Download - Mécanismes cellulaires de la synergie d'action de polluants atmosphériques (Fe203 ET HPA) dans l'apparition du cancer broncho-pulmonaire

M iCAN I S S CELLULAIRES DE LA SYNERGIE D’ACTIO DE POLl_IJANTS ATMOSPHERIQUES (Fe,03 ET HPA) DANS WPPARITION DU CANCER BRONCHO-PULMONAIRE

Guillaume Garcon a, Pierre Gosset b, Benoit Maunit cq Anne Casset d, Marie-Helene Hannothiaux e,

Jean-FranCois Mtiller c, Pirouz Shirali +*

R6sumt3

Aujourd’hui, la notion de faibles doses, d’une part, et la multiplicite

des polluants ernis en milieu industriel ou environnemental, d’autre

part, compliquent I’identification des facteurs de risques neces-

saire A une meilleure prevention.

En outre, lors de tel es expositions, il est important de considerer

I’existence potentielie de phenomenes de toxicite additive voire

synergique. Cetablissement de presomptions sur le rapport de cau-

salite entre expositions multiples et pathologies requiert I’instaura-

tion d’approches a la fois complementaires et pluridisciplinaires,

integrant notammert des competences en epidemiologic et en

experimentation.

A I’aide de I’exemple de la co-exposition aux oxydes de fer et aux

hydrocarbures polycycliques aromatiques, observee en milieu pro-

fessionnel et en emironnement general, cet article se propose de

presenter la dernarche scientifique appliquee en vue d’elucider les

mecanismes physiopathologiques sous-jacents potentiellement

impliques dans la toxic& additive, voire synergique, de cette expo-

sition concomitante,

Co-exposition - oxydes defer - hydrocarbures aromatiques polycycliques - m&anismes d’action toxique.

a Laboratoire de recherche en toxicologic industrielle et environnementale Universite du Littoral-Ctrte d’Cpale 220; av. de I’UniversitP - B.P. 5526 593’79 Dunkerque ceclex 1

b Laboratoire d’anatomre et de cytologic pathologiques du Groupement hospraier de i’lnstitut catholique de Lille Faculte libre de medecine 56, rue du Port 59046 Like cede:<

c LMSCLJPM Universrte de Mets 1, bd Arago 57078 Metz cedex 3

d Unite lnserm 425 Neuroimmuno-pharmacologic pulmonaire Hopital Lyautey 1, we des Canonniers 67100 Strasbourg

e Laooratoire de toxico!ogie, sante publique et environnement Faculte des sciences oharmaceutiques et biologiques 3, rue du Profess~sur-L.aguesse - 5.P. 83 59006 Lille cedex

* Correspondanoe. E-mail : [email protected]

article requ le 16 octobre, accept6 le 20 dkembre 2002.

0 Elsevier. Paris

Revue Fran&e des Laboraims janvw 2003, N” 349

Summary

Air pollutants arising from traffic clustering and industrial produc-

tion include a great number of chemical compounds that at high

doses play major roles in causing many forms of respiratory

disease in animal models and in some instances also in humans.

However, occupational and environmental exposures are generally

to low doses of complex mixtures of pollutants. Direct epidemiolo-

gical evidences for adverse effects of air pollution in humans is,

also, weak, and most of the available studies are limited by lack of

adequate control of confounding factors and other methodological

drawbacks. Moreover, it is now important to consider the potential

occurrence of an addition and even a synergy between the

adverse effects induced by a concurrent exposure. Perspectives

and approaches to a better knowledge of the involved risk factors

may include not only epidemiologic studies, to evaluate patterns of

health and disease in groups of persons, but also experiments to

elucidate the underlying mechanisms by which pollutants induce

an additive and even a synergistic toxicity.

Giving the example of the occupational and/or environmental expo-

sure to iron oxides and polycyclic aromatic hydrocarbons, this

article describes such a scientific approach.

Concurrent exposure - hematite - benzo(a)pyrene - mecha- nism of adverse effect.

L es enquetes epidemiologiques realisees depuis le debut des annees 1950 ont permis d’etablir le caractere cancerogene pour

I’homme de certaines expositions professionnelles ou environnementales [53]. En effet, la dramatique croissance de la mortalite par cancers broncho-pulmonaires (CBP), obsetvee en Europe et aux Etats- Unis, est consideree comme l’une des consequences primaires de I’ac- croissement de la pollution anthropique de I’atmosphere [151. La pro- portion de de&s par CBP d’origine industrielle ou environnementale est estimee entre 3 et 17 o/, aux Stats-Unis et entre 4 et 8 O/o en Europe 1351. En France, la part de de&s par cancers lies a des expositions professionnelles ou environnementales est estimee a plus de 7 % du nombre de de&s par cancers, toutes causes confondues [30]. Parmi ces expositions, les activites professionnelles ayant trait a I’extraction et a la transformation des minerais de fer ont ete mentionnees.

