Sciences fondamentales
DOI of or1Departme
Chengdu MilitChine.
2InstituteMilitary Medic
3Departmeversity, Chong
Un environnement jeune inverse la baissed’activit�e des cellules prog�enitricesendoth�eliales ag�ees chez le rat: role de lavoie de signalisation du phosphatidylinositol3-kinase/akt
Guangxu Zhu,1 Mingbao Song,2 Huxuan Wang,1 Gang Zhao,2 Zhengping Yu,3
Yangguang Yin,2 Xiaohui Zhao,2 Lan Huang,2 Kunming, R. P. de Chine
Meme si des dysfonctionnements li�es �a l’age ont �et�e document�es dans des �etudes r�ecentes surles cellules prog�enitrices endoth�eliales (CPEs), le role pr�ecis de l’anciennet�e de l’environnementdans lequel �evoluent les CPEs demeure peu clair. Des rats femelles Sprague-Dawley de deux etvingt mois �etaient utilis�es dans la pr�esente �etude. Des CPEs isol�ees �a partir de rats jeunes(CPEJs) et ag�es (CPEAs) �etaient cultiv�ees dans du s�erum jeune ou ag�e. La migration et la pro-lif�eration des CPEs �etaient respectivement d�etect�ees �a l’aide d’une chambre de Boydenmodifi�ee et d’un test MTT; La diff�erentiation des CPEs �etait �evalu�ee par r�eaction en chaınepar polym�erase inverse (reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) ou par trides cellules en fluorescence ( fluorescence-activated cell sorting); Akt et l’expression des pro-t�eines Akt-phosphoryl�ees �etaient mesur�ees par Western Blot. Les CPEs �etaient alors trans-plant�ees chez des rats ayant des l�esions carotidiennes. Le s�erum jeune favorisaitsignificativement la migration, la prolif�eration et la diff�erentiation des CPEAs, et augmentait laphosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) ainsi que l’activit�e endoth�eliale de l’oxyde nitriquesynth�etase chez les CPEAs en comparaison au s�erum ag�e; L’Akt total ainsi que l’expression desprot�eines Akt-phosphoryl�ees des CPEAs �etaient significativement augment�ees par l’adjonctionde s�erum jeune. Le nombre de CPEAs transplant�ees au niveau des l�esions carotidiennes desrats jeunes augmentait de mani�ere significative en comparaison aux rats ag�es. Ces effetspourraient etre att�enu�es par la wortmannine, qui bloque sp�ecifiquement PI3-K. Un environne-ment jeune restaure en partie l’activit�e des CPEAs et favorise l’implantation de CPEAs au niveaudes l�esions vasculaires; L’activation de la voie de signalisation PI3-K/Akt est au moins pourpartie responsable de ce processus.
INTRODUCTION
Le d�eclin du potentiel r�eg�en�erateur d’un tissu est un
marqueur du vieillissement de ce dernier. Il est en
iginal article: 10.1016/j.avsg.2008.11.013.
nt of Clinical Laboratory, Kunming General Hospital,ary Area of PLA, Kunming, Yunnan Province, R. P. de
of Cardiovascular Disease, XinQiao Hospital, Thirdal University, ChongQing, R. P. de Chine.
nt of Occupational Health, Third Military Medical Uni-Qing, R. P. de Chine.
partie du aux changements relatifs �a l’age dans les
cellules souches sp�ecifiques du tissu en question.1,2
De r�ecentes �etudes ont r�ev�el�e une d�et�erioration
significative de l’angiog�en�ese chez le rat lors du
Correspondance: Guangxu Zhu, Department of Clinical Laboratory,Kunming General Hospital, Chengdu Military Area of PLA, Kunming,Yunnan Province 650032 R. P. de Chine, E-mail: [email protected]
Ann Vasc Surg 2009; 23: 519-534DOI: 10.1016/j.acvfr.2009.12.006� Annals of Vascular Surgery Inc.�Edit�e par ELSEVIER MASSON SAS
561
562 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
vieillissement.3 Ce ph�enom�ene est associ�e �a divers
facteurs dont la modification du nombre de cellules
prog�enitrices endoth�eliales (CPEs) dans la moelle
osseuse et la circulation sanguine ainsi qu’�a une
alt�eration des propri�et�es des CPEs.4,5 Il a �et�erapport�e que la transfusion de CPEs d�eriv�ees de
moelle osseuse de jeunes rats (CPEJs) chez des rats
ag�es am�eliorait d’avantage la fonction angiog�enique
du myocarde l�es�e que la transfusion de CPEs
d�eriv�ees de rats ag�es (CPEAs).6 Ceci sugg�ere que les
CPEJs poss�edent des propri�et�es angiog�eniques
sup�erieures aux CPEAs. Cependant, meme si les
tissus ag�es et les cellules souches qui en d�erivent
poss�edent un potentiel de r�eg�en�eration diminu�e et
une moindre activit�e en comparaison aux d�eriv�es de
tissus jeunes, ces �etats pourraient etre invers�es par le
type d’environnement dans lequel �evoluent ces
tissus. Carlson et al.7 d�emontr�erent que du muscle
ag�e se r�eg�en�erait avec succ�es lorsqu’il �etait greff�e �adu muscle jeune. Une �etude in vitro sur souris
sugg�erait �egalement que le s�erum d’individus jeunes
am�eliorait significativement la prolif�eration des
cellules satellites associ�ees aux fibres musculaires
ag�ees en culture en comparaison au s�erum de souris
ag�ees, sugg�erant ainsi qu’un s�erum jeune restaurait
la r�egulation positive de Delta et l’activation de
Notch dans les cellules satellites ag�ees.8 Le micro-
environnement est la base de la r�egulation de la
prolif�eration des cellules souches, de la diff�erentia-
tion et de la participation �a la r�eg�en�eration tissulaire;
ces r�esultats in vivo et in vitro d�emontr�erent que les�el�ements composant l’environnement jeune �etaient
capables d’am�eliorer les aspects mol�eculaires et
cellulaires de la diminution de l’activation des cel-
lules souches musculaires d�eriv�ees d’individus ag�es;
cependant, le role de l’anciennet�e de l’environne-
ment sur l’activit�e des CPEs demeure peu clair.
La phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) et son
effecteur direct d’aval Akt jouent un role important
dans la r�egulation de multiples r�eactions cellulaires,
comme la migration, la prolif�eration et la diff�erentia-
tion.9,10 L’activation de cette voie de signalisation a
des implications physiopathologiques significatives
sur les CPEs, comme la promotion de la prolif�eration
des CPEs, la migration, et la capacit�e de former des
colonies par l’activation de l’activit�e endoth�eliale de
l’oxyde nitrique synth�etase (eNOS). Ces effets
pourrait etre att�enu�es pharmacologiquement par un
bloqueur sp�ecifique de la PI3-K, la wortmannine ou
LY294002,11 ainsi que par le knockout du g�ene
gamma de la phosphoinositide 3-kinase. Ces deux�el�ements pourraient affecter la n�eovascularisation
post-isch�emique et le fonctionnement des CPEs.12
Cependant, le role de la voie de la PI3-K sur les
modifications induites par l’environnement sur
l’activit�e des CPEs reste �a �elucider. C’est pour ces
raisons que nous nous sommes concentr�es sur les
effets de l’environnement ag�e sur l’activit�e des CPEs,
ainsi que sur la responsabilit�e de la voie de signali-
sation de la PI3-K/Akt.
