Un environnement jeune inverse la baisse d'activité des cellules progénitrices endothéliales...

Sciences fondamentales

DOI of or1Departme

Chengdu MilitChine.

2InstituteMilitary Medic

3Departmeversity, Chong

Un environnement jeune inverse la baissed’activit�e des cellules prog�enitricesendoth�eliales ag�ees chez le rat: role de lavoie de signalisation du phosphatidylinositol3-kinase/akt

Guangxu Zhu,1 Mingbao Song,2 Huxuan Wang,1 Gang Zhao,2 Zhengping Yu,3

Yangguang Yin,2 Xiaohui Zhao,2 Lan Huang,2 Kunming, R. P. de Chine

Meme si des dysfonctionnements li�es �a l’age ont �et�e document�es dans des �etudes r�ecentes surles cellules prog�enitrices endoth�eliales (CPEs), le role pr�ecis de l’anciennet�e de l’environnementdans lequel �evoluent les CPEs demeure peu clair. Des rats femelles Sprague-Dawley de deux etvingt mois �etaient utilis�es dans la pr�esente �etude. Des CPEs isol�ees �a partir de rats jeunes(CPEJs) et ag�es (CPEAs) �etaient cultiv�ees dans du s�erum jeune ou ag�e. La migration et la pro-lif�eration des CPEs �etaient respectivement d�etect�ees �a l’aide d’une chambre de Boydenmodifi�ee et d’un test MTT; La diff�erentiation des CPEs �etait �evalu�ee par r�eaction en chaınepar polym�erase inverse (reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) ou par trides cellules en fluorescence ( fluorescence-activated cell sorting); Akt et l’expression des pro-t�eines Akt-phosphoryl�ees �etaient mesur�ees par Western Blot. Les CPEs �etaient alors trans-plant�ees chez des rats ayant des l�esions carotidiennes. Le s�erum jeune favorisaitsignificativement la migration, la prolif�eration et la diff�erentiation des CPEAs, et augmentait laphosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) ainsi que l’activit�e endoth�eliale de l’oxyde nitriquesynth�etase chez les CPEAs en comparaison au s�erum ag�e; L’Akt total ainsi que l’expression desprot�eines Akt-phosphoryl�ees des CPEAs �etaient significativement augment�ees par l’adjonctionde s�erum jeune. Le nombre de CPEAs transplant�ees au niveau des l�esions carotidiennes desrats jeunes augmentait de mani�ere significative en comparaison aux rats ag�es. Ces effetspourraient etre att�enu�es par la wortmannine, qui bloque sp�ecifiquement PI3-K. Un environne-ment jeune restaure en partie l’activit�e des CPEAs et favorise l’implantation de CPEAs au niveaudes l�esions vasculaires; L’activation de la voie de signalisation PI3-K/Akt est au moins pourpartie responsable de ce processus.

INTRODUCTION

Le d�eclin du potentiel r�eg�en�erateur d’un tissu est un

marqueur du vieillissement de ce dernier. Il est en

iginal article: 10.1016/j.avsg.2008.11.013.

nt of Clinical Laboratory, Kunming General Hospital,ary Area of PLA, Kunming, Yunnan Province, R. P. de

of Cardiovascular Disease, XinQiao Hospital, Thirdal University, ChongQing, R. P. de Chine.

nt of Occupational Health, Third Military Medical Uni-Qing, R. P. de Chine.

partie du aux changements relatifs �a l’age dans les

cellules souches sp�ecifiques du tissu en question.1,2

De r�ecentes �etudes ont r�ev�el�e une d�et�erioration

significative de l’angiog�en�ese chez le rat lors du

Correspondance: Guangxu Zhu, Department of Clinical Laboratory,Kunming General Hospital, Chengdu Military Area of PLA, Kunming,Yunnan Province 650032 R. P. de Chine, E-mail: [email protected]

Ann Vasc Surg 2009; 23: 519-534DOI: 10.1016/j.acvfr.2009.12.006� Annals of Vascular Surgery Inc.�Edit�e par ELSEVIER MASSON SAS

561

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

562 Zhu et al. Annales de chirurgie vasculaire

vieillissement.3 Ce ph�enom�ene est associ�e �a divers

facteurs dont la modification du nombre de cellules

prog�enitrices endoth�eliales (CPEs) dans la moelle

osseuse et la circulation sanguine ainsi qu’�a une

alt�eration des propri�et�es des CPEs.4,5 Il a �et�erapport�e que la transfusion de CPEs d�eriv�ees de

moelle osseuse de jeunes rats (CPEJs) chez des rats

ag�es am�eliorait d’avantage la fonction angiog�enique

du myocarde l�es�e que la transfusion de CPEs

d�eriv�ees de rats ag�es (CPEAs).6 Ceci sugg�ere que les

CPEJs poss�edent des propri�et�es angiog�eniques

sup�erieures aux CPEAs. Cependant, meme si les

tissus ag�es et les cellules souches qui en d�erivent

poss�edent un potentiel de r�eg�en�eration diminu�e et

une moindre activit�e en comparaison aux d�eriv�es de

tissus jeunes, ces �etats pourraient etre invers�es par le

type d’environnement dans lequel �evoluent ces

tissus. Carlson et al.7 d�emontr�erent que du muscle

ag�e se r�eg�en�erait avec succ�es lorsqu’il �etait greff�e �adu muscle jeune. Une �etude in vitro sur souris

sugg�erait �egalement que le s�erum d’individus jeunes

am�eliorait significativement la prolif�eration des

cellules satellites associ�ees aux fibres musculaires

ag�ees en culture en comparaison au s�erum de souris

ag�ees, sugg�erant ainsi qu’un s�erum jeune restaurait

la r�egulation positive de Delta et l’activation de

Notch dans les cellules satellites ag�ees.8 Le micro-

environnement est la base de la r�egulation de la

prolif�eration des cellules souches, de la diff�erentia-

tion et de la participation �a la r�eg�en�eration tissulaire;

ces r�esultats in vivo et in vitro d�emontr�erent que les�el�ements composant l’environnement jeune �etaient

capables d’am�eliorer les aspects mol�eculaires et

cellulaires de la diminution de l’activation des cel-

lules souches musculaires d�eriv�ees d’individus ag�es;

cependant, le role de l’anciennet�e de l’environne-

ment sur l’activit�e des CPEs demeure peu clair.

La phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) et son

effecteur direct d’aval Akt jouent un role important

dans la r�egulation de multiples r�eactions cellulaires,

comme la migration, la prolif�eration et la diff�erentia-

tion.9,10 L’activation de cette voie de signalisation a

des implications physiopathologiques significatives

sur les CPEs, comme la promotion de la prolif�eration

des CPEs, la migration, et la capacit�e de former des

colonies par l’activation de l’activit�e endoth�eliale de

l’oxyde nitrique synth�etase (eNOS). Ces effets

pourrait etre att�enu�es pharmacologiquement par un

bloqueur sp�ecifique de la PI3-K, la wortmannine ou

LY294002,11 ainsi que par le knockout du g�ene

gamma de la phosphoinositide 3-kinase. Ces deux�el�ements pourraient affecter la n�eovascularisation

post-isch�emique et le fonctionnement des CPEs.12

Cependant, le role de la voie de la PI3-K sur les

modifications induites par l’environnement sur

l’activit�e des CPEs reste �a �elucider. C’est pour ces

raisons que nous nous sommes concentr�es sur les

effets de l’environnement ag�e sur l’activit�e des CPEs,

ainsi que sur la responsabilit�e de la voie de signali-

sation de la PI3-K/Akt.