Des etudes epidemiologiques ont ete menees afin d’identifier ies facteurs de risque impliques dans la prevalence accrue de de&s par CBP chez les mineurs des mines de fer [51]. Ces enquetes, de cohortes pour la plupart, effect&es sur des mines anglaises 18, 17,341, russes [29], suedoises [16, 27, 31, 461, italiennes [5] ou fran?aises 14, 10, 39, 43, 44, 45, 491 montrent des rkques relatifs standardises eieves. Les facteurs de risque identifies etaient : le tabac, le radon, la silice, les oxydes de fer et les fumees de moteurs de type diesel.

59

Qua/ii@ de Pair et sant6

Radford et al. ont montre que le risque relatif standardise de de&s par CBP est de 10 pour un mineur fumeur et de 3,9 pour un non- fumeur, et que le delai moyen d’apparition des tumeurs est plus court chez les fumeurs [46]. Le tabagisme est done un des facteurs etio- logiques majeurs impliques dans I’incidence elevee de CBP KY, 8, 10, 16, 31, 34, 44, 45, 461.

Un autre facteur frequemment cite est la presence de radon et de ses produits de d&integration, patfois associes aux minerais de fer [5, 8, 16, 27, 34, 461. Le radon et ses derives emettent des radiations ioni- santes dont I’effet cancerogene est bien connu. Si les taux de radon sont eleves dans certaines mines, ce facteur est present a des doses faibles, inferieures aux valeurs d’exposition autorisees, dans d’autres gisements, tels que ceux de Lorraine. Le radon et ses derives semblent done pouvoir etre exclus de la liste des cancerogenes poten- tiels dans ces sites industriels [441.

La silice cristalline est presentee dans cet-taines etudes comme un des facteurs de risque de CBP [5, 7, 34, 461. Elle constitue une impurete du minerai de fer dont la teneur est variable d’un site d’extraction a I’autre. Contrairement a la silice amorphe, la silice cristalline est res- ponsable de siiicose et de tuberculosilicose, des pathologies asso- ciees a un risque accru de CBP. Toutefois, la silice cristalline ne peut etre suspectee dans les mines de fer de Lorraine 00 sa teneur, infe- rieure a 2,l %, est t&s faible 1441.

L’exposition aux oxydes de fer a aussi ete citee comme un facteur de risque du developpement de CBP chez les mineurs des mines defer 15, 7, 8, 17, 461. Toutefois, dans une revue critique de la litterature, Stokinger et al. et Steenland et al. ont refute cette hypothese, de par I’existence de nombreux biais dans ces differentes etudes [51, 521.

Les moteurs de type diesel utilises pour extraire les minerais de fer sont responsables d’une exposition aux gaz d’echappement. Ces aerosols complexes, emis dans les atmospheres confinees des mines, sont parfois consider& comme un des elements impliques dans I’incidence elevee de CBP observee chez les mineurs de fer [5, 8, 10, 16, 31, 34,44, 45, 461.

II est interessant de comparer les resultats issus de ces etudes a ceux issus d’etudes plus recentes, realisees chez les ouvriers des fonde- ries d’acier et des industries de transformation de la fonte et de I’acier. Dans ces dernieres, la frequence des CBP est augmentee en fonction de la duree d’exposition dans le poste de travail [I, 2, 3, 18, 37, 38,501. Pour expliquer I’incidence elevee de CBP chez ces ouvriers, certains auteurs soulignent non seulement I’impottance du tabagisme, mais aussi la presence de composes mutagenes voire cancerigenes, tels que les hydrocarbures polycycliques aromatiques (HPA), emises lors des procedes industriels.

Les etudes epidemiologiques real&es en milieu professionnel ont incrimine cettains facteurs Btiologiques afin d’expliquer I’incidence elevee de CBP. Au contraire, les enquetes realisees en environnement general temoignent des difficult& a identifier et a quantifier le risque encouru par I’homme expose a un environnement contamine par des melanges souvent tres complexes de polluants, tant du point de vue de leur diversite que de leurs proportions tres variables, generalement inferieures a celles observees en milieu professionnel. Toutefois, ces etudes soulignent I’impottance de certains des facteurs de risque sus- pect&s en milieu professionnel, mais aussi d’autres propres a I’environnement et aux modes de vie. La composition des polluants emis peut varier non seulement en fonction de I’environnement, de I’in- dustrialisation et du trafic automobile, mais aussi en fonction des conditions climatiques et des periodes de production industrielle. De par la complexite des emissions atmospheriques, les etudes epidemiologiques realisees en environnement general ne sont le plus souvent basees que sur la granulometrie des poussieres. Ces enquetes montrent une augmentation de la mot-talite pour des pits de pollutions de poussieres superieurs ou egaux a 50 ,ug/m”. Cette elevation de mor-