MAT�ERIELS ET M�ETHODES
Pr�eparation des s�erums et des cultures
de CPEs
Des rats femelles Sprague-Dawley saines (ag�ees de 2
et 20 mois, fournies par l’institut de zoologie du Dap-
ing Hospital, Troisi�eme Universit�e M�edicale Mili-
taire, R�epublique Populaire de Chine) �etaient
utilis�ees pour r�ealiser les exp�erimentations. Toutes
les proc�edures sur l’animal �etaient approuv�ees par
le comit�e �ethique animalier de la Troisi�eme
Universit�e M�edicale Militaire, et la recherche �etait
conforme au Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals de l’U.S. National Institutes of Health (NIH
Publication 85-23, r�evis�e en 1996). Les s�erums de rat�etaient pr�epar�es comme suit: des rats femelles jeunes
(2 mois) et ag�ees (20 mois) �etaient anesth�esi�es par
une injection intrap�eriton�eale de xylazine hydro-
chloride (4,6 mg/kg; Sigma, St. Louis, Missouri) et de
ketamine hydrochloride (70 mg/kg, Sigma); le sang�etait directement collect�e �a la seringue �a partir des
cœurs et centrifug�e �a 3,000 rpm pendant 10 min
(centrifuge GPR; Beckman, Fullerton, Californie,
Etats-Unis); le plasma �etait ensuite incub�e dans un
bain d’eau �a 4�C pendant une nuit et centrifug�e de
nouveau �a 3,000 rpm pendant 10 min; le s�erum �etait
pr�elev�e afin d’inactiver le compl�ement et plac�e �a56�C pendant 30 min; apr�es filtration aseptique par
une membrane poreuse 0,22 mm par trois fois, le
s�erum �etait collect�e et conserv�e au r�efrig�erateur �a-20�C en vue des exp�erimentations.
Les CPEs �etaient cultiv�ees selon des techniques
pr�ealablement d�ecrites, afin de r�eduire efficacement
le nombre de monocytes contaminants et les cellules
endoth�eliales (CEs) matures.13-16 En r�esum�e, les
cellules mononucl�ees (CMNs) d�eriv�ees de moelle
osseuse �etaient isol�ees �a partir des f�emurs et des
tibias des rats par centrifugation en gradient de
densit�e en utilisant une solution de s�eparation de
ficoll (Amersham Biosciences, Arlington Heights,
Illinois, E-U). Les CMNs isol�ees �etaient conserv�ees
dans un milieu d’aigle modifi�e de Dulbecco
(DMEM)/milieu modifi�e Ham F12 (3:1, DMEM/
F12; Sigma) avec du s�erum fœtal bovin (SFB) 20%
(v/v) ou 2% (v/v) combin�e avec du s�erum de rats
jeunes ou ag�es 20% (v/v), respectivement, facteur
de croissance vasculaire endoth�elial (vascular endo-
thelial growth factor, VEGF, 20 ng/mL; Sigma),
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 563
facteur de croissance fibroblastique basique (basic
fibroblast growth factor, bFGF, 5 ng/mL; R&D Systems,
Minneapolis, Minnesota, E-U), facteur de croissance
semblable �a l’insuline murin recombinant de type I
(recombinant murine insulin-like growth factor-I, IGF-I,
10 ng/mL; R&D Systems), facteur de croissance�epidermique humain recombinant (recombinant
human epidermal growth factor, EGF, 5 ng/mL; Clo-
netics, Wakersville, Maryland, E-U), p�enicilline
(100 U/mL), streptomycine (100 U/mL) et cultiv�ees
sur des plateaux (1� 106 cellules/cm2) contenant de
la fibronectine humaine. Ces cellules non-
adh�erentes �etaient transloqu�ees 24 h plus tard pour
etre cultiv�ees dans des flacons frais contenant de la
fibronectine humaine (Sigma). Quatre jours plus
tard, les cellules adh�erentes �etaient extensivement
lav�ees pour retirer les cellules non attach�ees et
plac�ees par un milieu frais; le milieu �etait chang�etous les deux jours.
Apr�es 4 jours de culture avec du s�erum jeune ou
ag�e, les CPEs �etaient trypsinis�ees avec de la trypsine
0,25%, lav�ees au tampon phosphate salin (PBS), et
suspendues dans un milieu contenant du SFB 2%
(v/v) combin�e avec du s�erum de rat 20% (v/v);
5� 104 cellules par champs �etaient positionn�ees
sur des plateaux impr�egn�es de fibronectine
humaine �a 96 ou 6 pointes. Vingt-quatre heures
plus tard, les cellules suspendues �etaient �elimin�ees
et remplac�ees par un milieu frais avec ou sans
wortmannine (10 mg/mL dans du dim�e-
thylsulfoxyde (DMSO), Sigma) �a une concentration
de 20 nM; le milieu �etait chang�e tous les deux jours.
Coloration cellulaire
Le ph�enotype cellulaire endoth�elial des CMNs
attach�ees �etait confirm�e par la prise de lipoprot�eines
basse densit�e ac�etyl�ees �a la 1,1-dioctadecyl-
3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine marqu�ee
(Dil-ac-LDL; Invitrogen, Carlsbad, Californie, E-U)
et de FITC conjugu�e �a la lectine BS-1 (Sigma)
comme d�ecrit pr�ec�edemment apr�es 4 jours de
culture; les cellules doublement positives �etaient
d�efinies comme des CPEs en diff�erenciation.17,18
Les cellules color�ees �etaient identifi�ees au micro-
scope invers�e �a fluorescence (Leica, Wetzler, Alle-
magne) et comptabilis�ees au grossissement �200.
Pour la caract�erisation des marqueurs de surface,
l’immunofluorescence �etait r�ealis�ee en utilisant un
anticorps polyclonal anti-CD-133 de ch�evre et un
anticorps monoclonal anti CD-34 de souris (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie).
Bri�evement, les cellules �etaient lav�ees trois fois
avec du PBS, fix�ees avec du m�ethanol froid,
conserv�ees �a -20�C pendant 15 minutes, et lav�ees
avec du PBS pendant 5 min suppl�ementaires. De
l’albumine de s�erum bovin (ASB, 3%) �etait ajout�ee
au PBS et laiss�ee pendant 30 min. Secondairement,
les cellules �etaient incub�ees pendant 1 heure �atemp�erature ambiante avec les anticorps anti-
CD133 et anti-CD34 dilu�es �a 1:200 avec de l’ASB 3%
dans du PBS. Apr�es lavage au PBS, les cellules �etaient
expos�ees �a de la t�etra-rhodamine isothiocyanate
(TRITC) ou �a des anticorps secondaires conjugu�es �al’isothiocyanate de fluoresc�eine (FITC) �a 37�C pen-
dant 1 heure dans l’obscurit�e. Une immuno-
globuline d’isotype G (IgG) �etait utilis�ee comme
controle n�egatif.
Migration cellulaire, prolif�eration et
apoptose
La capacit�e migratrice des CPEs �etait d�etermin�ee
dans une chambre de Boyden modifi�ee (Jiangshu
Qilin Medical Equipment, Haimen, Chine) comme
pr�ec�edemment d�ecrit,19 avec quelques modifica-
tions; les pores de la membrane �etaient de 8 mm de
diam�etre. Apr�es 10 jours de culture, les cellules�etaient trypsinis�ees avec de la trypsine 0,25% et
lav�ees avec du PBS par trois fois; 2,5� 105 cellules�etaient suspendues dans 50 mL de DMEM/F12 sans
s�erum ni facteur de croissance et r�eensemenc�ees
dans le compartiment sup�erieur de la chambre de
Boyden modifi�ee. Du VEGF �a la concentration de 50
ng/mL �etait ajout�e au compartiment inf�erieur des
chambres. Apr�es 24 heures de culture, la partie
inf�erieure des filtres �etait lav�ee avec du PBS et fix�ee
avec du paraformald�ehyde 2%. Pour quantification,
les cellules �etaient color�ees avec une solution de
Giemsa. Les cellules des parties inf�erieures des filtres�etaient comptabilis�ees au grossissement �200.
L’activit�e mitog�enique �etait analys�ee comme
pr�ec�edemment d�ecrit.20 Bri�evement, les CPEs�etaient pr�elev�ees apr�es 3 jours de culture et ense-
menc�ees sur un plateau �a 96 pointes dans un milieu
sans rouge de ph�enol suppl�ement�e avec de l’ABS
0,5% pour la nuit. Puis, le milieu �etait abandonn�e et
un milieu frais sans rouge de ph�enol suppl�ement�eavec du SFB 2% (v/v) combin�e �a du s�erum de rat
20% (v/v) �etait ajout�e pour 4 jours. Avant la mesure
de densit�e optique (562 nm) par un lecteur de plaque
de microculture (HT-7000 Plus; Perkin-Elmer Life
Sciences, Shelton, Connecticut, E-U), les cellules
recevaient 10 mL de bromure de 3-(4,5-dimethyl-
thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT, 5 g/L)
pendant 6 heures et 200 mL de DMSO pendant
10 min.
