ADN chromosomique et emballage

dans la fibre chromatinienne– organisation des gènes le long de la

molécule d'ADN

III - Structure globale des chromosomes– emballage de la molécule d'ADN dans

les chromosomes

3

II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre

chromatinienne1 - Le chromosome2 - Organisation des gènes sur le chromosome3 - Cycle du chromosome4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour

se dupliquer et passer d'une génération à l'autre

5 - Emballage de l'ADN6 - Régulation de l’activité de la chromatine

4

1 - Le chromosome

• L'ADN est divisé en chromosomes• Génome = 3,2 milliards de paires de

nucléotides• 24 chromosomes différents• 1 chromosome = 1 molécule d'ADN +

protéines• ADN + protéines = chromatine

5

Chromatine (Walter Flemming 1882)

• ADN + protéines• Décrit par Flemming (1882)• Colorable

6

Walter Flemming (1843-1905)

• Cytologiste allemand connu pour avoir décrit le premier la division cellulaire appelée mitose.

• Également le premier à décrire les chromosomes.

• Études de médecine et de zoologie jusqu’en 1868 dans plusieurs universités allemandes.

• Thèse sur les muscles ciliaires• Assistant, puis professeur• S'installe définitivement à Kiel comme

professeur d'anatomie et directeur de l'institut d'anatomie, jusqu'à sa retraite en 1901.

7

Walter Flemming (1843-1905)

• Vers le milieu du XIXe siècle, la connaissance de la division cellulaire était limitée par la faible qualité des lentilles des microscopes et des méthodes de coloration.

• Certains scientifiques pensaient qu'il s'agissait d'une division directe, mais d'autres postulaient l'existence de phases intermédiaires pendant lesquelles le noyau « père » se dissociait avant de reconstituer deux noyaux fils.

• Walter Flemming est le premier à décrire, dans son ouvrage Zellsubstanz, Kern, Zelltheilung, publié en 1882, les différentes phases de la division cellulaire.

8

Walter Flemming :Les différentes phases de la division cellulaire

• A cette occasion, il forge les mots mitose, chromatine, plan équatorial et achromatine.

• Il est également un des premiers cytologistes à décrire les chromosomes pendant la division cellulaire, sans pour autant expliquer leur rôle

• Il remarque la constance de leur nombre pour une espèce donnée.

9

Walter Flemming :autres travaux

• Amélioration de certains fixateurs et colorants cellulaires

• Description de l'amitose, division cellulaire directe par étranglement du corps cellulaire et du noyau, phénomène qu'il considère toutefois, de façon erronée, comme pathologique.

10

Protéines de la chromatine

• Emballage de l'ADN• Régulation de l'expression des gènes• Réplication et réparation de l'ADN

11

Chromosome bactérien

• Une seule molécule d'ADN circulaire• Protéines d'emballage différentes• Mal connu

12

Les chromosomes eucaryotes

• Chaque cellule a deux copies de chaque chromosome– une héritée du père et– une héritée de la mère

• Chromosomes homologues• Exception : chromosomes sexuels chez

le mâle– Y hérité du père– X hérité de la mère

13

Jeux chromosomiques

• Homme : 22 paires d'autosomes + X + Y• Femme : 22 paires d'autosomes + X + X• Homme : 46,XY• Femmes : 46,XX

14

Mise en évidence des chromosomes

• Hybridation• Colorants

15

Fig 4-10

• Hybridation de chromosomes humains masculins

• Caryotype spectral (peinture chromosomique)