60

talite serait de 3 % d’apres Schwartz et de 4,8 O/o selon Ostro [41, 481. Elle serait essentiellement lice a des pathologies respiratoires chro- niques et cardio-vasculaires [20]. Toutefois, meme si la granulometrie

est une caracteristique physique primordiale a considerer, la composition chimique des aerosols ne doit pas Btre ignoree. En effet, la presence de certains xenobiotiques, meme a de tres faibles concen-

trations, adsorb&s sur ces poussieres est une donnee importante d’un

point de vue toxicologique. A titre d’exemple, Garcon et al. ont deja observe I’existence de composes organiques (HPA, COV, etc.) adsor-

bes sur des poussieres inorganiques (Fe, Mn, Al, etc.) collectees dans

une agglomeration sit&e sous les vents dominants d’un complexe industriel comportant des activites siderurgiques, metallurgiques et

petrochimiques [25].

Par ailleurs, de par la multiplicite des contaminants emis en milieu professionnel ou environnemental, il est probable que des phenomenes

de toxicite synergique apparaissent entre les divers facteurs de risque

impliques (oxydes de fer et HPA, par exemple) 110, 39, 44, 451.

Cetablissement de telles presomptions sur le rapport de causalite entre toxiques et pathologies peut etre etudie au moyen d’outils epidsmio-

logiques. Toutefois, I’existence d’un facteur de risque nest jamais facile a demontrer de par I’existence de differences individuelles et de cer-

tains facteurs confondants. Aussi, les etudes experimentales in vitro,

ex vivo et in vivo s’averent-elles souvent necessaires afin de valider les

observations realisees chez I’homme.

Le premier modele experimental d’induction de CBP a ete decrit par

Saffiotti et al. [57]. Le benzo(a)pyrene ou B(a)P, prealablement adsorbe sur I’hematite (Fe,O,), a ete administre par instillations intratracheales rep&es a des hamsters dares Syriens. Ce protocole a permis d’ob-

server des taux eleves de CBP chez ce hamster, pourtant connu pour

ses taux de tumeurs pulmonaires spontanees tres faibles. En outre,

les neoplasies induites etaient du meme type histologique que celles d&rites chez I’homme. Dans une revue critique pot-tant sur 29 etudes

in vivo, Wolterbeek et al. ont mis en doute le role des oxydes de fer

decrit par Saffiotti et al. [57]. lls ont propose un certain nombre de variables susceptibles d’influer sur I’incidence des CBP dans ce

modele animal : (i) la quantite totale de B(a)P instillee, (ii) la granulo-

metric de I’hematite, (iii) la duree d’exposition et (iv) le mode d’ad- sorption du B(a)P sur I’hematite [57].

D’autres etudes, realisees sur le poumon isole et perfuse de lapin albi- nos de Nouvelle-Zelande, ont permis de montrer que des pre-traite-

ments in vivo avec de I’hematite modifiaient le metabolisme pulmonaire

du B(a)P en augmentant ex vivo la production des dihydrodiols responsables de la formation de B(a)P-diol-epoxydes (BPDE), metabo-

lites ultimes hautement cancerogenes 154, 551. De meme, lors de la

co-exposition de cultures primaires de macrophages alveolaires (MA)

de hamsters ou de rats a I’hematite et au B(a)P, Cheu et al. ont observe que les taux de penetration et de retention des particules de B(a)P

dans les MA, I’activation metabolique du B(a)P et la formation d’ad-

duits a I’ADN par certains BPDE etaient etroitement correles avec la quantite d’hematite [I 21.

Considerant la pertinence des resultats de ces recherches in vivo, ex

vivo et in vitro, il s’averait important de considerer I’implication poten-

tielle de I’hematite dans la cancerogenese induite par le B(a)P, non seulement via son role de vecteur physique du B(a)P, mais surtout via son implication dans un certain nombre de mecanismes physiopa-

thologiques. Dans cette optique, des recherches ont ete realisees afin de determiner I’influence potentielle de I’hematite et du B(a)P, seuls

ou en association (Fe,O, + B(a)P), sur la trame pulmonaire du rat

Sprague-Dawley (SD), au travers de plusieurs approches complementaires, a savoir : (i) la balance proteases / anti-proteases, (ii) le stress oxydant, (iii) I’inflammation, (iv) I’activation metabolique du B(a)P

et (v) le cycle cellulaire (proliferation / apoptose) (figure 7).