La proportion de CPEs apoptotiques �etait
quantifi�ee par comptage visuel des noyaux pycnoti-
ques et fragment�es apr�es coloration hochest3342
564 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
(Sigma), comme pr�ec�edemment d�ecrit.20,21
Bri�evement, apr�es 5 jours de culture avec du s�erum,
les CPEs (1� 105 cellules/plateau) �etaient incub�ees
dans un milieu sans rouge de ph�enol contenant du
facteur de n�ecrose tumorale-a (tumor necrosis factor-
a, TNF-a) �a une concentration de 10 ng/mL; apr�es
24 heures de culture, les noyaux pycnotiques et
fragment�es color�es au hochest3342 �etaient compt�es
en pourcentage de cellules par champs.
R�eaction en chaine par polym�erase
inverse
L’ARN total de 1� 106 CPEs �etait extrait s�epar�ement
en utilisant le r�eactif d’isolement de Tripure (Roche,
Diagnostics, Bale, Suisse) selon les instructions du
constructeur. Le premier brin d’ADNc �etait synth�etis�epar transcription inverse (TI) de 1,0 mg d’ARN total en
utilisant le kit de TI en deux �etapes (Promega, Madi-
son, Wisconsin, E-U). Les primers �etaient concus �al’aide du logiciel Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft,
Palo Alto, Californie, E-U) sur la base des s�equences
publi�ees. Tous les primers concus �etaient positionn�es
sur leurs s�equences d’exons et choisis en fonction de
leurs temp�eratures d’hybridation puisque pouvant
partager le meme programme de thermo-cycler.
L’unicit�e et la sp�ecificit�e de chaque primer �etaient
v�erifi�ees en utilisant le programme BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast) pour la recherche d’alignement entre les
s�equences g�enomiques, en fonction des num�eros
d’acc�es �a la Genbank: eNOS (NM_021838) sens 5’-
atacttgaggatgtggctgtctg-3’ et antisens 5’-atacaggatagt
cgccttcacac-3’, 450 bp; Facteur von Willebrand
(vWF, XM_001066203) sens 5’-aggctgggtacta-
caaactttcc-3’ et antisens 5’-tgacgcatgtacacaaagtcttc-
3’, 408 bp; glyceraldehyde-3-phosphate dehy-
drogenase (GAPDH, NM_017008; utilis�ee comme
controle interne) sens 5’-cccttcattgacctcaactacat-3’ et
antisens 5’-agggagttgtcatatttctcgtg-3’, 326 bp. Une
PCR ( polymerase chain reaction) �etait r�ealis�ee comme
suit: 95�C pendant 10 min; 38 cycles �a 94�C pendant
30 sec, 55�C pendant 30 sec, 72�C pendant 1 minute
puis 72�C pendant 10 min. Les produits amplifi�es�etaient soumis �a une �electrophor�ese sur gel d’agarose
1,5% dans un tampon trisebase d’acide�ethyl�enediaminet�etraac�etique (EDTA; tampon TBE)
color�e avec du bromure d’�ethidium.
Analyse du tri des cellules activ�ees en
fluorescence
Les CPEs �etaient incub�ees avec un des anticorps sui-
vants: anticorps monoclonal de souris anti-CD31 de
rat (IgG1 de souris) et anticorps monoclonal de
souris anti-KDR de rat (IgG1 de souris) �a une
concentration de 2,5 mg/5� 104 cellules dans de
l’ASB 1% �a 4�C pendant 45 min. Les anticorps
d’isotypes identiques servaient de controles.
Ensuite, les cellules �etaient incub�ees avec des anti-
corps secondaires de singe anti-souris conjugu�es au
FITC �a 37�C pendant 30 min (tous ces anticorps
provenaient de Santa Cruz Biotechnology). Apr�es
traitement, les cellules �etaient fix�ees dans du para-
formald�ehyde 1%, et une analyse quantitative �etait
r�ealis�ee en utilisant un trieur de cellules activ�ees par
fluorescence IV Becton-Dickinson (Franklin Lakes,
New Jersey, E-U).
PI3-K et activit�e eNOS
L’activit�e PI3-K �etait d�etect�ee par la mesure du mon-
tant de PI(3,4,5)P3 extrait des cellules par dosage
d’immunosorption li�ee �a enzyme standard (enzyme-
linked immunosorbent assay, ELISA) avec le kit ELISA
de masse PIP3 (Echelon Biosciences, Salt Lake City,
Utah, E-U). Le PI(3,4,5)P3 �etait extrait selon le
protocole suivant. Les cellules (5� 106) �etaient
collect�ees et centrifug�ees (525� g, 5 min, 4�C). Le
r�esidu �etait resuspendu dans une solution d’acide
trichloroac�etique 5% (TCA)/1 mM EDTA et
centrifug�e (525� g, 5 min). Les lipides neutres�etaient extraits par l’addition d’une solution de
MeOH:CHCl3 (2:1); la suspension �etait vortex�ee
trois fois en 10 min �a temp�erature ambiante, puis
centrifug�ee (525 g, 5 min), et l’�etape �etait r�ep�et�ee �anouveau. Les lipides acides �etaient extraits par
l’addition d’une solution de MeOH:CHCl3:12 M HCl
(80:40:1); la suspension �etait vortex�ee quatre fois en
15 min �a temp�erature ambiante, puis centrifug�ee
(525� g, 5 min). Le surnageant �etait mix�e avec du
CHCl3 et de l’HCl (0,1 M), et cette suspension �etait
centrifug�ee (525� g, 5 min) pour s�eparer les phases
organiques et aqueuses. La phase organique �etait
collect�ee et s�ech�ee �a l’aide d’un s�echoir sous vide.
Les lipides s�ech�es �etaient resuspendus dans un
tampon de PIP3 (50 mM N-2-hydroxye-
thylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid [HEPES],
150 mM NaCl, 1.5% Na cholate, pH 7,4), soniqu�edans un bain d’eau pendant 5 min, et laiss�e le temps
d’une nuit �a 4�C. Apr�es cette extraction, un ELISA�etait utilis�e suivant les consignes du constructeur
(Echelon Biosciences).
L’activit�e eNOS �etait d�etermin�ee par l’�evaluation
de la conversion de la L-[guanidino-15N2] arginine
en 15 N-nitrite par chromatographie en phase
gazeuse/spectrom�etrie de masse comme pr�ec�edem-
ment d�ecrit.22,23 Les CPEs �etaient incub�ees pendant
24 heures �a 37�C avec 5 mM de L-[guanidino-15N2]
arginine. Le ratio 15 N-nitrite form�e/14 N-nitrite �etait
ensuite calcul�e. L’oxyde nitrique (NO) est instable,
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 565
mais il poss�ede des produits terminaux stables �a type
de nitrites et nitrates. En cons�equence, le meilleur
index de g�en�eration de NO est la somme des nitrites et
des nitrates. Le milieu de culture des CPEs �etait
pr�elev�e et conserv�e �ae80�C jusqu’�a d�etection. Le
niveau de nitrite/nitrate �etait mesur�e comme
pr�ec�edemment d�ecrit.24,25 Bri�evement, les nitrates�etaient convertis en nitrites par la nitrate r�eductase, et
les nitrites totaux �etaient mesur�es par un kit de r�eactif
de Griess (Promega). L’absorbance �etait d�etermin�ee �a540 nm par un spectrophotom�etre.
Western blotting
Les prot�eines cellulaires �etaient pr�epar�ees et s�epar�ees
par �electrophor�ese sur gels de polyacrylamide en
pr�esence de dod�ecylsulfate de sodium (SDS-PAGE)
comme d�ecrit pr�ec�edemment,26 ajust�e suivant
l’expression de GAPDH. Apr�es s�eparation, les pro-
t�eines �etaient transf�er�ees sur une membrane de
nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences).