MAT�ERIELS ET M�ETHODES

Pr�eparation des s�erums et des cultures

de CPEs

Des rats femelles Sprague-Dawley saines (ag�ees de 2

et 20 mois, fournies par l’institut de zoologie du Dap-

ing Hospital, Troisi�eme Universit�e M�edicale Mili-

taire, R�epublique Populaire de Chine) �etaient

utilis�ees pour r�ealiser les exp�erimentations. Toutes

les proc�edures sur l’animal �etaient approuv�ees par

le comit�e �ethique animalier de la Troisi�eme

Universit�e M�edicale Militaire, et la recherche �etait

conforme au Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals de l’U.S. National Institutes of Health (NIH

Publication 85-23, r�evis�e en 1996). Les s�erums de rat�etaient pr�epar�es comme suit: des rats femelles jeunes

(2 mois) et ag�ees (20 mois) �etaient anesth�esi�es par

une injection intrap�eriton�eale de xylazine hydro-

chloride (4,6 mg/kg; Sigma, St. Louis, Missouri) et de

ketamine hydrochloride (70 mg/kg, Sigma); le sang�etait directement collect�e �a la seringue �a partir des

cœurs et centrifug�e �a 3,000 rpm pendant 10 min

(centrifuge GPR; Beckman, Fullerton, Californie,

Etats-Unis); le plasma �etait ensuite incub�e dans un

bain d’eau �a 4�C pendant une nuit et centrifug�e de

nouveau �a 3,000 rpm pendant 10 min; le s�erum �etait

pr�elev�e afin d’inactiver le compl�ement et plac�e �a56�C pendant 30 min; apr�es filtration aseptique par

une membrane poreuse 0,22 mm par trois fois, le

s�erum �etait collect�e et conserv�e au r�efrig�erateur �a-20�C en vue des exp�erimentations.

Les CPEs �etaient cultiv�ees selon des techniques

pr�ealablement d�ecrites, afin de r�eduire efficacement

le nombre de monocytes contaminants et les cellules

endoth�eliales (CEs) matures.13-16 En r�esum�e, les

cellules mononucl�ees (CMNs) d�eriv�ees de moelle

osseuse �etaient isol�ees �a partir des f�emurs et des

tibias des rats par centrifugation en gradient de

densit�e en utilisant une solution de s�eparation de

ficoll (Amersham Biosciences, Arlington Heights,

Illinois, E-U). Les CMNs isol�ees �etaient conserv�ees

dans un milieu d’aigle modifi�e de Dulbecco

(DMEM)/milieu modifi�e Ham F12 (3:1, DMEM/

F12; Sigma) avec du s�erum fœtal bovin (SFB) 20%

(v/v) ou 2% (v/v) combin�e avec du s�erum de rats

jeunes ou ag�es 20% (v/v), respectivement, facteur

de croissance vasculaire endoth�elial (vascular endo-

thelial growth factor, VEGF, 20 ng/mL; Sigma),

Vol. 23, No. 4, 2009 Environnement jeune et activit�e des cellules endoth�eliales 563

facteur de croissance fibroblastique basique (basic

fibroblast growth factor, bFGF, 5 ng/mL; R&D Systems,

Minneapolis, Minnesota, E-U), facteur de croissance

semblable �a l’insuline murin recombinant de type I

(recombinant murine insulin-like growth factor-I, IGF-I,

10 ng/mL; R&D Systems), facteur de croissance�epidermique humain recombinant (recombinant

human epidermal growth factor, EGF, 5 ng/mL; Clo-

netics, Wakersville, Maryland, E-U), p�enicilline

(100 U/mL), streptomycine (100 U/mL) et cultiv�ees

sur des plateaux (1� 106 cellules/cm2) contenant de

la fibronectine humaine. Ces cellules non-

adh�erentes �etaient transloqu�ees 24 h plus tard pour

etre cultiv�ees dans des flacons frais contenant de la

fibronectine humaine (Sigma). Quatre jours plus

tard, les cellules adh�erentes �etaient extensivement

lav�ees pour retirer les cellules non attach�ees et

plac�ees par un milieu frais; le milieu �etait chang�etous les deux jours.

Apr�es 4 jours de culture avec du s�erum jeune ou

ag�e, les CPEs �etaient trypsinis�ees avec de la trypsine

0,25%, lav�ees au tampon phosphate salin (PBS), et

suspendues dans un milieu contenant du SFB 2%

(v/v) combin�e avec du s�erum de rat 20% (v/v);

5� 104 cellules par champs �etaient positionn�ees

sur des plateaux impr�egn�es de fibronectine

humaine �a 96 ou 6 pointes. Vingt-quatre heures

plus tard, les cellules suspendues �etaient �elimin�ees

et remplac�ees par un milieu frais avec ou sans

wortmannine (10 mg/mL dans du dim�e-

thylsulfoxyde (DMSO), Sigma) �a une concentration

de 20 nM; le milieu �etait chang�e tous les deux jours.

Coloration cellulaire

Le ph�enotype cellulaire endoth�elial des CMNs

attach�ees �etait confirm�e par la prise de lipoprot�eines

basse densit�e ac�etyl�ees �a la 1,1-dioctadecyl-

3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine marqu�ee

(Dil-ac-LDL; Invitrogen, Carlsbad, Californie, E-U)

et de FITC conjugu�e �a la lectine BS-1 (Sigma)

comme d�ecrit pr�ec�edemment apr�es 4 jours de

culture; les cellules doublement positives �etaient

d�efinies comme des CPEs en diff�erenciation.17,18

Les cellules color�ees �etaient identifi�ees au micro-

scope invers�e �a fluorescence (Leica, Wetzler, Alle-

magne) et comptabilis�ees au grossissement �200.

Pour la caract�erisation des marqueurs de surface,

l’immunofluorescence �etait r�ealis�ee en utilisant un

anticorps polyclonal anti-CD-133 de ch�evre et un

anticorps monoclonal anti CD-34 de souris (Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie).

Bri�evement, les cellules �etaient lav�ees trois fois

avec du PBS, fix�ees avec du m�ethanol froid,

conserv�ees �a -20�C pendant 15 minutes, et lav�ees

avec du PBS pendant 5 min suppl�ementaires. De

l’albumine de s�erum bovin (ASB, 3%) �etait ajout�ee

au PBS et laiss�ee pendant 30 min. Secondairement,

les cellules �etaient incub�ees pendant 1 heure �atemp�erature ambiante avec les anticorps anti-

CD133 et anti-CD34 dilu�es �a 1:200 avec de l’ASB 3%

dans du PBS. Apr�es lavage au PBS, les cellules �etaient

expos�ees �a de la t�etra-rhodamine isothiocyanate

(TRITC) ou �a des anticorps secondaires conjugu�es �al’isothiocyanate de fluoresc�eine (FITC) �a 37�C pen-

dant 1 heure dans l’obscurit�e. Une immuno-

globuline d’isotype G (IgG) �etait utilis�ee comme

controle n�egatif.

Migration cellulaire, prolif�eration et

apoptose

La capacit�e migratrice des CPEs �etait d�etermin�ee

dans une chambre de Boyden modifi�ee (Jiangshu

Qilin Medical Equipment, Haimen, Chine) comme

pr�ec�edemment d�ecrit,19 avec quelques modifica-

tions; les pores de la membrane �etaient de 8 mm de

diam�etre. Apr�es 10 jours de culture, les cellules�etaient trypsinis�ees avec de la trypsine 0,25% et

lav�ees avec du PBS par trois fois; 2,5� 105 cellules�etaient suspendues dans 50 mL de DMEM/F12 sans

s�erum ni facteur de croissance et r�eensemenc�ees

dans le compartiment sup�erieur de la chambre de

Boyden modifi�ee. Du VEGF �a la concentration de 50

ng/mL �etait ajout�e au compartiment inf�erieur des

chambres. Apr�es 24 heures de culture, la partie

inf�erieure des filtres �etait lav�ee avec du PBS et fix�ee

avec du paraformald�ehyde 2%. Pour quantification,

les cellules �etaient color�ees avec une solution de

Giemsa. Les cellules des parties inf�erieures des filtres�etaient comptabilis�ees au grossissement �200.

L’activit�e mitog�enique �etait analys�ee comme

pr�ec�edemment d�ecrit.20 Bri�evement, les CPEs�etaient pr�elev�ees apr�es 3 jours de culture et ense-

menc�ees sur un plateau �a 96 pointes dans un milieu

sans rouge de ph�enol suppl�ement�e avec de l’ABS

0,5% pour la nuit. Puis, le milieu �etait abandonn�e et

un milieu frais sans rouge de ph�enol suppl�ement�eavec du SFB 2% (v/v) combin�e �a du s�erum de rat

20% (v/v) �etait ajout�e pour 4 jours. Avant la mesure

de densit�e optique (562 nm) par un lecteur de plaque

de microculture (HT-7000 Plus; Perkin-Elmer Life

Sciences, Shelton, Connecticut, E-U), les cellules

recevaient 10 mL de bromure de 3-(4,5-dimethyl-

thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT, 5 g/L)

pendant 6 heures et 200 mL de DMSO pendant

10 min.