Revue Franpise des Laboratoires, janvier 2003, N” 349

BAlLANCE STRESS

OXYDES DE PROTEASES / ANTI-PROTEASES OXYDANT

REPONSE CYCLE INFLAMMATOIRE CELLULAIRE

ACTIVATION METABOLIQUE

XP = cancer broncho-pulmonaire.

iPA = hydrocarbure polycyclique aromatique.

.-_-_-..- ._..__.-_-.-

Cakeration de la lbalalce protease/anti-protease pulmonaire est consi- d&r& k la fois comme une adaptation physiologique de l’organisme destinee a maintenir I homeostasie etlou comme un dysfonctionnement

lie au developpemert de certaines pathologies [22]. Des travaux ont montre que, lors de la formation de tumeurs pulmonaires, un desequilibre de cette balance en faveur des proteases etait a I’origine de la degradation de la rnatrice extracellulaire et des membranes basales

sowendotheliales 161.

De plus, dans les po.rmons, les proteases favorisent la croissance de tumeurs primaires, Ia migration des cellules tumorales vers la circu- lation systemique, leurs ancrages dans la membrane basale sous-endo- theliale des capilllaires et la croissance de nodules metastatiques 161. Aussi, une premiere approche s’est-elle interessee a I’effet de I’hematite, du B(a)P ou de lerur association sur la balance proteases/anti-

proteases pulmonakes.

Garqon et al. ont mo-rtre que la balance proteases/anti-proteases etait

alteree en faveur de certaines proteases, telles que les cathepsines B et L et l’elastase des polymorphonucleaires (PMN) dans les poumons des rongeurs exposes a I’hematite, au B(a)P ou a leur association 1221. Leurs observatons ont aussi rev& des diminutions des concen-

trations de I’alpha-1 “antitrypsine (AAT) libre dans les poumons, equi- valentes a I’augmentation de celles de l’elastase PMN, chez les ani- maux exposes a I’hematite, au B(a)P ou a leur association [22]. Leurs

resultats corrobforent ceux de Marchandise et al., qui ont decrit la formation accrue de complexes entre I’elastase PMN et I’AAT chez des

sujets humains atteints de CBP [36].

Par ailleurs, ces auteurs ont egalement souligne une diminution de la capacite inhibitrice de I’AAT dans le tractus respiratoire des rats expo-

Revue Franpise derj Laboraoires, janvier 2003, N” 349

s&s [22]. Or, la litterature decrit la liberation de I’elastase PMN et I’alteration de l’ecran anti-elastasique de I’AAT comme des pheno- m&es-clefs intimement impliques dans la degradation de la matrice

extracellulaire et des membranes basales sous-endotheliales pulmonaires [6, 22,361. Ces travaux ont permis de montrer I’implication

de I’hematite ou du B(a)P, seuls ou en association, dans I’apparition d’un desequilibre pulmonaire de la balance proteases/anti-proteases

en faveur des proteases (figure 2).

Suite a ces resultats, GarGon et al. ont emis I’hypothese que la rup-

ture de I’homeostasie pulmonaire observee chez les rats exposes a

I’hematite, au B(a)P, ou a leur association, pourrait etre lice a l’inac- tivation partielle de la capacite inhibitrice de I’AAT par des especes

reactives de I’oxygenes (ERO) [22].

Face a I’interet toxicologique suscite par le stress oxydant induit par la formation des ERO, les auteurs se sont interesses a l’influence de

I’hematite et du B(a)P, seuls ou en association, sur le developpement

de ce phenomene.

-___- Le stress oxydant, syndrome resultant d’un desequilibre entre la formation d’ER0 et I’integrite des systemes de defenses antioxydantes,

est implique dans I’oxydation de macromolecules cellulaires (lipides, proteines, ADN) et dans la mort cellulaire [14]. Or, de recents travaux

suggerent que le fer, d’une part, et les HPA, d’autre part, generent des ERO au sein des cellules et des organismes vivants [33, 471. Dans

la continuite de leurs travaux, Garqon et al. se sont done interesses

a I’implication de I’hematite, du B(a)P ou de leur association, dans la

production d’un stress oxydant.

61

Qua/it4 de /‘air et sank?