Les membranes �etaient bloqu�ees par incubation dans
un tampon tris-salin (pH 7,5), contenant 0,1% (v/v)
Tween-20 et 5% (v/v) de lait sec non gras pendant 2
heures, puis par 2 heures d’incubation �a temp�erature
ambiante avec un anticorps polyclonal anti-Akt1
(62 kDa) de ch�evre, un anticorps polyclonal anti-
phospho-Akt1 (Ser 473, 70 kDa) de lapin, et un
anticorps monoclonal anti-GAPDH (37 kDa) de sou-
ris (Santa Cruz Biotechnology). Les filtres �etaient
lav�es extensivement dans un tampon tris-salin con-
tenant 0,1% (v/v) de Tween-20 avant incubation
pendant 1 heure avec un anticorps secondaire con-
jugu�e �a une peroxydase. Les membranes �etaient
ensuite lav�ees et d�evelopp�ees en utilisant le substrat
de chimiluminescence Super Signal� (Pierce, Rock-
ford, Illinois, E-U).
Mod�ele de l�esion de l’art�ere carotide ettransplantation de CPEs
Des l�esions de d�enudation au ballon �etaient r�ealis�ees
sur des art�eres carotides de rats suivant une
proc�edure pr�ealablement d�ecrite.27 Bri�evement, les
rats �etaient anesth�esi�es par une injection
intrap�eriton�eale de ketamine hydrochloride
(70 mg/kg) et de la xylazine hydrochloride (4,6 mg/
kg). Une incision m�ediane cervicale �etait r�ealis�ee
pour exposer la carotide externe gauche. Un
cath�eter d’embolectomie de Fogarty 2F (Baxter
Health Care, Irvine, Californie, E-U) �etait introduit
dans l’art�ere carotide externe gauche et avanc�e via
l’art�ere carotide commune dans l’arche aortique. Le
ballon �etait ensuite inflat�e avec une solution sal�ee
(environ 0,02 mL) jusqu’�a sentir une r�esistance,
puis retir�e de l’art�ere carotide commune en
effectuant des mouvements de rotation pour
d�enuder le vaisseau de son endoth�elium. Cette
proc�edure �etait r�ep�et�ee trois fois, puis le cath�eter�etait d�efinitivement retir�e. La carotide externe �etait
alors li�ee puis l’incision referm�ee. Les art�eres caro-
tides de rats recevant les interventions t�emoins
servaient de controles. Toutes les proc�edures �etaient
approuv�ees et en accords avec les recommandations
en vigueur dans notre institution.
Les transplantations de CPEs �etaient r�ealis�ees sur
les mod�eles de l�esions. Apr�es 4 jours en culture, les
CPEs �etaient trypsinis�ees avec de la trypsine
0,25%, lav�ees avec du PBS par trois fois, marqu�ees
avec du DAPI, puis suspendues dans 1 mL de solu-
tion saline, et transplant�ees (5� 107 cellules/kg de
poids) par injection dans le veine caudale dans
chaque rat ayant une carotide l�es�ee, peu apr�es
l’induction de la l�esion carotidienne; les volumes
des injections salines correspondant �a chaque rat�etaient utilis�es dans le groupe t�emoin. Une admi-
nistration de wortmannine (10 mg/mL dans du
DMSO, dilu�ee dans une solution saline �a 10mmol/
mL avant injection; 5mmol/kg) �etait faite ins-
tantan�ement �egalement par la veine caudale apr�es
transplantation des CPEs; des volumes correspon-
dants de solvants �etaient administr�es �a tous les rats
des autres groupes. Les CPEs cultiv�ees �etaient mar-
qu�ees avec du Dil-ac-LDL comme d�ecrit pr�ec�edem-
ment28,29 et transplant�ees suivant une injection de
CPE DAPI-marqu�ees chez les mod�eles l�es�es.
Les rats s�ejournaient dans un environnement�eclair�e en permanence, �a temp�erature et humidit�econtrol�ees. Ils �etaient nourris et hydrat�es ad libitum
apr�es transplantation de CPEs. Dans les groupes
recevant l’injection de CPEs Dil-ac-LDL-marqu�ees,
7 mL de sang �etaient directement collect�es �a la
seringue �a partir des cœurs des rats l�es�es �a 0 h, 1 h,
3 h, 6 h, 12 h, 1 jour, 2 jours, et 4 jours. Le nombre
de CMNs totaux isol�ees �a partir du sang �etait alors
calcul�e; 5� 104 CMNs �etaient analys�ees comme
pr�ec�edemment d�ecrit.28,29
Les CPEs Dil-ac-LDL-marqu�ees �etaient s�epar�ees
des autres types de cellules en utilisant un trieur de
cellules de type Becton-Dickson FACS IV (Franklin
Lakes, New Jersey, E-U). Les CMNs isol�ees �a partir
des groupes controles �etaient utilis�ees comme contro-
les n�egatifs. La proportion de cellules Dil-ac-LDL-
positives �etait utilis�ee pour �evaluer le nombre de
CPEs transplant�ees dans le sang de ces mod�eles; les
pourcentages �etaient convertis en nombre de
cellules par microlitre de sang. Dans les groupes rece-
vantune transplantation de CPEs DAPI-marqu�ees, les
vaisseaux �etaient pr�elev�es 10 jours plus tard puis
d�ecoup�es et analys�es en histologie sous un
microscope �a fluorescence invers�ee apr�es
n=10, P<0.05
20µm 20µm
20µm 20µm
Dil-ac-LDL FITC-UEA-1
NCNC
A
100µm 100µm
100µm 100µm
a Bn=6, P<0.01
c
d e
b
20µm 20µm
CD34
E
D
20µm
DAPI
CD133 DAPI
C
n=6, P<0.05
20µm
n=6, P<0.05
jeunes agés
jeunes agés
jeunes agés
jeunes agés
UFC
/ ch
amp
Pour
cent
age
de c
ellu
les
doub
lem
ent p
ositi
ves
(%)
Cel
lule
s po
sitiv
es p
our
la c
olor
atio
n de
CD
34 (
%)
Cel
lule
s po
sitiv
es p
our
la c
olor
atio
n de
CD
133
(%)
566 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 567
immunocoloration de la vWF; un isotype IgG �etait
utilis�e comme controle. La circonf�erence de la
lumi�ere au niveau de chaque section �etait d�etermin�ee
par le logiciel Leica QWin, et les ratios entre le nombre
de cellules transplant�ees positives pour la coloration
DAPI sur le versant luminal des sites l�es�es et la cir-
conf�erence de la lumi�ere �etaient calcul�es.
Analyse statistique
Toutes les valeurs sont exprim�ees suivant leur
moyenne ± d�eviation standard (DS). Les diff�erences
entre les donn�ees �etaient analys�ees �a la recherche de
significativit�e par r�ealisation de l’analyse de variance
pour comparaison multiple en utilisant le logiciel
SPSS 11.0 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Un
p< 0,05 �etait consid�er�e statistiquement significatif.
R�ESULTATS
Caract�eres des CPEs putatives de rats
Les CMNs d�eriv�ees de moelle osseuse de rats ag�es et
jeunes peuvent etre diff�erenci�ees en cellules ayant
des ph�enotypes CPE dans un milieu contenant du
facteur de croissance endoth�elial sur des plateaux
impr�egn�es de fibronectine. Comme d�emontr�e sur
le Figure 1A, certaines CMNs �etaient arrang�ees en
anneau (a) ou en amas (b) au deuxi�eme jour suivant
l’inoculation. Les cellules cultiv�ees d�emontr�erent
une structure lin�eaire apr�es trois jours de culture (c),
des foyers apparaissait en deux semaines (d), et une
structure tubulo-reticul�ee apparaissait en quatre
semaines (e). Meme si il apparaissait que les CMNs
isol�ees �a partir de jeunes rats �etaient d’apparence
mieux distribu�ees que celles provenant de rats ag�es,
les cellules attach�ees des deux groupes, jeune et ag�e,
d�emontr�erent la meme morphologie et les memes
caract�eristiques de diff�erentiation en microscopie
optique. Apr�es 14 jours de culture, la capacit�e �aformer une colonie �etait analys�ee; en comparaison
avec cela dans le groupe ag�e, la capacit�e �a former
Fig. 1. CMNs d�eriv�ees de rats ag�es diff�erenci�ees en cel-
lules ayant des ph�enotypes CPEs dans une milieu con-
tenant du VEGF sur des plateaux contenant de la
fibronectine. A CMNs dispos�ees en lignes (a) et en amas
(b) au deuxi�eme jour suivant l’inoculation. Les cellules
cultiv�ees d�emontraient une structure en corde apr�es 3
jours de culture (c), des formations focales apparaissaient
en 2 semaines environ (d), et une structure tubulo-
r�eticulaire apparaissait en 4 semaines environ (e). B
Apr�es 14 jours, le nombre d’UFCs des groupes jeunes et
ag�es �etait analys�e, n¼ 6. C Les ph�enotypes des CPEs
�etaient caract�eris�es comme �etant doublement positifs
une colonie dans le groupe jeune �etait significati-
vement augment�ee (32,8 ± 3,5/champs vs.