La proportion de CPEs apoptotiques �etait

quantifi�ee par comptage visuel des noyaux pycnoti-

ques et fragment�es apr�es coloration hochest3342


(Sigma), comme pr�ec�edemment d�ecrit.20,21

Bri�evement, apr�es 5 jours de culture avec du s�erum,

les CPEs (1� 105 cellules/plateau) �etaient incub�ees

dans un milieu sans rouge de ph�enol contenant du

facteur de n�ecrose tumorale-a (tumor necrosis factor-

a, TNF-a) �a une concentration de 10 ng/mL; apr�es

24 heures de culture, les noyaux pycnotiques et

fragment�es color�es au hochest3342 �etaient compt�es

en pourcentage de cellules par champs.

R�eaction en chaine par polym�erase

inverse

L’ARN total de 1� 106 CPEs �etait extrait s�epar�ement

en utilisant le r�eactif d’isolement de Tripure (Roche,

Diagnostics, Bale, Suisse) selon les instructions du

constructeur. Le premier brin d’ADNc �etait synth�etis�epar transcription inverse (TI) de 1,0 mg d’ARN total en

utilisant le kit de TI en deux �etapes (Promega, Madi-

son, Wisconsin, E-U). Les primers �etaient concus �al’aide du logiciel Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft,

Palo Alto, Californie, E-U) sur la base des s�equences

publi�ees. Tous les primers concus �etaient positionn�es

sur leurs s�equences d’exons et choisis en fonction de

leurs temp�eratures d’hybridation puisque pouvant

partager le meme programme de thermo-cycler.

L’unicit�e et la sp�ecificit�e de chaque primer �etaient

v�erifi�ees en utilisant le programme BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

blast) pour la recherche d’alignement entre les

s�equences g�enomiques, en fonction des num�eros

d’acc�es �a la Genbank: eNOS (NM_021838) sens 5’-

atacttgaggatgtggctgtctg-3’ et antisens 5’-atacaggatagt

cgccttcacac-3’, 450 bp; Facteur von Willebrand

(vWF, XM_001066203) sens 5’-aggctgggtacta-

caaactttcc-3’ et antisens 5’-tgacgcatgtacacaaagtcttc-

3’, 408 bp; glyceraldehyde-3-phosphate dehy-

drogenase (GAPDH, NM_017008; utilis�ee comme

controle interne) sens 5’-cccttcattgacctcaactacat-3’ et

antisens 5’-agggagttgtcatatttctcgtg-3’, 326 bp. Une

PCR ( polymerase chain reaction) �etait r�ealis�ee comme

suit: 95�C pendant 10 min; 38 cycles �a 94�C pendant

30 sec, 55�C pendant 30 sec, 72�C pendant 1 minute

puis 72�C pendant 10 min. Les produits amplifi�es�etaient soumis �a une �electrophor�ese sur gel d’agarose

1,5% dans un tampon trisebase d’acide�ethyl�enediaminet�etraac�etique (EDTA; tampon TBE)

color�e avec du bromure d’�ethidium.

Analyse du tri des cellules activ�ees en

fluorescence

Les CPEs �etaient incub�ees avec un des anticorps sui-

vants: anticorps monoclonal de souris anti-CD31 de

rat (IgG1 de souris) et anticorps monoclonal de

souris anti-KDR de rat (IgG1 de souris) �a une

concentration de 2,5 mg/5� 104 cellules dans de

l’ASB 1% �a 4�C pendant 45 min. Les anticorps

d’isotypes identiques servaient de controles.

Ensuite, les cellules �etaient incub�ees avec des anti-

corps secondaires de singe anti-souris conjugu�es au

FITC �a 37�C pendant 30 min (tous ces anticorps

provenaient de Santa Cruz Biotechnology). Apr�es

traitement, les cellules �etaient fix�ees dans du para-

formald�ehyde 1%, et une analyse quantitative �etait

r�ealis�ee en utilisant un trieur de cellules activ�ees par

fluorescence IV Becton-Dickinson (Franklin Lakes,

New Jersey, E-U).

PI3-K et activit�e eNOS

L’activit�e PI3-K �etait d�etect�ee par la mesure du mon-

tant de PI(3,4,5)P3 extrait des cellules par dosage

d’immunosorption li�ee �a enzyme standard (enzyme-

linked immunosorbent assay, ELISA) avec le kit ELISA

de masse PIP3 (Echelon Biosciences, Salt Lake City,

Utah, E-U). Le PI(3,4,5)P3 �etait extrait selon le

protocole suivant. Les cellules (5� 106) �etaient

collect�ees et centrifug�ees (525� g, 5 min, 4�C). Le

r�esidu �etait resuspendu dans une solution d’acide

trichloroac�etique 5% (TCA)/1 mM EDTA et

centrifug�e (525� g, 5 min). Les lipides neutres�etaient extraits par l’addition d’une solution de

MeOH:CHCl3 (2:1); la suspension �etait vortex�ee

trois fois en 10 min �a temp�erature ambiante, puis

centrifug�ee (525 g, 5 min), et l’�etape �etait r�ep�et�ee �anouveau. Les lipides acides �etaient extraits par

l’addition d’une solution de MeOH:CHCl3:12 M HCl

(80:40:1); la suspension �etait vortex�ee quatre fois en

15 min �a temp�erature ambiante, puis centrifug�ee

(525� g, 5 min). Le surnageant �etait mix�e avec du

CHCl3 et de l’HCl (0,1 M), et cette suspension �etait

centrifug�ee (525� g, 5 min) pour s�eparer les phases

organiques et aqueuses. La phase organique �etait

collect�ee et s�ech�ee �a l’aide d’un s�echoir sous vide.

Les lipides s�ech�es �etaient resuspendus dans un

tampon de PIP3 (50 mM N-2-hydroxye-

thylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid [HEPES],

150 mM NaCl, 1.5% Na cholate, pH 7,4), soniqu�edans un bain d’eau pendant 5 min, et laiss�e le temps

d’une nuit �a 4�C. Apr�es cette extraction, un ELISA�etait utilis�e suivant les consignes du constructeur

(Echelon Biosciences).

L’activit�e eNOS �etait d�etermin�ee par l’�evaluation

de la conversion de la L-[guanidino-15N2] arginine

en 15 N-nitrite par chromatographie en phase

gazeuse/spectrom�etrie de masse comme pr�ec�edem-

ment d�ecrit.22,23 Les CPEs �etaient incub�ees pendant

24 heures �a 37�C avec 5 mM de L-[guanidino-15N2]

arginine. Le ratio 15 N-nitrite form�e/14 N-nitrite �etait

ensuite calcul�e. L’oxyde nitrique (NO) est instable,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast


mais il poss�ede des produits terminaux stables �a type

de nitrites et nitrates. En cons�equence, le meilleur

index de g�en�eration de NO est la somme des nitrites et

des nitrates. Le milieu de culture des CPEs �etait

pr�elev�e et conserv�e �ae80�C jusqu’�a d�etection. Le

niveau de nitrite/nitrate �etait mesur�e comme

pr�ec�edemment d�ecrit.24,25 Bri�evement, les nitrates�etaient convertis en nitrites par la nitrate r�eductase, et

les nitrites totaux �etaient mesur�es par un kit de r�eactif

de Griess (Promega). L’absorbance �etait d�etermin�ee �a540 nm par un spectrophotom�etre.

Western blotting

Les prot�eines cellulaires �etaient pr�epar�ees et s�epar�ees

par �electrophor�ese sur gels de polyacrylamide en

pr�esence de dod�ecylsulfate de sodium (SDS-PAGE)

comme d�ecrit pr�ec�edemment,26 ajust�e suivant

l’expression de GAPDH. Apr�es s�eparation, les pro-

t�eines �etaient transf�er�ees sur une membrane de

nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences).

