Eric DANNAOUI
Unité de Parasitologie-Mycologie, Laboratoire de microbiologie, HEGPEUCAST AFST (yeasts and moulds) network laboratories
Mycologie : antifongigramme , méthodes et interprétation
Introduction
� Recherche: Screening de nouvelles moléculesDétermination du spectre d’un nouvel ATFAssociation d’ATF
� Epidémiologie:Surveillance des résistances
� Clinique: Prédiction de l’efficacité thérapeutiqueAdaptation du traitement
Pourquoi tester la sensibilité des champignons aux antifongiques ?
Augmentation des besoins
� Augmentation de l’incidence des infections fongiques
� Pathogènes émergents et augmentation des résistances
� Nouveaux ATF commercialisés et en développement
Augmentation des besoins
� Augmentation de l’incidence des infections fongiques
� Pathogènes émergents et augmentation des résistances
� Nouveaux ATF commercialisés et en développement
La résistance clinique est multifactorielle
Ne pas confondre résistance clinique et résistance microbiologique
PatientStatut immunitaireSite de l’infectionMatériel étrangerMauvaise observance
ChampignonRésistance microbiologiqueProduction de biofilmTaille de « l’inoculum »
Échec thérapeutique
AntifongiqueNature fungistatiquePosologiePharmacocinétiqueInteractions médicamenteuses
Des CMI aux « Breakpoints » cliniques: trois étapes
Détermination des CMI: aspects techniques (EUCAST, CLSI)
Détermination des populations sauvages pour chaque espèce (ECOFFs/ECVs)
Détermination des seuils cliniques de sensibilité (CBs)
CMI
CB
ECOFF
S I R
Les techniques: les grands principes, les méthodes
disponibles
Il faut une technique
1. Reproductible, intra-lab et inter-lab
2. Capable de distinguer entre CMI basses et CMI hautespour un ATF et une espèce donnée
3. CMI hautes liées à échec clinique � définition des seuils
Les techniques in vitro : les besoins
No.
of i
sola
tes
Concentration (µg/ml)
Distribution of 5FC MICs for 69 Candidatropicalis recovered from blood cultures – EUCAST method
0
10
20
30
40
0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
No.
of i
sola
tes
Concentration (µg/ml)Concentration (µg/ml)
Distribution of 5FC MICs for 69 Candidatropicalis recovered from blood cultures – EUCAST method
Techniques disponibles : CLSI, EUCAST, Etest, autres
Les techniques in vitro
Technique Principe Avantages Inconvénients
CLSI -EUCAST
Microdilutionliquide
Méthode de Référence
Non commercialiséeLourd, CQ ++
CLSI Diffusion en gélose (disques)
Méthode de Référence
Pas de CMI
Sensititre Yeast one
Microdilutionliquide colorimétrique
StandardiséeCommercialisée
Kit
Etest Diffusion en gélose
CommercialiséeSimple, Validée
Chère
Autres Variable Certaines commercialisées
Peu validées
Dilution en milieu liquide - microméthode : CLSI, EUCASTConcentration (mg/l)
Ant
ifong
ique
5FC
FCZ
PSZ
AMB
TER
ITZ
VRZ
CAS
128 64 8 0.25432 16 00.512 0.12
CMI
16 8 1 0.030.54 2 00.060.120.25 0.015
CMI
CMI
CMI
CMI
CMI
CMI
Nombreux paramètres�Milieu�Taille inoculum�Critère de CMI
�Temps d’incubation�Méthode de lecture
5FC : > 128 µg/ml
FCZ : 4 µg/ml
ITZ : 0.12 µg/ml
VRZ : 0.06 µg/ml
PSZ : 0.06 µg/ml
TER : 0.25 µg/ml
AMB : 0.5 µg/ml
CAS : 0.12 µg/ml
Les techniques in vitro
8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,015 TPTN
Concentration d’antifongique (µg/ml)
Inhibition partielleEx : Candida / Azolés, 5FC
Inhibition complèteEx : Candida / AMB, CAS
Inhibition complète : CMI : >8 µg/mlInhibition partielle : CMI : 0.06 µg/ml
Importance majeure du critère de définition de la CMI
Dilution en milieu liquide : microméthode
Paramètre CLSI - 2008(M27-A3)
EUCAST - 2011(E.Def 7.2)
Format Microdilution Microdilution
Milieu de culture RPMI + MOPS, pH 7.0 RPMI + MOPS + 2% glucose, pH 7.0
Inoculum final 0,5 à 2,5 x103 UFC /ml 0.5 to 2.5x105 UFC /ml
Incubation 48h (24h échino, +/-AMB, FCZ)
24h
Lecture Visuelle Spectrophotométrique
Détermination des CMI
Azolés, 5FC, et échino 50% d’inhibition 50% d’inhibition
AMB 100% d’inhibition 90% d’inhibition
Candida spp.Standardisation des techniques
A noter : convergence des techniques
� La technique du Etest� Commercialisée� Standardisée� Simple d’utilisation� Bien adaptée au laboratoire de routine� Plus performante dans certains cas (AMB et Candida)
Les alternatives
� Mais…� Coûteuse� Parfois difficile à lire� Moins performante dans certains cas (5FC et Crypto)
L’obtention d’une CMI:les particularités de lecture en
fonction des antifongiques
Antifongiques : activité
Inhibition complète
CMI
CMI
Activité des antifongiques : AMB
Trailing effect – méthodes en dilution liquide
� Azolés – trailing : pousse résiduelle normale avec les azolés
� Présent pour les levures� Parfois très marqué, certaines souches de C. albicans
et C. tropicalis� Absent avec les filamenteux � Ne dépends pas de la technique
Exemple : Posaconazole - EUCAST
C. albicans
A. fumigatus
Antifongiques : activité
Activité des antifongiques : Azolés
A. fumigatus
CMI
CMI
C. albicans