24,1 ± 4,2/champs, p< 0,01; Fig. 1B).
Les ph�enotypes cellulaires endoth�eliaux �etaient
caract�eris�es comme �etant doublement positifs pour
la prise de DiL-ac-LDL (rouge) et la liaison �a la lec-
tine (vert) apr�es 4 jours de culture (Fig. 1C, gau-
che). Le comptage cellulaire �a la vue de 10 champs
(�200) pris au hasard au microscope �a fluorescence
invers�ee r�ev�elait que le pourcentage de cellules
doublement positives dans le groupe ag�e(82,8 ± 8,7%) �etait significativement plus bas que
dans le groupe jeune (92,1 ± 3,4%; p< 0,05; Fig. 1C,
droite). L’immunocoloration d�emontrait que les
CPEs cultiv�ees exprimaient le CD34 (41,2 ± 5,4% et
32,3 ± 6,6% chez les groupes jeunes et ag�es, res-
pectivement; Fig. 1D) et le CD133 (19,3 ± 3,8% et
12,7 ± 3,7% chez les groupes jeunes et ag�es, res-
pectivement; Fig. 1E), et indiquait le ph�enotype
cellulaire souche/prog�eniteur. Il n’�etait pas retro-
uv�ee de fluorescence dans le groupe de l’isotype IgG
(donn�ees non montr�ees).
Effets des s�erums jeunes et ag�es sur le
fonctionnement des CPEs et l’apoptose
Les unit�es formant une colonie (UFCs) de CPEs�etaient �evalu�eesapr�es 2 semaines enculture. Le pour-
centage de CPEs doublement positives pour la prise de
Dil-ac-LDL et la liaison de l’UEA-1 �etait mesur�e apr�es
4 jours de culture. La migration des CPEs et l’apoptose�etaient �evalu�ees comme nous l’avons d�ecrit dans la
section ‘‘Mat�eriels et m�ethodes’’ (Fig. 2A). Le nom-
bre de CFUs, le nombre de cellules ayant migr�ees, et
les pourcentages de CPEs doublement positives pour
la prise de Dil-ac-LDL et la liaison de l’UEA-1 dans les
CPEAs cultiv�ees avec du s�erum jeune augmentaient
tous significativement en comparaison �a celles culti-
v�ees dans du s�erum ag�e (UFC 23,7 ± 2,3/champs vs.
16,4 ± 2,1/champs, p< 0,01; pourcentage de cellules
doublement positives 79,8 ± 3,9% vs. 68,9 ± 2,8%,
p< 0,01; nombre relatif de cellules ayant migr�ees
pour la prise de DiL-ac-LDL (rouge) et comme liant la
lectine (vert); les deux photos du bas C pr�esentent les
controles n�egatifs (CN) correspondant �a la prise de Dil-ac-
LDL et �a la liaison �a la lectine. Le pourcentage de cellules
doublement-positives �etait calcul�e, n¼ 10. L’immuno-
coloration sugg�erait que les CPEs exprimaient le CD34
(D) et le CD133 (E); l’int�egrit�e cellulaire �etait
document�ee par coloration nucl�eaire avec du 4,6-dia-
midino-2-phenylindole (DAPI; bleu), et les pourcentages
de cellules positives �etaient calcul�es, n¼ 6. Les donn�ees
sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS. Un
p< 0,05 �etait consid�er�e statistiquement significatif.
568 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 569
1,432 ± 0,097 vs. 1,000 ± 0,011, p< 0,01). Ces effets
pouvaient etre efficacement diminu�es par la wort-
mannine, qui bloque le PI3-K (UFC 21,4 ± 1,2/
champs, p< 0,05; pourcentage de cellules dou-
blement positives 75,8 ± 4,3%, p< 0,05; nombre de
cellules ayant migr�ees 1,322 ± 0,096, p< 0,01).
Cependant, les capacit�es de fonctionnement des
CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e diminuaient
significativement en comparaison aux CPEJs culti-
v�eesdansdu s�erum jeune(UFC23,2 ± 2,1/champs vs.
27,4 ± 1,8/champs, p< 0,05; pourcentage de cellules
doublement positives 84,3 ± 4,5% vs. 91,5 ± 5,6%,
p< 0,05; nombre relatif de cellules ayant migr�ees
1,348 ± 0,089 vs. 1,739 ± 0,035, p< 0,01). Le pour-
centage de cellules apoptotiques au sein des CPEAs
cultiv�ees avec du s�erum jeune diminuait en compa-
raison aux CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e(28,2 ± 4,3% vs. 42,3 ± 4,5%, p< 0,01), qui pouvait
etre �egalement bloqu�e pour partie par la wortman-
nine (39,2 ± 1,5%, p< 0,05) (Fig. 2B).
Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la
prolif�eration et la diff�erentiation des
CPEs
Comme pr�esent�e en Figure 3A, l’index de pro-
lif�eration des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum jeune
augmentait significativement en comparaison �acelui des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e(1,45 ± 0,22 vs. 1,00 ± 0,07, p< 0,01), alors que
l’index de prolif�eration des CPEJs cultiv�ees avec du
s�erum ag�e diminuait significativement en compa-
raison aux CPEJs cultiv�ees dans du s�erum jeune
(1,23 ± 0,15 vs. 1,99 ± 0,11, p< 0,01). La wort-
mannine diminuait significativement l’index de
prolif�eration des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum
jeune (1,22 ± 0,12 vs. 1,45 ± 0,22, p< 0,05; Fig. 3A).
Apr�es 10 joursde culture, les r�esultats de laRT-PCR
d�emontraient que l’expression des ARNm de la vWF
et de eNOS dans les CPEAs cultiv�ees dans du s�erum
jeune �etait significativement favoris�ee en comparai-
son aux CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e (vWF
2,19 ± 0,11 vs. 0,35 ± 0,09 et eNOS 2,33 ± 0,22 vs.
0,97 ± 0,07, p< 0,01, respectivement). Cependant,
l’expression diminuait significativement dans les
CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e en comparaison �acelles des CPEJs cultiv�ees dans du s�erum jeune (vWF
2,47 ± 0,13 vs. 3,72 ± 0,19 et eNOS 2,35 ± 0,27 vs.
Fig. 2. Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la fonction
des CPEs et sur l’apoptose. A Repr�esentations des UFCs,
des cellules doublement positives pour la prise de Dil-ac-
LDL et pour la liaison �a l’UEA-1, des capacit�es migratoi-
res, et de l’apoptose des CPEs. B Analyse par
3,12 ± 0,34, p< 0,01 et p < 0,05, respectivement).
L’ARNm de vWF et de eNOS au sein des CPEAs cul-
tiv�ees dans du s�erum jeune �etait diminu�e par la
wortmannine (vWF 0,92 ± 0,24 vs. 2,19 ± 0,11 et
eNOS 1,47 ± 0,11 vs. 2,33 ± 0,22, p< 0,01, respecti-
vement; Fig. 3B). Des r�esultats similaires concernant
l’expression de KDR et de CD31 �etaient retrouv�es lors
de l’analyse en FACS. Le s�erum jeune augmentait
significativement l’expression de KDR et de CD31
dans les CPEAs en comparaison au s�erum ag�e (KDR
26,03 ± 2,08% vs. 17,34 ± 1,15% et CD31
57,81 ± 2,32% vs. 42,86 ± 4,07%, p< 0,01, respecti-
vement). Ces effets �etaient �egalement diminu�es par la
wortmannine (22,24 ± 1,89% et 50,11 ± 4,42%,
p< 0,05, respectivement; Fig. 3C). Au contraire, le
s�erum ag�e diminuait significativement l’expression
de KDR et de CD31 dans les CPEJs en comparaison au
s�erum jeune (45,25 ± 3,16% vs. 52,88 ± 4,24% et
60,21 ± 5,19% vs. 68,65 ± 4,26%, p< 0,01 et 0,05,
respectivement; Fig. 3C).