Les membranes �etaient bloqu�ees par incubation dans

un tampon tris-salin (pH 7,5), contenant 0,1% (v/v)

Tween-20 et 5% (v/v) de lait sec non gras pendant 2

heures, puis par 2 heures d’incubation �a temp�erature

ambiante avec un anticorps polyclonal anti-Akt1

(62 kDa) de ch�evre, un anticorps polyclonal anti-

phospho-Akt1 (Ser 473, 70 kDa) de lapin, et un

anticorps monoclonal anti-GAPDH (37 kDa) de sou-

ris (Santa Cruz Biotechnology). Les filtres �etaient

lav�es extensivement dans un tampon tris-salin con-

tenant 0,1% (v/v) de Tween-20 avant incubation

pendant 1 heure avec un anticorps secondaire con-

jugu�e �a une peroxydase. Les membranes �etaient

ensuite lav�ees et d�evelopp�ees en utilisant le substrat

de chimiluminescence Super Signal� (Pierce, Rock-

ford, Illinois, E-U).

Mod�ele de l�esion de l’art�ere carotide ettransplantation de CPEs

Des l�esions de d�enudation au ballon �etaient r�ealis�ees

sur des art�eres carotides de rats suivant une

proc�edure pr�ealablement d�ecrite.27 Bri�evement, les

rats �etaient anesth�esi�es par une injection

intrap�eriton�eale de ketamine hydrochloride

(70 mg/kg) et de la xylazine hydrochloride (4,6 mg/

kg). Une incision m�ediane cervicale �etait r�ealis�ee

pour exposer la carotide externe gauche. Un

cath�eter d’embolectomie de Fogarty 2F (Baxter

Health Care, Irvine, Californie, E-U) �etait introduit

dans l’art�ere carotide externe gauche et avanc�e via

l’art�ere carotide commune dans l’arche aortique. Le

ballon �etait ensuite inflat�e avec une solution sal�ee

(environ 0,02 mL) jusqu’�a sentir une r�esistance,

puis retir�e de l’art�ere carotide commune en

effectuant des mouvements de rotation pour

d�enuder le vaisseau de son endoth�elium. Cette

proc�edure �etait r�ep�et�ee trois fois, puis le cath�eter�etait d�efinitivement retir�e. La carotide externe �etait

alors li�ee puis l’incision referm�ee. Les art�eres caro-

tides de rats recevant les interventions t�emoins

servaient de controles. Toutes les proc�edures �etaient

approuv�ees et en accords avec les recommandations

en vigueur dans notre institution.

Les transplantations de CPEs �etaient r�ealis�ees sur

les mod�eles de l�esions. Apr�es 4 jours en culture, les

CPEs �etaient trypsinis�ees avec de la trypsine

0,25%, lav�ees avec du PBS par trois fois, marqu�ees

avec du DAPI, puis suspendues dans 1 mL de solu-

tion saline, et transplant�ees (5� 107 cellules/kg de

poids) par injection dans le veine caudale dans

chaque rat ayant une carotide l�es�ee, peu apr�es

l’induction de la l�esion carotidienne; les volumes

des injections salines correspondant �a chaque rat�etaient utilis�es dans le groupe t�emoin. Une admi-

nistration de wortmannine (10 mg/mL dans du

DMSO, dilu�ee dans une solution saline �a 10mmol/

mL avant injection; 5mmol/kg) �etait faite ins-

tantan�ement �egalement par la veine caudale apr�es

transplantation des CPEs; des volumes correspon-

dants de solvants �etaient administr�es �a tous les rats

des autres groupes. Les CPEs cultiv�ees �etaient mar-

qu�ees avec du Dil-ac-LDL comme d�ecrit pr�ec�edem-

ment28,29 et transplant�ees suivant une injection de

CPE DAPI-marqu�ees chez les mod�eles l�es�es.

Les rats s�ejournaient dans un environnement�eclair�e en permanence, �a temp�erature et humidit�econtrol�ees. Ils �etaient nourris et hydrat�es ad libitum

apr�es transplantation de CPEs. Dans les groupes

recevant l’injection de CPEs Dil-ac-LDL-marqu�ees,

7 mL de sang �etaient directement collect�es �a la

seringue �a partir des cœurs des rats l�es�es �a 0 h, 1 h,

3 h, 6 h, 12 h, 1 jour, 2 jours, et 4 jours. Le nombre

de CMNs totaux isol�ees �a partir du sang �etait alors

calcul�e; 5� 104 CMNs �etaient analys�ees comme

pr�ec�edemment d�ecrit.28,29

Les CPEs Dil-ac-LDL-marqu�ees �etaient s�epar�ees

des autres types de cellules en utilisant un trieur de

cellules de type Becton-Dickson FACS IV (Franklin

Lakes, New Jersey, E-U). Les CMNs isol�ees �a partir

des groupes controles �etaient utilis�ees comme contro-

les n�egatifs. La proportion de cellules Dil-ac-LDL-

positives �etait utilis�ee pour �evaluer le nombre de

CPEs transplant�ees dans le sang de ces mod�eles; les

pourcentages �etaient convertis en nombre de

cellules par microlitre de sang. Dans les groupes rece-

vantune transplantation de CPEs DAPI-marqu�ees, les

vaisseaux �etaient pr�elev�es 10 jours plus tard puis

d�ecoup�es et analys�es en histologie sous un

microscope �a fluorescence invers�ee apr�es

n=10, P<0.05

20µm 20µm

20µm 20µm

Dil-ac-LDL FITC-UEA-1

NCNC

A

100µm 100µm

100µm 100µm

a Bn=6, P<0.01

c

d e

b

20µm 20µm

CD34

E

D

20µm

DAPI

CD133 DAPI

C

n=6, P<0.05

20µm

n=6, P<0.05

jeunes agés

jeunes agés

jeunes agés

jeunes agés

UFC

/ ch

amp

Pour

cent

age

de c

ellu

les

doub

lem

ent p

ositi

ves

(%)

Cel

lule

s po

sitiv

es p

our

la c

olor

atio

n de

CD

34 (

%)

Cel

lule

s po

sitiv

es p

our

la c

olor

atio

n de

CD

133

(%)



immunocoloration de la vWF; un isotype IgG �etait

utilis�e comme controle. La circonf�erence de la

lumi�ere au niveau de chaque section �etait d�etermin�ee

par le logiciel Leica QWin, et les ratios entre le nombre

de cellules transplant�ees positives pour la coloration

DAPI sur le versant luminal des sites l�es�es et la cir-

conf�erence de la lumi�ere �etaient calcul�es.

Analyse statistique

Toutes les valeurs sont exprim�ees suivant leur

moyenne ± d�eviation standard (DS). Les diff�erences

entre les donn�ees �etaient analys�ees �a la recherche de

significativit�e par r�ealisation de l’analyse de variance

pour comparaison multiple en utilisant le logiciel

SPSS 11.0 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Un

p< 0,05 �etait consid�er�e statistiquement significatif.

R�ESULTATS

Caract�eres des CPEs putatives de rats

Les CMNs d�eriv�ees de moelle osseuse de rats ag�es et

jeunes peuvent etre diff�erenci�ees en cellules ayant

des ph�enotypes CPE dans un milieu contenant du

facteur de croissance endoth�elial sur des plateaux

impr�egn�es de fibronectine. Comme d�emontr�e sur

le Figure 1A, certaines CMNs �etaient arrang�ees en

anneau (a) ou en amas (b) au deuxi�eme jour suivant

l’inoculation. Les cellules cultiv�ees d�emontr�erent

une structure lin�eaire apr�es trois jours de culture (c),

des foyers apparaissait en deux semaines (d), et une

structure tubulo-reticul�ee apparaissait en quatre

semaines (e). Meme si il apparaissait que les CMNs

isol�ees �a partir de jeunes rats �etaient d’apparence

mieux distribu�ees que celles provenant de rats ag�es,

les cellules attach�ees des deux groupes, jeune et ag�e,

d�emontr�erent la meme morphologie et les memes

caract�eristiques de diff�erentiation en microscopie

optique. Apr�es 14 jours de culture, la capacit�e �aformer une colonie �etait analys�ee; en comparaison

avec cela dans le groupe ag�e, la capacit�e �a former

Fig. 1. CMNs d�eriv�ees de rats ag�es diff�erenci�ees en cel-

lules ayant des ph�enotypes CPEs dans une milieu con-

tenant du VEGF sur des plateaux contenant de la

fibronectine. A CMNs dispos�ees en lignes (a) et en amas

(b) au deuxi�eme jour suivant l’inoculation. Les cellules

cultiv�ees d�emontraient une structure en corde apr�es 3

jours de culture (c), des formations focales apparaissaient

en 2 semaines environ (d), et une structure tubulo-

r�eticulaire apparaissait en 4 semaines environ (e). B

Apr�es 14 jours, le nombre d’UFCs des groupes jeunes et

ag�es �etait analys�e, n¼ 6. C Les ph�enotypes des CPEs

�etaient caract�eris�es comme �etant doublement positifs

une colonie dans le groupe jeune �etait significati-

vement augment�ee (32,8 ± 3,5/champs vs.