ERO ? Fe203

ce a B(a)P Fe,O,+B(a)P

ANTI-PROTEASES

Fe203 B(a)P 42~ 71

Fe,O,+B(a)P

PROTEASES I

DCgradation de la matrice extracellulaire DCgradation des membranes basales sous-endothkliales

Croissance de tumeurs primaires

AAT = alpha-l -antitrypsine.

B(a)P = benzo(a)pyr8ne. CBP = cancer broncho-pulmonaire. ERO = especes r&ctives de i’oxyg8ne. PMN = polymorphonucl&aires.

En effet, I’exposition a I’hematite, au B(a)P ou a leur association a induit la production de malondialdehyde (MDA), un des marqueurs biologiques de la peroxydation lipidique des acides gras polyinsatures des membranes cellulaires [23]. De plus, ces expositions ont modifie les activites de certaines enzymes antioxydantes, telles que la superoxyde dismutase (SOD) [23]. Ces resultats corroborent ceux de la litterature qui a montre que le fer, et plus precisement les ions Fe*+, cata- lysent la production d’ER0 lors des reactions de Fenton et d’Haber- Weiss.

De meme, la litterature a d&it que le B(a)P, via son activation metabolique, etait implique dans I’apparition d’un stress oxydant [33]. Pour expliquer les variations de I’activite enzymatique de la SOD, certains auteurs ont mention& que cette enzyme n’etait pas particulierement protegee contre une attaque radicalaire et que, dans les conditions d’un stress oxydant marque, une reduction -voire une inhibition -de son activite catalytique etait observee [19].

Par ailleurs, Kim et Lee ont decrit des alterations de I’activite enzymatique de la SOD et de I’integrite structurale de I’ADN dans les poumons de rats SD exposes au B(a)P [33]. Garcon et al. ont observe la formation significative de E&hydroxy-2’-desoxyguanosine (8-OHdG), une des bases modifiees de I’ADN issue de I’adduit

d&%&e entre le radical hydroxyle et la desoxyguanosine, non seu-

lement chez les rats exposes au B(a)P seul, mais surtout chez ceux

co-exposes a I’hematite et au B(a)P [23]. Leurs resultats corro-

borent les conclusions de Cheu et al. selon lesquelles, lors d’une

telle co-exposition, I’hematite jouerait un role specifique dans la pro-

duction d’un stress oxydant [i 2, 231 (figure 3). Considerant le role

clef joue par les ERO dans certains mecanismes physiopatholo-

giques, des recherches in vivo se sont interessees a I’implication

de I’hematite, du B(a)P ou de leur association, dans I’induction d’une

reaction inflammatoire.

Bien que le stress oxydant ait initialement ete Btudie dans un contexte

d’effets destructeurs pour les cellules et les organismes vivants, de

recentes etudes suggerent que les ERO joueraient aussi un role tres

significatif en tant que messagers intra- et intercellulaires [I 31. De plus,

I’existence d’une relation etroite entre I’apparition d’un stress oxydant

Revue FranCake des Laboratoires, janvier 2003. No 349 62

GPx

o,“- - O,+ H,O, 2 H+

e- 2H+

2&O +-p-i-- H,O,

t

FezO,, B(a)P, Fe,O,+B(a)P GSSG GSH e_

GR HO” + _ Peroxydation

I

lipidique

AltCration de I’ADN b B(a)P < Fe,O,+B(a)P

I-OHdG = 8-hydroxy-2 -d&xyguanosine. $a)P = benzo(a)pyr&nn.

:BP = cancer brolxho-pulmonaire.

GPx = glutathion peroxydase. GR = glutathion r6ductase. GSH = glutathion kduit.

GSSG = glutathion oxyd6.

MDA = malondiald6hyde. SOD = superoxyde dismutase.

et la genese d’une reaction inflammatoire via I’induction du nuclear factor-kappa B (NF-KB) a recemment ete suggeree [56].

GarGon et al. ont montre que l’exposition a I’hematite, au B(a)P ou a I’association avait provoque une secretion pulmonaire de cytokines, telles que le tumor necrosis factor-alpha (TNF-CZ), I’interleukine-1 beta (IL-1 p) et I’interleukine-6 (11-6) [22, 241. Leurs observations, quant a I’expression genique oulmonaire de ces mediateurs inflammatoires, ont corrobore celles dec+es quant a leurs syntheses proteiques [22, 241. Or, la secretion aberrante de ces cytokines s’avere etre deletere et apparait des lors cornme un facteur d’amplification dans la cascade complexe des evenements inflammatoires [42].