Le s�erum jeune augmente le PI3-K,
l’activit�e eNOS et favorise l’Akt ainsi que
la phosphorylation de l’expression d’Akt
au sein des CPEAs
Puisque la fonction des CPEs et leur diff�erentiation
est en partie r�egul�e par la voie de signalisation PI3-
K/Akt30 et que la wortmannine diminuait au
moins en partie les effets du s�erum jeune sur les
CPEAs dans nos exp�erimentations (Figs. 2 et 3),
nous testions l’impact du s�erum d�eriv�e de rats ag�es
et jeunes sur l’activit�e et l’expression de PI3-K et de
Akt apr�es 10 jours de culture. Le s�erum jeune aug-
mentait significativement l’activit�e PI3-K des CPEAs
en comparaison au s�erum ag�e (51,6 ± 3,2 vs.
27,5 ± 2,2, p< 0,01); cependant, l’activit�e PI3-K des
CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e diminuait
significativement en comparaison �a celles des CPEJs
cultiv�ees dans du s�erum jeune (49,7 ± 5,3 vs.
59,6 ± 4,2, p< 0,05; Fig. 4A). En tant qu’effecteur
d’aval de PI3-K, l’expression d’Akt et des prot�eines
Akt-phosphoryl�ees dans les CPEAs cultiv�ees avec du
s�erum jeune �etait �egalement significativement
activ�ee en comparaison aux CPEAs cultiv�ees dans
du s�erum ag�e. Il est a not�e que le s�erum ag�e dimi-
nuait notablement l’expression de l’Akt total et des
histogramme de la fonction des CPEs et de leur apoptose.
Les donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyen-
ne ± DS, n¼ 6. Un p< 0,05 �etait consid�er�e statistique-
ment significatif. AS, s�erum ag�e; YS, s�erum jeune; W,
wortmannine.
A
CPEA + + - - +
CPEJ - - + + -
SA + - + - -
SJ - + - + +
W - - - - +
n=6, P<0.05
n=6, P<0.01
n=6, P<0.01
B
GAPDH (326bp)
vWF (408bp)
eNOS (450bp)
CP
EA
+SA
Marqueur
CP
EA
+SJ
CP
EJ+SA
CP
EJ+SJ
CP
EA
+SJ+W
n=4, P<0.01
n=4, P<0.01
n=4, P<0.01n=4, P<0.05
n=4, P<0.01
n=4, P<0.01
CPEA + + - - +
CPEJ - - + + -
SA + - + - -
SJ - + -
-
+ +
+W - - -
Inde
x de
pro
lifér
atio
nex
pres
sion
de
l'AR
Nm
'
570 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
Fig. 3. Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la prolif�eration des CPEs et sur la diff�erentiation. A Analyse par histo-
gramme des effets du s�erum sur la prolif�eration des CPEs, n¼ 6. Les donn�ees �etaient normalis�ees sur le groupe de
CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e. B Effets du s�erum sur la vWF et sur l’expression des ARNm des eNOS dans les CPEs
apr�es 10 jours de culture. Une image repr�esentative d’une RT-PCR est montr�ee, l’analyse des bandes de l’image est
�egalement fournie. Les r�esultats �etaient r�ep�et�es quatre fois. C Analyse en FACS de l’expression de CD31 et de KDR au
sein des CPEs apr�es 10 jours de culture. Les donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS, n¼ 6. Un p< 0,05
�etait consid�er�e statistiquement significatif. KDR, vascular growth factor receptor-2.
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 571
prot�eines Akt-phosphoryl�ees au sein des CPEJs en
comparaison au s�erum jeune (Fig. 4B).
La fonction et la diff�erentiation des CPEs pour-
raient etre en partie r�egul�ees par le signal de trans-
duction de la voie PI3-K/Akt/eNOS,31 en
cons�equence, l’activit�e eNOS et la production de NO�etaient �egalement recherch�ees dans notre �etude
(Fig. 4C, a). L’activit�e eNOS des CPEAs cultiv�ees
dans le groupe recevant du s�erum jeune augmentait
significativement en comparaison �a celles des CPEAs
cultiv�ees dans du s�erum ag�e (0,0067 ± 0,003 vs.
0,0048 ± 0,0004, p< 0,01). Cette activation pouvait
etre efficacement att�enu�ee par la wortmannine
(0,0061 ± 0,005, p< 0,05). Le s�erum ag�e inhibait�egalement l’activit�e eNOS des CPEJs en comparai-
son au s�erum jeune (0,0065 ± 0,0002 vs.
0,0076 ± 0,006, p< 0,01). La production de NO
(Fig. 4C, b) des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum
jeune augmentait �egalement significativement en
comparaison �a celles cultiv�ees dans du s�erum ag�e(7,65 ± 0,92 vs. 5,01 ± 1,05, p< 0,01), et cet effet
pouvait etre �egalement diminu�e par la wortman-
nine (6,25 ± 0,97, p< 0,05). Comme pour les CPEJs,
la concentration de NO dans le groupe cultiv�e dans
du s�erum ag�e diminuait �egalement significative-
ment en comparaison au groupe cultiv�e dans du
s�erum jeune (7,45 ± 0,45 vs. 11,13 ± 1,35, p< 0,01).
Augmentation du nombre de CPEAsparticipant �a la r�eendoth�elialisation de la
paroi vasculaire l�es�ee des jeunes rats
Afin d’obtenir d’autres preuves de la modulation de
l’activit�e des CPEs par l’age de l’environnement,
nous avons r�ealis�e des exp�erimentations sur des
mod�eles de l�esions des art�eres carotides de rats
(Fig. 5). Douze jours apr�es la l�esion carotidienne,
les vaisseaux �etaient pr�elev�es et soumis �a une
CPEA + + - -
CPEJ - - + +
SA + - + -
SJ - + - +
AP
I (3
, 4, 5
) P
3 pm
ol/1
06 cel
lule
s
Activité P13-K
n=6, P<0.01
n=6, P<0.05
B
GAPDH
Akt totale
Akt totale
P –Akt (ser473)
a
CP
EA
+SA
CP
EA
+SJ
CP
EJ+SA
CP
EJ+SJ
CP
EA
+SJ+W
b
b
n=5, P<0.05
CPEA + + - - +
CPEJ - - + + -
SA + - + - -
SJ - + - + +
W - - - - +
Con
cent
rati
on e
n ni
trit
e(µ
mol
/L)
n=5, P<0.01
n=5, P<0.01
production de NO
CP
EA
+SA
CP
EA
+SJ
CP
EJ+SA
CP
EJ+SJ
CP
EA
+SJ+W
n=4, P<0.01
n=4, P<0.01 n=4, P<0.01
n=4, P<0.05
n=4, P<0.05
n=4, P<0.01
C
aActivité eNOS
n=5, P<0.01
n=5, P<0.05
n=5, P<0.01
rati
o15N
-nit
rite
/14N
-nit
rite
572 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 573
analyse histologique. La Figure 5B pr�esente un
exemple repr�esentatif de formation neointimale
hautement reproductible au sein d’une art�ere l�es�ee
en comparaison �a une art�ere carotide non alt�er�ee
(Fig. 5A). La transplantation de CPEs �etait r�ealis�ee
sur les mod�eles l�es�es.