24,1 ± 4,2/champs, p< 0,01; Fig. 1B).

Les ph�enotypes cellulaires endoth�eliaux �etaient

caract�eris�es comme �etant doublement positifs pour

la prise de DiL-ac-LDL (rouge) et la liaison �a la lec-

tine (vert) apr�es 4 jours de culture (Fig. 1C, gau-

che). Le comptage cellulaire �a la vue de 10 champs

(�200) pris au hasard au microscope �a fluorescence

invers�ee r�ev�elait que le pourcentage de cellules

doublement positives dans le groupe ag�e(82,8 ± 8,7%) �etait significativement plus bas que

dans le groupe jeune (92,1 ± 3,4%; p< 0,05; Fig. 1C,

droite). L’immunocoloration d�emontrait que les

CPEs cultiv�ees exprimaient le CD34 (41,2 ± 5,4% et

32,3 ± 6,6% chez les groupes jeunes et ag�es, res-

pectivement; Fig. 1D) et le CD133 (19,3 ± 3,8% et

12,7 ± 3,7% chez les groupes jeunes et ag�es, res-

pectivement; Fig. 1E), et indiquait le ph�enotype

cellulaire souche/prog�eniteur. Il n’�etait pas retro-

uv�ee de fluorescence dans le groupe de l’isotype IgG

(donn�ees non montr�ees).

Effets des s�erums jeunes et ag�es sur le

fonctionnement des CPEs et l’apoptose

Les unit�es formant une colonie (UFCs) de CPEs�etaient �evalu�eesapr�es 2 semaines enculture. Le pour-

centage de CPEs doublement positives pour la prise de

Dil-ac-LDL et la liaison de l’UEA-1 �etait mesur�e apr�es

4 jours de culture. La migration des CPEs et l’apoptose�etaient �evalu�ees comme nous l’avons d�ecrit dans la

section ‘‘Mat�eriels et m�ethodes’’ (Fig. 2A). Le nom-

bre de CFUs, le nombre de cellules ayant migr�ees, et

les pourcentages de CPEs doublement positives pour

la prise de Dil-ac-LDL et la liaison de l’UEA-1 dans les

CPEAs cultiv�ees avec du s�erum jeune augmentaient

tous significativement en comparaison �a celles culti-

v�ees dans du s�erum ag�e (UFC 23,7 ± 2,3/champs vs.

16,4 ± 2,1/champs, p< 0,01; pourcentage de cellules

doublement positives 79,8 ± 3,9% vs. 68,9 ± 2,8%,

p< 0,01; nombre relatif de cellules ayant migr�ees

pour la prise de DiL-ac-LDL (rouge) et comme liant la

lectine (vert); les deux photos du bas C pr�esentent les

controles n�egatifs (CN) correspondant �a la prise de Dil-ac-

LDL et �a la liaison �a la lectine. Le pourcentage de cellules

doublement-positives �etait calcul�e, n¼ 10. L’immuno-

coloration sugg�erait que les CPEs exprimaient le CD34

(D) et le CD133 (E); l’int�egrit�e cellulaire �etait

document�ee par coloration nucl�eaire avec du 4,6-dia-

midino-2-phenylindole (DAPI; bleu), et les pourcentages

de cellules positives �etaient calcul�es, n¼ 6. Les donn�ees

sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS. Un

p< 0,05 �etait consid�er�e statistiquement significatif.


1,432 ± 0,097 vs. 1,000 ± 0,011, p< 0,01). Ces effets

pouvaient etre efficacement diminu�es par la wort-

mannine, qui bloque le PI3-K (UFC 21,4 ± 1,2/

champs, p< 0,05; pourcentage de cellules dou-

blement positives 75,8 ± 4,3%, p< 0,05; nombre de

cellules ayant migr�ees 1,322 ± 0,096, p< 0,01).

Cependant, les capacit�es de fonctionnement des

CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e diminuaient

significativement en comparaison aux CPEJs culti-

v�eesdansdu s�erum jeune(UFC23,2 ± 2,1/champs vs.

27,4 ± 1,8/champs, p< 0,05; pourcentage de cellules

doublement positives 84,3 ± 4,5% vs. 91,5 ± 5,6%,

p< 0,05; nombre relatif de cellules ayant migr�ees

1,348 ± 0,089 vs. 1,739 ± 0,035, p< 0,01). Le pour-

centage de cellules apoptotiques au sein des CPEAs

cultiv�ees avec du s�erum jeune diminuait en compa-

raison aux CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e(28,2 ± 4,3% vs. 42,3 ± 4,5%, p< 0,01), qui pouvait

etre �egalement bloqu�e pour partie par la wortman-

nine (39,2 ± 1,5%, p< 0,05) (Fig. 2B).

Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la

prolif�eration et la diff�erentiation des

CPEs

Comme pr�esent�e en Figure 3A, l’index de pro-

lif�eration des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum jeune

augmentait significativement en comparaison �acelui des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e(1,45 ± 0,22 vs. 1,00 ± 0,07, p< 0,01), alors que

l’index de prolif�eration des CPEJs cultiv�ees avec du

s�erum ag�e diminuait significativement en compa-

raison aux CPEJs cultiv�ees dans du s�erum jeune

(1,23 ± 0,15 vs. 1,99 ± 0,11, p< 0,01). La wort-

mannine diminuait significativement l’index de

prolif�eration des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum

jeune (1,22 ± 0,12 vs. 1,45 ± 0,22, p< 0,05; Fig. 3A).

Apr�es 10 joursde culture, les r�esultats de laRT-PCR

d�emontraient que l’expression des ARNm de la vWF

et de eNOS dans les CPEAs cultiv�ees dans du s�erum

jeune �etait significativement favoris�ee en comparai-

son aux CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e (vWF

2,19 ± 0,11 vs. 0,35 ± 0,09 et eNOS 2,33 ± 0,22 vs.

0,97 ± 0,07, p< 0,01, respectivement). Cependant,

l’expression diminuait significativement dans les

CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e en comparaison �acelles des CPEJs cultiv�ees dans du s�erum jeune (vWF

2,47 ± 0,13 vs. 3,72 ± 0,19 et eNOS 2,35 ± 0,27 vs.

Fig. 2. Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la fonction

des CPEs et sur l’apoptose. A Repr�esentations des UFCs,

des cellules doublement positives pour la prise de Dil-ac-

LDL et pour la liaison �a l’UEA-1, des capacit�es migratoi-

res, et de l’apoptose des CPEs. B Analyse par

3,12 ± 0,34, p< 0,01 et p < 0,05, respectivement).

L’ARNm de vWF et de eNOS au sein des CPEAs cul-

tiv�ees dans du s�erum jeune �etait diminu�e par la

wortmannine (vWF 0,92 ± 0,24 vs. 2,19 ± 0,11 et

eNOS 1,47 ± 0,11 vs. 2,33 ± 0,22, p< 0,01, respecti-

vement; Fig. 3B). Des r�esultats similaires concernant

l’expression de KDR et de CD31 �etaient retrouv�es lors

de l’analyse en FACS. Le s�erum jeune augmentait

significativement l’expression de KDR et de CD31

dans les CPEAs en comparaison au s�erum ag�e (KDR

26,03 ± 2,08% vs. 17,34 ± 1,15% et CD31

57,81 ± 2,32% vs. 42,86 ± 4,07%, p< 0,01, respecti-

vement). Ces effets �etaient �egalement diminu�es par la

wortmannine (22,24 ± 1,89% et 50,11 ± 4,42%,

p< 0,05, respectivement; Fig. 3C). Au contraire, le

s�erum ag�e diminuait significativement l’expression

de KDR et de CD31 dans les CPEJs en comparaison au

s�erum jeune (45,25 ± 3,16% vs. 52,88 ± 4,24% et

60,21 ± 5,19% vs. 68,65 ± 4,26%, p< 0,01 et 0,05,

respectivement; Fig. 3C).