� Azolés – trailing / Etest
POSMicrocolonies
CMI 0.012 µg/ml
ITZMicrocolonies
CMI 0.19 µg/ml
FCZMicrocoloniesCMI 0.5 µg/ml
FCZMacrocolonies
CMI >256 µg/ml
� Azolés – trailing : n’existe pas pour les filamenteux
Trailing effect – méthodes en gélose
Echinocandines : EUCAST / CLSI, Etest
Antifongiques : activité
Inhibition complète (lecture 50%)
CMI
CMI
Filamenteux – Caspofungine � MEC / CLSI - EUCAST
Aspergillus fumigatus
MEC : concentration
minimale effective
Kurtz et al., AAC 38:1480, 1994
Techniques standardisées : les problèmes
Echinocandines : EUCAST, Etest
Antifongiques : activité
Inhibition partielle
CMI
CMI
Filamenteux – Caspofungine � MIC / Etest
Aspergillus fumigatus
Techniques standardisées : les problèmes
Pousse résiduelle dans la zone d’inhibition
CMI
Cryptococcus neoformans – 5FC - Etest
Amphotericin B susceptibility testing
L’obtention d’une CMI:Des cas très particuliers
Cryptococcus neoformans – 5FC -Etest
94 souches d’origine clinique
Techniques standardisées : les problèmes
0
5
10
15
20
25
30
35
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CLSIEtest
0
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30
40
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60
70
80
90
0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
RPMI – pH 7.0CMI > 32 µg/ml
Détermination et analyse des distributions de CMI
EUCAST definitions of wild-type MIC distribution andepidemiological cut-off Values (ECOFFs)
wild type (WT)
� A micro-organism is defined as wild type (WT) for a species by theabsence of acquired and mutational resistance mechanisms to the drugin question
� A micro-organism is categorized as wild type (WT) for a species byapplying the appropriate cutoff value in a defined phenotypic testsystem.
� Wild type micro-organisms may or may not respond clinically toantimicrobial treatment
The wild type is presented as WT<z mg/L and non-wild type as NWT >z mg/L
EUCAST wild-type (WT) MIC distribution and epidemiologica l cut-offValues (ECOFFs)
Turnidge et al. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 418–425Turnidge et al. CMR 2007; 20: 391–408
1. Construction de la distribution des CMI� Spécifique d’espèce� Doit inclure toutes les valeurs de CMI de la distribution (pas de troncature aux extrémités)
1. Construction de la distribution des CMI� Spécifique d’espèce� Doit inclure toutes les valeurs de CMI de la distribution (pas de troncature aux extrémités)
2. Méthode de détermination des ECOFFs� Simple estimation par inspection visuelle� Analyse statistique (surtout utile si superposition entre distribution WT et souches anormales)
2. Méthode de détermination des ECOFFs� Simple estimation par inspection visuelle� Analyse statistique (surtout utile si superposition entre distribution WT et souches anormales)
EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs)
C. albicans/ fluconazole
http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/
Epidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l
3756 observations (12 data sources)
ECOFF
EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs)
C. glabrata/ fluconazole
http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/
Epidemiological cut-off: WT ≤ 32 mg/l
898 observations (12 data sources)
ECOFF
CLSI wild-type MIC distribution and epidemiological cut-o ff Values (ECVs)
Adapted from Espinel-Ingroff et al., JCM 2010, 48, 325 1
ITZ PSZ
VRZ
A. fumigatus / azolesECV
ECV ECV
Principales caractéristiques des ECOFFs
� Déterminables pour toutes les espèces
� Pas de variation dans le temps
� Utiles pour la surveillance épidémiologique
� Sensibles pour la détection de résistance
� Non WT peut répondre ou non au traitement
� Utilisables si pas de CBs disponibles
� Déterminables pour toutes les espèces
� Pas de variation dans le temps
� Utiles pour la surveillance épidémiologique
� Sensibles pour la détection de résistance
� Non WT peut répondre ou non au traitement
� Utilisables si pas de CBs disponibles
L’interprétation d’une CMIDéfinition des seuils cliniques
(breakpoints )
EUCAST definitions of clinical breakpoints
Clinical resistance and clinical breakpoints
Clinically Susceptible (S)
� A micro-organism is defined as susceptible by a level of antimicrobial activity associated with a high likelihood of therapeutic success
� A micro-organism is categorized as susceptible (S) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic test system
� This breakpoint may be altered with legitimate changes in circumstances
Clinical breakpoints are presented as S<x mg/L; I>x , <y mg/L; R>y mg/L
EUCAST wild-type MIC distribution and epidemiological cut -off Values(ECOFFs) – Determination of CBs
C. albicans/ fluconazole
Adapted from G. KahlmeterEpidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l 3756 observations (12 data sources)
WT
Résistance génotypique détectable
Résistance phénotypique détectable
Echec thérapeutique?