16

Fig 4-11

• Chromosomes humains masculins

• Coloration au Giemsa– chaque

chromosome a un marquage longitudinal spécifique qui permet de le reconnaître

17

Caryotype

• Affichage des 46 chromosomes à la mitose

• Mise en évidence des anomalies

18

Caryotype féminin normal

19

Fig 4-12

• Anomalie chromosomique– (A) Coloration au Giemsa– (B) Peinture chromosomique

4 12 4 12

N tN t

20

2 - Organisation des gènes sur le chromosome

• Un gène – protéine– ARN

21

Complexité d'un organisme nombre de gènes

• Corrélation positive• Bactérie : 500• Humain : 30 000• Beaucoup d'ADN

– sans information– dépotoir (!)– expression des

gènes

22

Table I-1

• Génomes ayant été totalement séquencés– (A) Eubactéries

23

Table I-1

• Génomes ayant été totalement séquencés– (B) Archae

24

Table I-1

• Génomes ayant été totalement séquencés– (C) Eucaryotes

25

Fig 4-13

• Génome de Saccharomyces cerevisae• 16 chromosomes• Couleurs fonctions du pays qui a séquencé• 12 147 813 nucléotides• 6000 gènes

26

Complexité d'un organisme génome ( ADN)

• Corrélation non systématique• Génome humain = 200 X génome de

Saccharomyces cerevisae• Certaines plantes ou amphibiens = 30 X

génome humain• Amibe = 200 X humain• Certains organismes proches les uns

des autres = 100 X en raison de l'ADN en excès (même nombre de gènes)

27

Variation du nombre de chromosomes

• Homme : 46• Certains cervidés : 6• Certaines carpes : >100• Espèces très proches de Muntjac

• Pas de relations simple entre– nombre de chromosomes– complexité de l'espèce– taille du génome

28

Fig 4-14• Fusion de

chromosomes

29

Analyse du séquençage du génome

• 1999 Séquençage du chromosome 22 (le plus petit)

30

Fig 4-15

1,5% du génome1,5% du génome

31

Analyse du séquençage du génome

• Science et Nature février 2001• Human Genome Project (2001)

32

Table 4-1

• Données statistiques du chromosome 22 et de tout le génome humain

33

Génome humain

• 25 fois plus gros que tous les génomes séquencés précédemment

• 8 fois la somme de tous les génomes séquencés précédemment

• Séquençage à 1000 nucléotides par seconde

• A fait reconsidérer toute la biologie• 4ème édition du livre entièrement revue

34

Fig 4-16

• Échelle du génome– (A) si 1 mm entre

deux bases… – (B) génome =

3 200 km– un gène codant pour

une protéine tous les 300 mètres

– un gène 30 mètres

35

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans

le chromosome

1 - Quelques % codent pour des protéines ou de l'ARN de structure ou catalytiqueLe reste = petits morceaux d'ADN mobiles

qui se sont incorporés dans le chromosome au cours de l'évolution

36

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans

le chromosome2 - Taille moyenne d'un gène élevée

– une protéine moyenne = 430 acides aminés 1 300 paires de nucléotides

– or un gène moyen = 27 000 paires de nucléotides– beaucoup d'ADN non codant qui s'intercale dans

l'ADN codant : introns / exons– Alternance exons / introns dans les gènes– Pas d'introns dans les organismes à génome

compact moins d'ADN– Séquences régulatrices d'ADN des dizaines de

milliers de paires de nucléotides

37

Fig 4-17

• Séquence nucléotidique du génome humain– LINES, SINES, retro-viral like elements, DNA only

transposons : éléments génétiques mobiles qui se sont multipliés et insérés en différents endroits du génome

38

Fig 4-17

• Séquence nucléotidique du génome humain– Segmental duplications : gros blocks (1 000 à 200 000

nucléotides) présents à 2 ou plus endroits du génome– Simple sequence repeats (< 14 nucléotides) répétés

encore et encore

39

Fig 4-17

• Séquence nucléotidique du génome humain– Plus de la moitié des séquences uniques sont des

gènes– Le reste probablement des séquences régulatrices

40

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans

le chromosome

3 - Grand désordre dans l'information– grande pagaille, fouillis, désordre– beaucoup d'ADN dépotoir– information importante répartie dans tout ce

désordre– on n'a jamais rien éliminé

41

Problèmes posés par l'étude des gènes

• La plupart de l'ADN est probablement sans importance

• Un exon 145 nucléotides en moyenne (petit)