Le s�erum jeune augmente le PI3-K,

l’activit�e eNOS et favorise l’Akt ainsi que

la phosphorylation de l’expression d’Akt

au sein des CPEAs

Puisque la fonction des CPEs et leur diff�erentiation

est en partie r�egul�e par la voie de signalisation PI3-

K/Akt30 et que la wortmannine diminuait au

moins en partie les effets du s�erum jeune sur les

CPEAs dans nos exp�erimentations (Figs. 2 et 3),

nous testions l’impact du s�erum d�eriv�e de rats ag�es

et jeunes sur l’activit�e et l’expression de PI3-K et de

Akt apr�es 10 jours de culture. Le s�erum jeune aug-

mentait significativement l’activit�e PI3-K des CPEAs

en comparaison au s�erum ag�e (51,6 ± 3,2 vs.

27,5 ± 2,2, p< 0,01); cependant, l’activit�e PI3-K des

CPEJs cultiv�ees dans du s�erum ag�e diminuait

significativement en comparaison �a celles des CPEJs

cultiv�ees dans du s�erum jeune (49,7 ± 5,3 vs.

59,6 ± 4,2, p< 0,05; Fig. 4A). En tant qu’effecteur

d’aval de PI3-K, l’expression d’Akt et des prot�eines

Akt-phosphoryl�ees dans les CPEAs cultiv�ees avec du

s�erum jeune �etait �egalement significativement

activ�ee en comparaison aux CPEAs cultiv�ees dans

du s�erum ag�e. Il est a not�e que le s�erum ag�e dimi-

nuait notablement l’expression de l’Akt total et des

histogramme de la fonction des CPEs et de leur apoptose.

Les donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyen-

ne ± DS, n¼ 6. Un p< 0,05 �etait consid�er�e statistique-

ment significatif. AS, s�erum ag�e; YS, s�erum jeune; W,

wortmannine.

A

CPEA + + - - +

CPEJ - - + + -

SA + - + - -

SJ - + - + +

W - - - - +

n=6, P<0.05

n=6, P<0.01

n=6, P<0.01

B

GAPDH (326bp)

vWF (408bp)

eNOS (450bp)

CP

EA

+SA

Marqueur

CP

EA

+SJ

CP

EJ+SA

CP

EJ+SJ

CP

EA

+SJ+W

n=4, P<0.01

n=4, P<0.01

n=4, P<0.01n=4, P<0.05

n=4, P<0.01

n=4, P<0.01

CPEA + + - - +

CPEJ - - + + -

SA + - + - -

SJ - + -

-

+ +

+W - - -

Inde

x de

pro

lifér

atio

nex

pres

sion

de

l'AR

Nm

'


Fig. 3. Effets des s�erums jeunes et ag�es sur la prolif�eration des CPEs et sur la diff�erentiation. A Analyse par histo-

gramme des effets du s�erum sur la prolif�eration des CPEs, n¼ 6. Les donn�ees �etaient normalis�ees sur le groupe de

CPEAs cultiv�ees dans du s�erum ag�e. B Effets du s�erum sur la vWF et sur l’expression des ARNm des eNOS dans les CPEs

apr�es 10 jours de culture. Une image repr�esentative d’une RT-PCR est montr�ee, l’analyse des bandes de l’image est

�egalement fournie. Les r�esultats �etaient r�ep�et�es quatre fois. C Analyse en FACS de l’expression de CD31 et de KDR au

sein des CPEs apr�es 10 jours de culture. Les donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS, n¼ 6. Un p< 0,05

�etait consid�er�e statistiquement significatif. KDR, vascular growth factor receptor-2.


prot�eines Akt-phosphoryl�ees au sein des CPEJs en

comparaison au s�erum jeune (Fig. 4B).

La fonction et la diff�erentiation des CPEs pour-

raient etre en partie r�egul�ees par le signal de trans-

duction de la voie PI3-K/Akt/eNOS,31 en

cons�equence, l’activit�e eNOS et la production de NO�etaient �egalement recherch�ees dans notre �etude

(Fig. 4C, a). L’activit�e eNOS des CPEAs cultiv�ees

dans le groupe recevant du s�erum jeune augmentait

significativement en comparaison �a celles des CPEAs

cultiv�ees dans du s�erum ag�e (0,0067 ± 0,003 vs.

0,0048 ± 0,0004, p< 0,01). Cette activation pouvait

etre efficacement att�enu�ee par la wortmannine

(0,0061 ± 0,005, p< 0,05). Le s�erum ag�e inhibait�egalement l’activit�e eNOS des CPEJs en comparai-

son au s�erum jeune (0,0065 ± 0,0002 vs.

0,0076 ± 0,006, p< 0,01). La production de NO

(Fig. 4C, b) des CPEAs cultiv�ees dans du s�erum

jeune augmentait �egalement significativement en

comparaison �a celles cultiv�ees dans du s�erum ag�e(7,65 ± 0,92 vs. 5,01 ± 1,05, p< 0,01), et cet effet

pouvait etre �egalement diminu�e par la wortman-

nine (6,25 ± 0,97, p< 0,05). Comme pour les CPEJs,

la concentration de NO dans le groupe cultiv�e dans

du s�erum ag�e diminuait �egalement significative-

ment en comparaison au groupe cultiv�e dans du

s�erum jeune (7,45 ± 0,45 vs. 11,13 ± 1,35, p< 0,01).

Augmentation du nombre de CPEAsparticipant �a la r�eendoth�elialisation de la

paroi vasculaire l�es�ee des jeunes rats

Afin d’obtenir d’autres preuves de la modulation de

l’activit�e des CPEs par l’age de l’environnement,

nous avons r�ealis�e des exp�erimentations sur des

mod�eles de l�esions des art�eres carotides de rats

(Fig. 5). Douze jours apr�es la l�esion carotidienne,

les vaisseaux �etaient pr�elev�es et soumis �a une

CPEA + + - -

CPEJ - - + +

SA + - + -

SJ - + - +

AP

I (3

, 4, 5

) P

3 pm

ol/1

06 cel

lule

s

Activité P13-K

n=6, P<0.01

n=6, P<0.05

B

GAPDH

Akt totale

Akt totale

P –Akt (ser473)

a

CP

EA

+SA

CP

EA

+SJ

CP

EJ+SA

CP

EJ+SJ

CP

EA

+SJ+W

b

b

n=5, P<0.05

CPEA + + - - +

CPEJ - - + + -

SA + - + - -

SJ - + - + +

W - - - - +

Con

cent

rati

on e

n ni

trit

e(µ

mol

/L)

n=5, P<0.01

n=5, P<0.01

production de NO

CP

EA

+SA

CP

EA

+SJ

CP

EJ+SA

CP

EJ+SJ

CP

EA

+SJ+W

n=4, P<0.01

n=4, P<0.01 n=4, P<0.01

n=4, P<0.05

n=4, P<0.05

n=4, P<0.01

C

aActivité eNOS

n=5, P<0.01

n=5, P<0.05

n=5, P<0.01

rati

o15N

-nit

rite

/14N

-nit

rite



analyse histologique. La Figure 5B pr�esente un

exemple repr�esentatif de formation neointimale

hautement reproductible au sein d’une art�ere l�es�ee

en comparaison �a une art�ere carotide non alt�er�ee

(Fig. 5A). La transplantation de CPEs �etait r�ealis�ee

sur les mod�eles l�es�es.