Par ailleurs, ces auteurs. se sont interesses a I’implication de I’activation du NF-KB par le stress oxydant lors de la genese de la reaction inflammatoire. Toutefois, ils ont ete contraints de realiser une evaluation indi- recte de I’activation du NF-KB par la determination de I’expression genique d’un de ses inhibiteurs specifiques, le ~105 [21]. Chez les rats ~exposes a I’herratite, au B(a)P ou a leur association, une activation du NF-KB a ete obsetvee [21]. Aussi, suggerent-ils que le NF-KB, active par les ERO, jouerait un role fondamental dans les reactions immunes generees par I’exposiiion a I’hematite, au B(a)P ou a leur association [21, 241. Dans leurs recherches, Garqon et al. insistent sur le fait que la co-exposition a i’hematite et au B(a)P a provoque une reponse inflammatoire pulmonaire plus marquee que celle gene&e lors

de I’exposition a I’hematite seule ou au B(a)P seul [241.

En effet, I’hematite, caracterisee par une surface specifique elevee (9 my/g) et une phagocytose marquee, serait un vecteur physique de la

penetration et d’s la retention pulmonaires du B(a)P et favoriserait sa

toxicite [21]. En outre, les auteurs proposent que I’hematite, en plus de ce role non specifique, serait etroitement impliquee dans I’apparition d’un stress oxydant et done dans le developpement d’une reaction immune lors d’une co-exposition (figure 4).

Cette demarche de recherche etait importante, &ant donne le role des ERO et des cytokines dans la regulation des genes codant pour certaines des enzymes impliquees dans I’activation metabolique des HPA [13, 40, 561. Par ailleurs, certaines de ces enzymes etant une hemoproteine (CYP 1 Al), il s’averait tres interessant d’elucider le role de I’hematite dans I’activation metabolique du B(a)P lors d’une co-exposition.

Certains auteurs ont montre que la co-exposition a I’hematite et au B(a)P augmentait la formation de metabolites toxiques du B(a)P [12, 54, 551. A I’heure actuelle, deux voies distinctes d’activation metabolique de ce compose ont ete d&rites comme impliquees dans ses effets deleteres, voire cancerogenes [91. Or, le CYP 1 Al catalyse les reactions cruciales de chacune de ces voies, a savoir I’oxydation mono- electronique du B(a)P en un radical cationique et la mono-oxygena- tion du B(a)P et de certains de ses metabolites, les B(a)P-dihydrodiols, en metabolites ultimes, extremement reactifs, les BPDE [401. Le CYP

7A7, en tant que gene de Vary/-hydrocarbon gene battery (AhGB), est caracterise par une expression constitutive tres faible, mais est induc-

Revue Franqalse des LaboraWes. laker 2003, N” 349 63

Qualit de Ikir et sant6

PI& < B(a)P -c Fe@, +BWP Fe,O, < B(a)P < Fe,O, +B(a)P

FeA < B(a)P

-c Fe,O,+B(a)P

3(a)P = benzo(a)pyr&ne.

fR0 = espbces reactives de I’oxygbne. nos = inductible nitric oxide synthase.

IL-1 p = interleukine-1 b&a.

IL-6 = interleukine-6. NLS = nuclear localization signal.

RelA/pSO = nuclear factor-kappa 6. TNF-a = tumor necrosis factor-alpha Ub = ubiquitine.

KB = inhibitor kappa B. P = phosphate.

tible via I’interaction cytoplasmique de ses substrats, tels que le B(a)P, avec I’aryl-hydrocarbon receptor (AhR) 1401. De plus, il est important de preciser que le CYP 1 Al est une hemoproteine, c’est-a-dire une proteine constituee d’une molecule d’heme, et possede done un atome de fer lie a une porphyrine [40]. Aussi a-t-i1 semble pertinent d’evaluer I’influence de l’hematite sur I’activation metabolique du B(a)P lors d’une co-exposition. Les travaux de Garcon et al. se sont focalises sur la determination de I’expression genique et de la synthese proteique pulmonaires du CYP IA 1, de I’epoxyde hydroiase microsomale et des glutathion-S-transferases-alpha [21, 281.

Chez les rats co-exposes a I’hematite et au B(a)P, les concentrations en CYP IA1 et les activites 7-ethoxyresorufine-C-deethylase (EROD)

etaient significativement plus elevees (2 fois) que chez ceux exposes au B(a)P seul [2f]. Garcon et al. ont done suggere que, lors de la co- exposition, le fer exogene confererait une plus grande biodisponibi- Me au fer intracellulaire et favoriserait alors la traduction du CYP IAl en proteines fonctionnelles, impliquees dans une plus grande activa-

tion metabolique du B(a)P (figure 5,). Leur hypothese est confortee par des recherches ex vivo et in vitro, qui ont montre que cette co-exposition induisait une production accrue de B(a)P-dihydrodiols et de BPDE en comparaison a une exposition au B(a)P seul [12, 54, 551.