• Exon flotte dans une mer d'ADN inutile• Nombreux réarrangements

42

Solutions pour l'étude des gènes• Basées sur l'observation : les séquences qui ont

une fonction sont conservées pendant l'évolution

• Comparaison homme / souris : l'homme et la souris ont divergé d'un ancêtre commun il y a 100 millions d'années

• Les régions semblables sont celles dans lesquelles les mutations ont éliminé l'animal porteur par sélection naturelle : ce sont les régions conservées ( non conservées)

• Les expériences de la nature permettent de mettre en lumière les régions les plus intéressantes du génome

43

Fig 4-18(AB)

Conservation de la synténie (ordre de gènes) entre l'homme et la souris

HOMME

SOURIS

44

Fig 4-19

Histoire de notre chromosome 3 par comparaison avec celui d'autres mammifères

Un changement tous les 5 à 10 millions d'années

45

Muller,S2000p206PNAS (fig1)

46

Muller,S2000p206PNAS (fig2)

47

Muller,S2000p206PNAS (fig3)

48

Muller,S2000p206PNAS (fig4)

49

Muller,S2000p206PNAS (fig5)

50

3 - Cycle du chromosome

• Cycle cellulaire• Interphase : réplication

chromosome interphasique• Mitose : condensation et séparation

chromosomes mitotiques : bien visibles

51

Fig 4-20

Cycle cellulaireInterphase

synthèse protéiqueréplication de l'ADN et duplication des chromosomes

Phase MMitoseDivision cellulaire

52

Fig 4-21

Chromosome interphasiqueChromosome interphasique Chromosome métaphasiqueChromosome métaphasique

53

4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et

passer d'une génération à l'autre

• Origines de réplication– séquence d'ADN spécialisée– kinétochore– jusqu'à 100 000 paires de nucléotides chez

l'homme

• Télomères 2 par chromosome• Centromère

54

Fig 4-22

• les trois séquences d'ADN nécessaires pour le maintien d'un chromosome

55

5 - Emballage de l'ADN• L'ADN est compacté en chromosomes• eg : chromosome 22 = 48 millions

paires de nucléotides– ADN étiré = 1,5 cm– interphase plus court– métaphase = 2 m compaction = 10 000

• Protéines de compaction• En interphase compaction = 1 000

56

Aspect dynamique du chromosome

• En fonction du cycle cellulaire• En fonction de l'activité du chromosome

– accès aux séquences spécifiques– expression des gènes– réplication de l'ADN

57

a) La fibre nucléosomale

• Chromatine– ADN (50 %)– Protéines (50 %)

• histones (60 millions de molécules de chaque classe par cellule)

• protéines chromosomiques non histones

• Nucléosome

58

Fig 4-23

Fibre de 30 nm

Après traitement : collier de perles

Nucléosomes en microscopie électronique

Cordon = ADN, perle = cœur nucléosomal

59

b) Noyau nucléosomal

• De l'ADN (146 pn)... • enroulé autour d'un noyau protéique

formé de 8 histones 2 X (H2A, H2B, H3, H4)

• Premier niveau d'emballage de l'ADN (compacte l'ADN de 1/3)

60

Fawcett

61

Fawcett

62

Cook

63

Cook200?p?

• Digestion de la chromatine par les nucléases qui coupent l'ADN entre les nucléosomes– cf. Cook

64

Cook,P2001p?