Comme pr�esent�e au niveau de la Figure 5C, le

nombre de CPEs transplant�ees dans la circulation

p�eriph�erique �etait dynamique apr�es transplanta-

tion. La concentration de cellules Dil-ac-LDL-posi-

tives dans le sang p�eriph�erique augmentait

grandement meme 1 heure apr�es la tranplantation

dans tous les groupes; les valeurs maximales appa-

raissaient apr�es 3 heures (CPEA + RA 471,5 ± 21,4,

CPEA + RJ 501,7 ± 41,3, CPEJ + RA 579,4 ± 43,6, et

CPEJ + RJ 581,5 ± 37,2; n¼ 10), restaient �a des

niveaux �elev�es jusqu’�a une journ�ee apr�es trans-

plantation, et diminuaient par la suite. Aucune

modification significative n’�etait retrouv�ee concer-

nant les valeurs maximales de CPEAs transplant�ees

entre les groupes jeunes et ag�es (jeunes vs. ag�es

501,7 ± 41,3 vs. 471,5 ± 21,4, n¼ 10; p> 0,8) ainsi

que des CPEJs transplant�ees entre les groupes jeu-

nes et ag�es (jeunes vs. ag�es 581,5 ± 37,2 vs.

579,4 ± 43,6, n¼ 10; p> 0,7; Fig. 5D).

Une analyse histologique �etait r�ealis�ee dans les

groupes de CPEs DAPI-marqu�ees transplant�ees.

Les r�esultats d�emontraient qu’une fluorescence

non sp�ecifique pouvait etre retrouv�ee dans les grou-

pes de CPEs transplant�ees ainsi que dans les groupes

t�emoins; cependant, aucune CPE DAPI-positive

n’�etait retrouv�ee sur la face luminale du groupe

t�emoin (Fig. 5E-G). Dans le groupe des CPEs

DAPI-marqu�ees transplant�ees, les cellules ayant

une coloration doublement positive pour la DAPI et

la vWF pouvaient etre retrouv�ees (Fig. 5H-J),

sugg�erant que les CPEs transplant�ees �etaient

recrut�ees au niveau des sites l�es�es et avaient des

ph�enotypes endoth�eliaux.

La quantification des CPEs DAPI-color�ees (Fig. 6)

au niveau du site l�es�e d�emontrait que les ratios du

nombre de CPEAs transplant�ees ainsi que la cir-

conf�erence luminale chez les rats ag�es diminuait

significativement en comparaison au groupe de rats

jeunes (3,2 ± 1,1 vs. 8,2 ± 0,8; p< 0,01). Cet effet

pourrait etre �egalement diminu�e par la wortmannine

(6,5 ± 1,2; p< 0,05). Lorsque des CPEJs �etaient

Fig. 4. Les s�erums jeunes et ag�es r�egulent l’activit�e du

PI3-K, de l’Akt, et du eNOS ou l’expression des prot�eines

dans les CPEs. A Les effets du s�erum sur l’activit�e du PI3-

K dans les CPEs, n¼ 6. B Voici une image repr�esentative

d’un Western blot de l’expression d’Akt1 total (62 kDa)

et d’Akt1 phosphoryl�e (Ser 473, 70 kDa). Les r�esultats

�etaient r�ep�et�es quatre fois (a). Analyse par histogramme

transplant�ees chez des rats ag�es, les ratios dimi-

nuaient significativement en comparaison au groupe

jeune (8,4 ± 1,8 vs. 11,6 ± 2,4; p< 0,05).

DISCUSSION

La transplantation de CPEs en temps que strat�egie

th�erapeutique dans le traitement des maladies vas-

culaires a �et�e envisag�e d�es leur d�ecouverte.32,33

Cependant, la facult�e des CPEs �a prendre part �a la

r�eparation endoth�eliale ou au remodelage vascu-

laire apr�es transplantation est r�egul�e par de nom-

breux facteurs. L’age est un des plus important

facteurs de r�egulation de l’activit�e des CPEs,

influencant directement les r�esultats des CPEs dans

leurs diverses applications th�erapeutiques.3,6,34 Les

CPEAs ont un potentiel significativement diminu�ede prolif�eration, migration et d�edoublement en

comparaison aux CPEJs. La transfusion de CPEJs

chez les rats ag�es am�eliorait d’avantage la fonction

angiog�enique du myocarde l�es�e par rapport �a la

transfusion de CPEAs.6 L’age peut avoir un impact

direct sur les CPEs comme cons�equence d’une

activit�e majeure.3,5 Inversement, l’age affecte indi-

rectement les cellules souches en agissant sur leur

milieu, ce qui conduit �a une modification des profils

des facteurs de croissance angiog�eniques et �a l’aug-

mentation des substances toxiques au sein du

microenvironnement. Ces deux effets conduisent �aune alt�eration de la r�eponse vasculaire des CPEs aux

facteurs de croissance endoth�eliaux et �a un potentiel

diminu�e des CPEs concernant la r�eg�en�eration

endoth�eliale.35,36

Meme si les cellules souches/prog�enitrices des

tissus et individus ag�es ont une activit�e diminu�ee

pouvant conduire �a l’�echec de la r�eg�en�eration tissu-

laire, l’activation de ces cellules peut etre restaur�ee

par un environnement adapt�e.1 Le d�eclin du

potentiel r�eg�en�erateur d’un tissu est par extension

du aux modifications li�ees �a l’age des cellules sou-

ches sp�ecifiques de chaque tissu.8 Cependant,

Carlson et al.7 d�emontr�erent que le muscle ag�e se

r�eg�en�erait avec succ�es lorsqu’il �etait implant�e chez

un hote jeune; l’exposition au s�erum jeune de cel-

lules satellites d�eriv�ees de rats ag�es conduisait �afavoriser l’expression du ligand Notch (Delta) et

(b) de l’Akt1 total et de l’Akt1 phosphoryl�e. C Effets des

s�erums jeunes et ag�es sur l’activit�e eNOS (a) et sur la

production de NO (b) dans les CPEs, n¼ 5. Les donn�ees

sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS. Un

p< 0,05 �etait consid�er�e comme significatif dans toutes les

exp�erimentations.

CPEA

CPEA+RA

CPEJ+RACPEJ+RA

CPEA+RJ

+ + - -

CPEJ - - + +

RA + - + -

RJ - + - +

A B

DAPI RevêtementvWF

DAPI vWF Revêtement** *

E

IH J

GF

Groupe témoin (E)

CPEs DAPI marquées au sein desartères carotides lésées de rats (H)

Coloration vWF correspondante (F) de (E)

Coloration vWFcorrespondante (I) de (H)

Revêtement (G) de (E)et (F)

Revêtement (J) de (H)et (I)

n=10, P>0.8

n=10, P>0. 7

C D

Com

pte

de C

PE

tr

ansp

lant

ées

/uL

de

sang

Com

pte

de C

PE

tr

ansp

lant

ées

/uL

de

sang

Délais post-transplantation (n=10)



augmentait la prolif�eration,8 sugg�erant que la

capacit�e intrins�eque de r�eg�en�eration des cellules

souches restait probablement largement intacte,

meme lorsque ces derni�eres sont ag�ees; l’activit�e des

cellules souches/prog�enitrices apr�es transplantation

pourrait etre modul�ee par des facteurs syst�emiques

d�ependant de l’age de l’environnement dans lequel

ces cellules �evoluent.

Dans la pr�esente �etude, nous avons d�emontr�e que

le s�erum jeune favorisait significativement l’activit�efonctionnelle des CPEAs en comparaison au s�erum

ag�e; au contraire, le s�erum ag�e inhiberait l’activit�edes CPEJs, sugg�erant que l’age de l’environnement

pourrait moduler les processus physiologiques inter-

venant au niveau des CPEs apr�es transplantation.

Une �etude in vivo chez le rat d�emontrait que l’envi-

ronnement jeune pouvait promouvoir la participa-

tion des CPEAs �a la r�eendoth�elialisation de la paroi

vasculaire l�es�ee en comparaison �a un environnement

ag�e. Inversement, l’environnement ag�e diminuait la

capacit�e de r�eparation de l’endoth�elium des CPEJs

transplant�ees.