Comme pr�esent�e au niveau de la Figure 5C, le
nombre de CPEs transplant�ees dans la circulation
p�eriph�erique �etait dynamique apr�es transplanta-
tion. La concentration de cellules Dil-ac-LDL-posi-
tives dans le sang p�eriph�erique augmentait
grandement meme 1 heure apr�es la tranplantation
dans tous les groupes; les valeurs maximales appa-
raissaient apr�es 3 heures (CPEA + RA 471,5 ± 21,4,
CPEA + RJ 501,7 ± 41,3, CPEJ + RA 579,4 ± 43,6, et
CPEJ + RJ 581,5 ± 37,2; n¼ 10), restaient �a des
niveaux �elev�es jusqu’�a une journ�ee apr�es trans-
plantation, et diminuaient par la suite. Aucune
modification significative n’�etait retrouv�ee concer-
nant les valeurs maximales de CPEAs transplant�ees
entre les groupes jeunes et ag�es (jeunes vs. ag�es
501,7 ± 41,3 vs. 471,5 ± 21,4, n¼ 10; p> 0,8) ainsi
que des CPEJs transplant�ees entre les groupes jeu-
nes et ag�es (jeunes vs. ag�es 581,5 ± 37,2 vs.
579,4 ± 43,6, n¼ 10; p> 0,7; Fig. 5D).
Une analyse histologique �etait r�ealis�ee dans les
groupes de CPEs DAPI-marqu�ees transplant�ees.
Les r�esultats d�emontraient qu’une fluorescence
non sp�ecifique pouvait etre retrouv�ee dans les grou-
pes de CPEs transplant�ees ainsi que dans les groupes
t�emoins; cependant, aucune CPE DAPI-positive
n’�etait retrouv�ee sur la face luminale du groupe
t�emoin (Fig. 5E-G). Dans le groupe des CPEs
DAPI-marqu�ees transplant�ees, les cellules ayant
une coloration doublement positive pour la DAPI et
la vWF pouvaient etre retrouv�ees (Fig. 5H-J),
sugg�erant que les CPEs transplant�ees �etaient
recrut�ees au niveau des sites l�es�es et avaient des
ph�enotypes endoth�eliaux.
La quantification des CPEs DAPI-color�ees (Fig. 6)
au niveau du site l�es�e d�emontrait que les ratios du
nombre de CPEAs transplant�ees ainsi que la cir-
conf�erence luminale chez les rats ag�es diminuait
significativement en comparaison au groupe de rats
jeunes (3,2 ± 1,1 vs. 8,2 ± 0,8; p< 0,01). Cet effet
pourrait etre �egalement diminu�e par la wortmannine
(6,5 ± 1,2; p< 0,05). Lorsque des CPEJs �etaient
Fig. 4. Les s�erums jeunes et ag�es r�egulent l’activit�e du
PI3-K, de l’Akt, et du eNOS ou l’expression des prot�eines
dans les CPEs. A Les effets du s�erum sur l’activit�e du PI3-
K dans les CPEs, n¼ 6. B Voici une image repr�esentative
d’un Western blot de l’expression d’Akt1 total (62 kDa)
et d’Akt1 phosphoryl�e (Ser 473, 70 kDa). Les r�esultats
�etaient r�ep�et�es quatre fois (a). Analyse par histogramme
transplant�ees chez des rats ag�es, les ratios dimi-
nuaient significativement en comparaison au groupe
jeune (8,4 ± 1,8 vs. 11,6 ± 2,4; p< 0,05).
DISCUSSION
La transplantation de CPEs en temps que strat�egie
th�erapeutique dans le traitement des maladies vas-
culaires a �et�e envisag�e d�es leur d�ecouverte.32,33
Cependant, la facult�e des CPEs �a prendre part �a la
r�eparation endoth�eliale ou au remodelage vascu-
laire apr�es transplantation est r�egul�e par de nom-
breux facteurs. L’age est un des plus important
facteurs de r�egulation de l’activit�e des CPEs,
influencant directement les r�esultats des CPEs dans
leurs diverses applications th�erapeutiques.3,6,34 Les
CPEAs ont un potentiel significativement diminu�ede prolif�eration, migration et d�edoublement en
comparaison aux CPEJs. La transfusion de CPEJs
chez les rats ag�es am�eliorait d’avantage la fonction
angiog�enique du myocarde l�es�e par rapport �a la
transfusion de CPEAs.6 L’age peut avoir un impact
direct sur les CPEs comme cons�equence d’une
activit�e majeure.3,5 Inversement, l’age affecte indi-
rectement les cellules souches en agissant sur leur
milieu, ce qui conduit �a une modification des profils
des facteurs de croissance angiog�eniques et �a l’aug-
mentation des substances toxiques au sein du
microenvironnement. Ces deux effets conduisent �aune alt�eration de la r�eponse vasculaire des CPEs aux
facteurs de croissance endoth�eliaux et �a un potentiel
diminu�e des CPEs concernant la r�eg�en�eration
endoth�eliale.35,36
Meme si les cellules souches/prog�enitrices des
tissus et individus ag�es ont une activit�e diminu�ee
pouvant conduire �a l’�echec de la r�eg�en�eration tissu-
laire, l’activation de ces cellules peut etre restaur�ee
par un environnement adapt�e.1 Le d�eclin du
potentiel r�eg�en�erateur d’un tissu est par extension
du aux modifications li�ees �a l’age des cellules sou-
ches sp�ecifiques de chaque tissu.8 Cependant,
Carlson et al.7 d�emontr�erent que le muscle ag�e se
r�eg�en�erait avec succ�es lorsqu’il �etait implant�e chez
un hote jeune; l’exposition au s�erum jeune de cel-
lules satellites d�eriv�ees de rats ag�es conduisait �afavoriser l’expression du ligand Notch (Delta) et
(b) de l’Akt1 total et de l’Akt1 phosphoryl�e. C Effets des
s�erums jeunes et ag�es sur l’activit�e eNOS (a) et sur la
production de NO (b) dans les CPEs, n¼ 5. Les donn�ees
sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS. Un
p< 0,05 �etait consid�er�e comme significatif dans toutes les
exp�erimentations.
CPEA
CPEA+RA
CPEJ+RACPEJ+RA
CPEA+RJ
+ + - -
CPEJ - - + +
RA + - + -
RJ - + - +
A B
DAPI RevêtementvWF
DAPI vWF Revêtement** *
E
IH J
GF
Groupe témoin (E)
CPEs DAPI marquées au sein desartères carotides lésées de rats (H)
Coloration vWF correspondante (F) de (E)
Coloration vWFcorrespondante (I) de (H)
Revêtement (G) de (E)et (F)
Revêtement (J) de (H)et (I)
n=10, P>0.8
n=10, P>0. 7
C D
Com
pte
de C
PE
tr
ansp
lant
ées
/uL
de
sang
Com
pte
de C
PE
tr
ansp
lant
ées
/uL
de
sang
Délais post-transplantation (n=10)
574 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 575
augmentait la prolif�eration,8 sugg�erant que la
capacit�e intrins�eque de r�eg�en�eration des cellules
souches restait probablement largement intacte,
meme lorsque ces derni�eres sont ag�ees; l’activit�e des
cellules souches/prog�enitrices apr�es transplantation
pourrait etre modul�ee par des facteurs syst�emiques
d�ependant de l’age de l’environnement dans lequel
ces cellules �evoluent.
Dans la pr�esente �etude, nous avons d�emontr�e que
le s�erum jeune favorisait significativement l’activit�efonctionnelle des CPEAs en comparaison au s�erum
ag�e; au contraire, le s�erum ag�e inhiberait l’activit�edes CPEJs, sugg�erant que l’age de l’environnement
pourrait moduler les processus physiologiques inter-
venant au niveau des CPEs apr�es transplantation.
Une �etude in vivo chez le rat d�emontrait que l’envi-
ronnement jeune pouvait promouvoir la participa-
tion des CPEAs �a la r�eendoth�elialisation de la paroi
vasculaire l�es�ee en comparaison �a un environnement
ag�e. Inversement, l’environnement ag�e diminuait la
capacit�e de r�eparation de l’endoth�elium des CPEJs
transplant�ees.