Echec thérapeutique?
Echec thérapeutique?
Echec thérapeutique?ECOFF
Études des corrélations in vitro / in vivo
Stratégie de détermination des seuils: problème complexe – Intégration de nombreux paramètr es
� Données historiques� Pharmacocinétique des ATF� Distribution des CMI� Mécanismes moléculaires de résistance� Modèles expérimentaux chez l’animal� Données cliniques
http://www.escmid.org
http://www.eucast.org/
Relevant factors in setting breakpoints for new ant imicrobials and assessment of data:
EUCAST Procedure for Harmonising andDefining Breakpoints
Dosing, formulations (oral, iv), indications and practices, target
organisms
MIC distributions
and ECOFFs
determined
Dose-effect relationships in vitro studies,
animal studies and humans (PK/PD data) evaluated
Modellingprocesses,
Monte Carlo
simulation
Clinical data relating
outcome to MIC-values
National CBs
compared and
discussed
Consensus breakpoints are sought
CBs tested against target species MIC
distributions.
CBs should not divide the WT distributions
No CBs if species a poor target for the
drug ( “-”) or insufficient evidence that the species is a good target for the
drug (IE)
Principales caractéristiques des ClinicalBreakpoints (CBs)
� Destinés à prédire l’efficacité clinique
� Non déterminés pour toutes les espèces
� Pas de relation formelle entre CBs et ECOFFs
� Evolution possible au cours du temps
� Destinés à prédire l’efficacité clinique
� Non déterminés pour toutes les espèces
� Pas de relation formelle entre CBs et ECOFFs
� Evolution possible au cours du temps
CLSI wild-type MIC distribution and epidemiological cut-o ff Values (ECVs)– Determination of CBs
C. albicans/ fluconazole
http://www.eucast.org/mic_distributions_of_wild_typ e_microorganisms/
Epidemiological cut-off: WT ≤ 1 mg/l
7851 observations (12 data sources)
ECV
S I R Anciens CLSI CBs
S I R Nouveaux CLSI CBs
Garcia-Effron et al. AAC 2009;53 :3690
Candida glabrata
Antifungals: MIC - CBs
Revision of CLSI Clinical BreakpointsAntifungal Susceptible SDD/Interm Resistant
Echinocandins ≤ 2 ND ND
WT
Mutant
Definition of CBs for Candida spp. (µg/ml)
1. CLSI M27-A3, 2008 2. Pfaller et al. JCM 2006;44 :819-263. Pfaller et al. JCM 2008;46 :2620-29
Revision of CLSI Clinical Breakpoints 1-6
Antifungals: MIC - CBs
4. Pfaller et al. ICAAC 2010, M-3695. Pfaller et al. Drug resist Updat 2011,14, 164-1766. CLSI M27-S4, 2013
Antifungal Susceptible SDD/Interm Resistant
Echinocandins ≤ 2 ND ND
Species Caspo Mica Anidula
C. albicansC. tropicalisC. krusei
S ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.25
I 0.5 0.5 0.5
R ≥ 1 ≥ 1 ≥ 1For C. glabrata: S£ 0.12, I 0,25, R ³ 0.5 for caspo and anidula and S£ 0.06, I 0,125, R ³ 0.25 for micafungin
Antifungals : MIC - BPs
Candida spp.EUCAST Antifungal Clinical Breakpoint Table v. 8.0
valid from 2015-11-16
http://www.eucast.org
Antifungals : MIC - BPs
http://www.eucast.org
Aspergillus spp.EUCAST Antifungal Clinical Breakpoint Table v. 8.0
valid from 2015-11-16
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