De nombreuses voies de signalisation comme

Wnt, raf-ERK (kinase li�ee au signal extracellulaire,

extracellular signalerelated kinase) et Notch, sont

connues pour etre responsables de l’activit�e cellu-

laire.37 Le PI3-K est largement exprim�e et joue un

role crucial sur les r�eponses biologiques cellulaires

dont la survie cellulaire et la prolif�eration. Le PI3-K

catalyse la conversion du phosphatidylinositol-3,4-

bisphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol-3,4,5-

trisphosphate (PIP3). Le PIP3 sert �a recruter des

prot�eines contenant un domaine homologue �a la

Fig. 5. Effets des environnements jeunes (2 mois) et ag�es

(20 mois) sur la participation des CPEs �a la

r�eendothelisation des parois vasculaires endommag�ees

apr�es transplantation. A Art�ere carotide non

endommag�ee (intervention t�emoin). B Image

repr�esentative de la formation de n�eointima apr�es colo-

ration �a l’h�ematoxyline et �a l’�eosine ( fl�eche) 12 jours

apr�es l�esion des CEs. Formation de n�eointima chez 20

rats jeunes et ag�es non s�electionn�es �etait r�ep�et�e,

d�emontrant une formation de n�eointima hautement

reproductible. La transplantation de CPEs Dil-ac-LDL-

marqu�ees �etait utilis�ee pour identifier les concentrations

de CPEs transplant�ees dans le sang des mod�eles l�es�es. Les

valeurs maximales des concentrations de CPEs trans-

plant�ees dans le sang p�eriph�erique apparaissaient 3

heures apr�es, restaient �a des niveaux �elev�es jusqu’au

premier jour post-transplantation, et diminuaient par la

suite (n¼ 10) (C). Aucun changement significatif n’�etait

retrouv�e entre les valeurs maximales des CPEAs trans-

plant�ees dans les groupes ag�es et jeunes (n¼ 10, p> 0,8)

ou des CPEJs transplant�ees dans les groupes ag�es et

jeunes 3 heures apr�es la transplantation (n¼ 10, p> 0,7)

pleckstrine (pleckstrin homology, PH) comme l’Akt�a la membrane plasmatique. L’Akt, aussi connue

sous le nom de prot�eine kinase B, peut etre activ�ee

par un certain nombre de facteurs de croissance

selon un processus PI3-K-d�ependant et sert comme

r�egulateur multifonctionnel de la biologie cellulaire.

La voie de r�egulation P-I3-K/Akt joue un role

important dans la r�egulation de la migration des

CPEs, la prolif�eration et la diff�erentation.9,38 Dans

l’�etude actuelle, nous avons trouv�e que le s�erum

jeune pouvait augmenter significativement

l’activit�e de PI3-K dans les CPEAs et que le s�erum

ag�e diminuait notablement l’activit�e PI3-K dans les

CPEJs. Une tendance similaire �etait �egalement

confirm�ee sur Akt et sur la phosphorylation d’Akt.

Le NO peut etre s�ecr�et�e par les CPEs, qui �a son tour

joue un role important dans l’activit�e des CPEs. Il

peut r�eguler la r�eparation endoth�eliale et le

d�eveloppement vasculaire via la r�egulation de la

mobilisation des CPEs et la prolif�eration par l’acti-

vation de la voie de signalisation PI3-K/Akt.39 Nos

r�esultats d�emontrent que l’activit�e eNOS ainsi que la

s�ecr�etion de NO par les CPEAs pourraient etre

significativement augment�ees par l’adjonction de

s�erum jeune, mais �egalement inhib�ee par du s�erum

ag�e provenant de CPEJs. Les effets induits par un

environnement jeune sur les CPEAs pourraient etre

partiellement att�enu�es par la wortmannine, un

inhibiteur du PI3-K, sugg�erant que la voie PI3-K/

Akt �etait impliqu�ee dans les effets de l’environne-

ment ag�e sur les CPEs. Cependant, alors que les

effets de l’environnement jeune sur les CPEAs

pourraient ne pas etre compl�etement abolis par la

(D). Dans les groupes de CPEs transplant�ees DAPI-mar-

qu�ees, 10 jours apr�es transplantation, les vaisseaux

�etaient pr�elev�es et analys�es. Une fluorescence non

sp�ecifique (auto-fluorescence) pouvait etre trouv�ee dans

les groupes t�emoins et dans les groupes de transplanta-

tion de CPE; cependant, aucune cellule DAPI-positive

n’�etait retrouv�ee sur la face luminale du groupe t�emoin

(E-G). Dans le groupe ayant eu une transplantation de

CPEs, des cellules doublement positives pour les colora-

tions DAPI et vWF pouvaient etre retrouv�ees, sugg�erant

que les CPEs transplant�ees �etaient recrut�ees aux

sites l�es�es et avaient des ph�enotypes endoth�eliaux (H-J).

* Une CE que ne d�emontrait pas de fluorescence bleue et

ne pouvait donc etre d�eriv�ee des CPEs transplant�ees. Les

donn�ees sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS.

Un p< 0,05 �etait consid�er�e significatif. AR, rat ag�e; YR,

rat jeune; CPEA + RA, CPEs d�eriv�ees de rats ag�es trans-

plant�ees chez d’autres rats ag�es; CPEA + RJ, CPEs

d�eriv�ees de rats ag�es transplant�ees chez des rats jeunes;

CPEJ + RA, CPEs d�eriv�ees de rat�es jeunes transplant�ees

chez des rats ag�es; CPEJ + RJ, CPEs d�eriv�ees de rats jeu-

nes transplant�ees chez d’autres rats jeunes.

Fig. 6. Analyse de la colonisation des sites vasculaires

l�es�es par les CPEs. Les ratios du nombre de cellules

transplant�ees positives pour la coloration du DAPI sur la

face luminale des sites l�es�es ainsi que la circonf�erence

luminale des tranches de section �etaient calcul�es.

L’histogramme r�esume les statistiques concernant les

CPEs positives pour la coloration du DAPI. Les donn�ees

sont exprim�ees sous la forme de moyenne ± DS, n¼ 5.

Un p< 0,05 �etait consid�er�e significatif.


wortmannine et les substances de l’environnement

li�ees �a l’age, la voie PI3-K/Akt n’est certainement

pas l’unique responsable de ces effets. Le role pr�ecis

des autres voies devrait etre explor�e dans de futures

exp�erimentations.

Les r�esultats retrouv�es indiquent que des facteurs

syst�emiques pr�esents dans l’environnement ag�epeuvent largement moduler la voie de signalisation

mol�eculaire critique de l’activit�e des CPEs. Egale-

ment, l’environnement jeune favoriserait la

r�eendoth�elialisation par les CPEs en comparaison �aun environnement ag�e. De r�ecentes �etudes

d�emontr�erent que certains facteurs comme le

VEGF, l’IGF-I,40 et les estrogenes,20 pouvaient

am�eliorer l’activit�e des CPEs chez des individus

jeunes ou ag�es. Il a �et�e constat�e que les niveaux de

ces facteurs dans la circulation p�eriph�erique dimi-

nuaient avec le vieillissement.40-42 A l’inverse, le

niveau circulant des produits terminaux de la gly-

cosylation (PTGs) augmente avec le vieillissement,

et il a �et�e constat�e que les PTGs induisent un dys-

fonctionnement des CPEs.43 Certains autres fac-

teurs, comme le TNF-a, l’interleukine-1b et

l’interf�eron-g, se modifient �egalement avec le

vieillissement;44 mais les roles de la plupart de ces

facteurs sur l’activit�e des CPEs reste inconnu. Des

�etudes futures devraient etre r�ealis�ees pour identi-

fier les facteurs du vieillissement ayant une

influence critique sur les CPEs et explorer les

m�ecanismes correspondants. Notre �etude sous-tend

que les CPEAs conservent une partie de leur

potentiel intrins�eque, mais qu’un environnement

syst�emique ag�e les empeche d’atteindre leur pleine

activation. Les r�esultats de cette �etude ouvrent de

nouvelles perspectives sur la compr�ehension de la

r�eparation endoth�eliale par les CPEs.

Cette �etude a �et�e soutenue par des bourses de la Fondation

Nationale Chinoise pour les Sciences Naturelles (30470729 et

30700889), le Onzi�eme Plan Militaire (06J013), le Plan

National pour le d�eveloppement de Nouvelles Technologies

(2006AA020902) et la Fondation pour la Recherche

Postdoctorale en Sciences Naturelles, Hopital Xinqiao,

Troisi�eme Universit�e M�edicale Militaire (2005A0132). Nous

remercions le Dr. Huali Kang pour ses conseils techniques.

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