Aussi s’avere-il important d’insister sur la pertinence de ce resultat,

-

qui pourrait contribuer a expliquer la toxicite accrue de la co-exposition a I’hematite et au B(a)P [21].

Afin de verifier leur hypothese, ces auteurs ont cherche a confirmer a I’aide de I’un isotope froid du fer, le 54Fe, I’origine exogene des atomes de fer prssents dans les sites catalytiques de CYP 1Al. Ils ont demontre que le fer exogene est integre dans les microsomes, orga- nites cellulaires qui synthetisent les hemoproteines, notamment le CYP 1 Al [28]. Leurs resultats supportent done I’origine exogene des atomes de fer presents dans les sites catalytiques des CYP 1 Al tra- duits chez les rats co-exposes a I’hematite et au B(a)P Ce dernier argument a confort leur hypothose selon laquelle I’homatite jouerait un role crucial dans la synthese post-transcriptionnelle du CYP 1 Al observee lors de la co-exposition a I’hematite et au B(a)P, et serait par consequent impliquee dans la toxicite accrue du B(a)P (figure 5).

La litterature mentionne que I’AhR joue un role essentiel dans I’activation de facteurs de transcription (NF-KB, etc.), de certains genes impliques dans le controle du cycle cellulaire (P53, Bcl-2, etc.) et de certaines cysteine aspartate-specific proteases (caspases) [40]. En

64 Revue Fran+se des Laboratoires, janvier 2003, N” 349

EXCRETION

Fe,O,+lB(a)P >

Fe,O,+B(a)P >B(a)P --

4hGB = Ah gene batterie. IhR = aromatic hydrocarbon receptor.

4mt = Ah receptor nuclear translocator.

BMP = benzo(a)pyr&e. CYP 1 Al = cytochrome P450 1 Al bHLH-PAS = basic helix-loop-helix / per AmtSim. EHm = Bpoxyde hydrolase microsomale. CBP = cancer broncho-pulmonaire. GST-a = glutathion S-transf&ases-alpha.

outre, la synchronisation entre i’activation de I’AhR et I’induction des genes de I’AhGl3 jouent un role important dans I’apparition ou la pre-

vention d’un stress oxydant, et est done intimement impliquee dans le choix des cellules d’entrer dans la voie apoptotique ou de poursuivre

le cycle cellulaire [40]. La formation d’adduits a I’ADN par les BPDE

ou par les radicaux hydroxyles lors de I’exposition au B(a)P ou de la co-exposition a I’hemattte et au B(a)P pourrait aussi influencer ce choix [12, 23, 401. Aussi, les auteurs ont-ils etudie I’influence de I’hematite,

du B(a)P ou de leur association, sur I’apparition de perturbations du cycle cellulaire.

La machinerie apoptotique contrebalance les mecanismes de la proliferation cellulaire : elle joue done un role clef dans I’homeostasie tis-

sulaire normale et la proliferation tumorale [26]. Lors de I’apoptose, la cellule stimullee pat-ticipe a sa mort en modifiant I’activite transcriptionnelle de certains de ces genes [26, 401. Quel que soit le sti- mulus declencheur, les cellules presentant les signes d’une mort programmee actiwsnt une cascade de proteines specifiques. Cette machinerie spelcialisee est constituee par une famille de proteases,

encore appelees caspases 1261. Gosset et al. ont montre que I’ex-

position au B(a)P ou la co-exposition a I’hematite et au B(a)P avait

accru I’activite enzymatique de la caspase 3 [28]. II est important de

preciser que I’activite pulmonaire de cette caspase etait plus impor-

tante chez les rats exposes a l’association. Cette caspase effectrice

est un element-clef de la mort cellulaire programmee. Sit&e a la croi- see des voies intrinseque et extrinseque, elle est toujours activee

lorsque cette famille de proteine est impliquee dans I’apoptose [26]. Dans

la recherche me&e par ces auteurs, I’activation de la caspase 3 par I’exposition au B(a)P et la co-exposition a I’hematite et au B(a)P,

semble Btre lice a I’activation metabolique du B(a)P et aux concen-

trations pulmonaires Blew&es de certains effecteurs de I’apoptose, tels

que le cytochrome c [26, 281.