• Digestion faible : l'ADN exposé entre les noyaux nucléosomaux (= ADN de liaison) (linker DNA) est dégradé

65

Fig 4-24hautNoyau nucléosomal =

146 paires de nucléotides+octamère d'histones

66

Fig 4-24bas

• Cœur protéique = octamère d'histones

67

ADN de liaison (linker DNA)

• Variable, de quelques paires de nucléotides à 80 paires de nucléotides environ

• en théorie, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal + 1 ADN de liaison adjacent

• en pratique, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal

• En gros, il y a un nucléosome tous les 200 paires de nucléotides

68

Dans une cellule

• 6,4 milliards paires de nucléotides 200 30 millions de nucléosomes

69

Structure du noyau nucléosomal

• Résolu en 1997• 1,65 tours d'ADN autour de l'octamère

d'histones

70

Fig 4-25

Noyau nucléosomal (diffraction des rayons X)

71

• 1 histone 102 ~ 135 acides aminés• Structure commune : 3 hélices reliées

par 2 boucles

c) Histones

72

Fig 4-26

Dimère H2A-H2B en "poignée de main"Motif des 4 histones

• Organisation structurale des histones du cœur protéique

73

Formation du noyau protéique

• Formation d'un dimère H3 - H4• Formation d'un dimère H2A - H2B• (Dimère H3 - H4) + (Dimère H3 - H4) =

(Tétramère H3 - H4)• Tétramère H3 - H4 + 2 (Dimère H2A -

H2B) = noyau protéique

74

Fig 4-27haut

• Assemblage d'un octamère d'histone

75

Fig 4-27bas

• Assemblage d'un octamère d'histone• Les 8 extrémités -N font saillie

Dimère H3 - H4 Dimère H2A - H2B

76

Interface ADN / histones

• 142 liaisons H entre ADN et histones• Histones riches en lys et arg (+) ADN

chargé (-)• Longue queue N terminal

modifications covalentes

77

Conservation des histones

• Parmi les plus conservées des protéines des eucaryotes

• H4 petit pois et H4 de la vache ne diffèrent que à 2 positions sur 104

• Il existe des variants

78

d) Position des nucléosomes sur l'ADN

• Flexibilité de l'ADN• Liaison d'autres protéines

79

Flexibilité de l'ADN

• Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe)

• Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur

• AT est plus facile à courber que GC

80

Fig 4-28

Compression du petit sillon autour du nucléosome

81

Flexibilité de l'ADN

• Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe)

• Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur

• AT est plus facile à courber que GC• Certains nucléosomes ont une position

très précise• En général position approximative

82

Liaison d'autres protéines

• Favorise la liaison du nucléosome• Obstacle à la liaison du nucléosome• En fait tout est très dynamique

83

e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur

• "Collier de perles" = rare dans la cellule vivante

• Fibre de 30 nm beaucoup plus probable

84

Nombreux schémas de fibres de 30 nm

• Zigzag… • et ses variations : "mosaïque fluide de

variations sur le modèle zigzag"• Éléments qui interviennent

– l'ADN de liaison– protéines de liaison à l'ADN– séquence de l'ADN

85

Bednar,J1998(fig1)

86

Bednar,J1998(fig2)

87

Bednar,J1998(fig3)

88

Fig 4-29

• Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag

Interconversion des modèles les uns dans les autres

89

Fig 4-30

• Irrégularités de la fibre de 30 nm– régions avec des protéines de liaison à l'ADN– ADN sans nucléosomes

90

Formation de la fibre de 30 nm

• Histone H1• Queues des histones

91

Histone H1

• Mal conservée• Liaison avec l'ADN et les protéines• Grande importance du point de sortie

de l'ADN hors du nucléosome

92

Fig 4-31

• Rôle de H1 sur le nucléosome

93

Queues des histones

• Liaisons des nucléosomes les uns aux autres

94

Fig 4-32

• Rôle hypothétique des queues d'histones dans la formation de la fibre de 30 nm– les queues aident à la

formation de la fibre de 30 nm

– contact entre les queues et le nucléosome adjacent en diffraction de rayons X

– liaison entre queue et ADN

95

6 - Régulation de l’activité de la chromatine

• a) Les complexes de remodelage de la chromatine

• b) Modifications des queues des histones

96

a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien

• Machines protéiques qui hydrolysent de l'ATP

• pour changer temporairement la structure des nucléosomes

• et l'ADN est lié moins fort au noyau protéique du nucléosome

• Mouvements de H2A H2B dans le noyau protéique

97

Conséquences du remodelage des nucléosomes

• Accès de protéines aux nucléosomes– expression des gènes, réplication,

réparation de l'ADN– Le nucléosome peut rester dans un état

remodelé même après la dissociation du complexes de remodelage chromatinien mais liaisons ADN-protéines relâchées