De nombreuses voies de signalisation comme
Wnt, raf-ERK (kinase li�ee au signal extracellulaire,
extracellular signalerelated kinase) et Notch, sont
connues pour etre responsables de l’activit�e cellu-
laire.37 Le PI3-K est largement exprim�e et joue un
role crucial sur les r�eponses biologiques cellulaires
dont la survie cellulaire et la prolif�eration. Le PI3-K
catalyse la conversion du phosphatidylinositol-3,4-
bisphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol-3,4,5-
trisphosphate (PIP3). Le PIP3 sert �a recruter des
prot�eines contenant un domaine homologue �a la
Fig. 5. Effets des environnements jeunes (2 mois) et ag�es
(20 mois) sur la participation des CPEs �a la
r�eendothelisation des parois vasculaires endommag�ees
apr�es transplantation. A Art�ere carotide non
endommag�ee (intervention t�emoin). B Image
repr�esentative de la formation de n�eointima apr�es colo-
ration �a l’h�ematoxyline et �a l’�eosine ( fl�eche) 12 jours
apr�es l�esion des CEs. Formation de n�eointima chez 20
rats jeunes et ag�es non s�electionn�es �etait r�ep�et�e,
d�emontrant une formation de n�eointima hautement
reproductible. La transplantation de CPEs Dil-ac-LDL-
marqu�ees �etait utilis�ee pour identifier les concentrations
de CPEs transplant�ees dans le sang des mod�eles l�es�es. Les
valeurs maximales des concentrations de CPEs trans-
plant�ees dans le sang p�eriph�erique apparaissaient 3
heures apr�es, restaient �a des niveaux �elev�es jusqu’au
premier jour post-transplantation, et diminuaient par la
suite (n¼ 10) (C). Aucun changement significatif n’�etait
retrouv�e entre les valeurs maximales des CPEAs trans-
plant�ees dans les groupes ag�es et jeunes (n¼ 10, p> 0,8)
ou des CPEJs transplant�ees dans les groupes ag�es et
jeunes 3 heures apr�es la transplantation (n¼ 10, p> 0,7)
pleckstrine (pleckstrin homology, PH) comme l’Akt�a la membrane plasmatique. L’Akt, aussi connue
sous le nom de prot�eine kinase B, peut etre activ�ee
par un certain nombre de facteurs de croissance
selon un processus PI3-K-d�ependant et sert comme
r�egulateur multifonctionnel de la biologie cellulaire.
La voie de r�egulation P-I3-K/Akt joue un role
important dans la r�egulation de la migration des
CPEs, la prolif�eration et la diff�erentation.9,38 Dans
l’�etude actuelle, nous avons trouv�e que le s�erum
jeune pouvait augmenter significativement
l’activit�e de PI3-K dans les CPEAs et que le s�erum
ag�e diminuait notablement l’activit�e PI3-K dans les
CPEJs. Une tendance similaire �etait �egalement
confirm�ee sur Akt et sur la phosphorylation d’Akt.
Le NO peut etre s�ecr�et�e par les CPEs, qui �a son tour
joue un role important dans l’activit�e des CPEs. Il
peut r�eguler la r�eparation endoth�eliale et le
d�eveloppement vasculaire via la r�egulation de la
mobilisation des CPEs et la prolif�eration par l’acti-
vation de la voie de signalisation PI3-K/Akt.39 Nos
r�esultats d�emontrent que l’activit�e eNOS ainsi que la
s�ecr�etion de NO par les CPEAs pourraient etre
significativement augment�ees par l’adjonction de
s�erum jeune, mais �egalement inhib�ee par du s�erum
ag�e provenant de CPEJs. Les effets induits par un
environnement jeune sur les CPEAs pourraient etre
partiellement att�enu�es par la wortmannine, un
inhibiteur du PI3-K, sugg�erant que la voie PI3-K/
Akt �etait impliqu�ee dans les effets de l’environne-
ment ag�e sur les CPEs. Cependant, alors que les
effets de l’environnement jeune sur les CPEAs
pourraient ne pas etre compl�etement abolis par la
(D). Dans les groupes de CPEs transplant�ees DAPI-mar-
qu�ees, 10 jours apr�es transplantation, les vaisseaux
�etaient pr�elev�es et analys�es. Une fluorescence non
sp�ecifique (auto-fluorescence) pouvait etre trouv�ee dans
les groupes t�emoins et dans les groupes de transplanta-
tion de CPE; cependant, aucune cellule DAPI-positive
n’�etait retrouv�ee sur la face luminale du groupe t�emoin
(E-G). Dans le groupe ayant eu une transplantation de
CPEs, des cellules doublement positives pour les colora-
tions DAPI et vWF pouvaient etre retrouv�ees, sugg�erant
que les CPEs transplant�ees �etaient recrut�ees aux
sites l�es�es et avaient des ph�enotypes endoth�eliaux (H-J).
* Une CE que ne d�emontrait pas de fluorescence bleue et
ne pouvait donc etre d�eriv�ee des CPEs transplant�ees. Les
donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS.
Un p< 0,05 �etait consid�er�e significatif. AR, rat ag�e; YR,
rat jeune; CPEA + RA, CPEs d�eriv�ees de rats ag�es trans-
plant�ees chez d’autres rats ag�es; CPEA + RJ, CPEs
d�eriv�ees de rats ag�es transplant�ees chez des rats jeunes;
CPEJ + RA, CPEs d�eriv�ees de rat�es jeunes transplant�ees
chez des rats ag�es; CPEJ + RJ, CPEs d�eriv�ees de rats jeu-
nes transplant�ees chez d’autres rats jeunes.
Fig. 6. Analyse de la colonisation des sites vasculaires
l�es�es par les CPEs. Les ratios du nombre de cellules
transplant�ees positives pour la coloration du DAPI sur la
face luminale des sites l�es�es ainsi que la circonf�erence
luminale des tranches de section �etaient calcul�es.
L’histogramme r�esume les statistiques concernant les
CPEs positives pour la coloration du DAPI. Les donn�ees
sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS, n¼ 5.
Un p< 0,05 �etait consid�er�e significatif.
576 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire
wortmannine et les substances de l’environnement
li�ees �a l’age, la voie PI3-K/Akt n’est certainement
pas l’unique responsable de ces effets. Le role pr�ecis
des autres voies devrait etre explor�e dans de futures
exp�erimentations.
Les r�esultats retrouv�es indiquent que des facteurs
syst�emiques pr�esents dans l’environnement ag�epeuvent largement moduler la voie de signalisation
mol�eculaire critique de l’activit�e des CPEs. Egale-
ment, l’environnement jeune favoriserait la
r�eendoth�elialisation par les CPEs en comparaison �aun environnement ag�e. De r�ecentes �etudes
d�emontr�erent que certains facteurs comme le
VEGF, l’IGF-I,40 et les estrogenes,20 pouvaient
am�eliorer l’activit�e des CPEs chez des individus
jeunes ou ag�es. Il a �et�e constat�e que les niveaux de
ces facteurs dans la circulation p�eriph�erique dimi-
nuaient avec le vieillissement.40-42 A l’inverse, le
niveau circulant des produits terminaux de la gly-
cosylation (PTGs) augmente avec le vieillissement,
et il a �et�e constat�e que les PTGs induisent un dys-
fonctionnement des CPEs.43 Certains autres fac-
teurs, comme le TNF-a, l’interleukine-1b et
l’interf�eron-g, se modifient �egalement avec le
vieillissement;44 mais les roles de la plupart de ces
facteurs sur l’activit�e des CPEs reste inconnu. Des
�etudes futures devraient etre r�ealis�ees pour identi-
fier les facteurs du vieillissement ayant une
influence critique sur les CPEs et explorer les
m�ecanismes correspondants. Notre �etude sous-tend
que les CPEAs conservent une partie de leur
potentiel intrins�eque, mais qu’un environnement
syst�emique ag�e les empeche d’atteindre leur pleine
activation. Les r�esultats de cette �etude ouvrent de
nouvelles perspectives sur la compr�ehension de la
r�eparation endoth�eliale par les CPEs.
Cette �etude a �et�e soutenue par des bourses de la Fondation
Nationale Chinoise pour les Sciences Naturelles (30470729 et
30700889), le Onzi�eme Plan Militaire (06J013), le Plan
National pour le d�eveloppement de Nouvelles Technologies
(2006AA020902) et la Fondation pour la Recherche
Postdoctorale en Sciences Naturelles, Hopital Xinqiao,
Troisi�eme Universit�e M�edicale Militaire (2005A0132). Nous
remercions le Dr. Huali Kang pour ses conseils techniques.
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