• Possibilité de changement de la position des nucléosomes le long de l'ADN

98

Fig 4-33

Modèle de mécanisme de certains complexes de remodelage chromatinien

Les contacts ADN - histones sont faibles

99

SWI-SNF-B chromatin-remodeling complex

• A member of the SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin-remodeling complexes ;

• A multi-subunit complex that contains BRG1, BAF170, BAF155, BAF60a, BAF57, BAF53, actin, hSNF5/INI1, and BAF18

100

AbréviationsBAF Brg1/Brm-associated factor;

BAP Brm-associated protein;

ChIP chromatin immunoprecipitation;

HDAC histone deacetylase;

HMG high mobility group;

MNase micrococcal nuclease;

RSC remodels the structure of chromatin;

SAGA Spt–Ada–Gcn5–acetyltransferase;

SWI/SNF mating type switching/sucrose non-fermenting;

TBP TATA-binding protein

101

Nature Reviews Cancer 4, 133-142

(2004)THE SWI/SNF COMPLEX —

CHROMATIN AND CANCER

Charles W. M. Roberts & Stuart H. Orkin

• Chromatin consists of DNA wrapped around nucleosomes in progressively higher-order structures. Histone acetyltransferases (HATs) are an example of complexes that covalently modify DNA and lead to relaxation of chromatin structure. SWI/SNF uses ATP hydrolysis to slide nucleosomes along the DNA helix and expose the DNA to transcription factors. Often, these two types of complex work in concert to regulate transcription.

102

Kingston,RE1999p2339(fig1)

103

Kingston,RE1999p2339 (fig2)

• Composition de différents complexes de remodelage chromatinien ATP-dépendent

Famille de complexes SWI/SNF en pourpre

Homologues ISWI en rouge

104

Kingston,RE1999p2339 (fig3)

105

Kingston,RE1999p2339 (fig4)

106

Complexes de remodelage chromatinien

• Gros complexes protéiques de plus de 10 sous-unités

• Permettent l'accessibilité à l'ADN quand nécessaire

• Reformation des nucléosomes• Contrôle étroit par la cellule• Inactivés par phosphorylation pendant

la mitose compaction

107

Fig 4-34

Mécanisme cyclique de perturbation et reformation des nucléosomes

108

Travers,A1999p311(fig1)

109

Travers,A1999p311(fig2)

110

Travers,A1999p311(fig3)

111

b) Modifications des queues d'histones

• Acétylation des lysines• Méthylation des lysines• Phosphorylation des sérines• Ubiquitinylation

112

Fig 4-35(A)

• Modifications connues des 4 queues d'histones

113

Modifications des queues d'histones

• Avant ou après leur synthèse• En général après l'assemblage en

nucléosome• Enzymes nucléaires

– HAT (Histone Acétyl Transférase)– HDAC (Histone DéACétylase)

114

Modifications des queues d'histones

• Agit peu sur le nucléosome• Agit sur la stabilité se la fibre de 30 nm :

eg acétylation déstabilise la chromatine• Attraction de protéines spécifiques• Modifications code d'étirement de la

chromatine à la cellule

115

Fig 4-35(B)

Code de modifications des histones

116

Code de modifications des histones

• Nombreuses combinaisons de modifications

• Exemple :– vient d'être répliqué– ne pas transcrire

117

Conclusion : dynamisme de la chromatine

• Complexes de remodelage chromatinien

• Modifications des queues d'histones• Compaction / décompaction

permanente• Coopération des deux mécanismes