Ayant pu mettre en evidence un phenomene apoptotique, Gosset

et al. se sont interesses aux deux regulateurs antagonistes les mieux etudies de la mort cellulaire programmee : les proteines P53 et

Bcl-2 [28]. Ces proteines jouent un role important des le debut du processus de la cancerogenese pulmonaire 1321. En cas d’altera-

tion non reparee de I’ADN, la proteine P53 induit I’apoptose par des mecanismes de regulation transcriptionnelle ou non transcriptionnelle. Canti-oncogene pro-apoptotique P53 freine la transcription de I’on-

cog&e anti-apoptotique Bcl-2 et induit celle d’autres genes pro-apo- totiques tels que Bax et Fas [26]. D’apres Gosset et al,. chez les rats

exposes a I’hematite, seule ou associee au B(a)P, les taux pulmo-

naires des ARNm de P53 et de Bcl-2 ont ete significativement aug-

ment& [28]. II leur a done semble interessant de rechercher si une des deux grandes voies apoptotiques etait preferentiellement acti-

vee et, si oui, par quels mecanismes.

Revue Franpaise des Laborato~res, janvier 2003, N” 349 65

VOIE INTRINSEQUE

Fe,O,+B(a)P > B(a)P

VOIE EXTRINSEQUE

71 TNF-a

71 cytochrome c h

3ja)P = benzo(a)pyrene. :YP IA1 = cytochrome P450 1Al. -NF-a = tumor necrosis factor-alpha

Cetude des activites pulmonaires des caspases 8 et 9 a pu donner

des elements de roponse. La caspase 9 est specifiquement activee par Apaf-1, un facteur lib&e par la mitochondrie, et est done representative de la voie intrinseque de I’apoptose. Au contraire, la caspase 8

est plus representative, sans etre absolument specifique, de la voie extrinseque de l’apoptose, via le TNF-a. Les resultats de Gosset et al., quant aux activites pulmonaires de ces deux enzymes initiatrices,

semblent confirmer I’activation du phenomene apoptotique tres marque chez les rats co-exposes a I’hematite et au B(a)P [28]. En effet,

l’activite enzymatique de la caspase 9 etait significativement accrue

dans le tractus respiratoire des rats co-exposes a I’hematite et au B(a)P. En outre, les activites enzymatiques de la caspase 9, initiatrice, etaient positivement correlees avec celles de la caspase 3, effectrice. Or, la

production d’un stress oxydant et la liberation du cytochrome c, consti- tuent un prealable a I’activation de la caspase 9. De meme, la forma-

tion d’adduits hydroxyles a I’ADN, tels que la 8-OHdG, constitue un argument en faveur de I’induction de cette voie apoptotique. Aussi, ces

resultats confirment-ils l’induction de la voie intrinseque de I’apoptose par la co-exposition a l’hematite et au B(a)P. Par ailleurs, I’activite enzy-

matique de la caspase 8 Btait plus elevee chez les rats co-exposes a i’hematite et au B(a)P. Les activites de la caspase 8, initiatrice, etaient

positivement correlees avec celles de la caspase 3, effectrice. En se referant a leurs precedents resultats, Gosset et al. ont suggers que

le TNF-a avait active, via son recepteur membranaire, la voie extrinseque de I’apoptose. Le TNF-a est une cytokine pro-inflammatoire dont I’expression genique et la synthese proteique sont regulees par les ERO, via notamment I’activation de NF-KB. Ce facteur nucleaire est, selon le type cellulaire et le contexte biologique, un mediateur pro- ou anti-apoptotique. Dans ce dernier cas, il inhiberait I’expression genique de P53, activerait celles de Bcl-2 et d’autres molecules inhibitrices des caspases, et par consequent favoriserait la proliferation cellulaire [l I].

Les resultats de Gosset et al. suggerent done que la co-exposition B I’hematite et au B(a)P est impliquee dans I’activation simultanee des voies intrinseque et extrinseque de I’apoptose 1281 (figure 6). Toutefois, I’action specifique de I’hematite sur I’expression pulmonaire des genes P53 et Bcl-2 pourrait favoriser la proliferation cellulaire, en modifiant I’expression ou I’activation de facteurs de transcription, tels que le NF-KB, recemment decrit comme un regulateur negatif de l’apoptose [l 1, 281.

L es recherches presentees consistaient a determiner le role de I’hematite dans les mecanismes sous-jacents impliques dans la can-

cerogenese pulmonaire lice a I’exposition concomitante a I’hematite

66 Revue FranGaise des Laboratoires, janvier 2003, N” 349

QXYDESDEFER 4 , HAP htfmatite benzo(a)pyr&e

EXPOSITION CONCOMITANTE

METABOLLMfE / GYP lA1,

Tf, Tfi, f;t P’ENETRATION EHm, CST-a ACTIVATION ;CELL ULAIRE - - METABOLIQUE

DU FER (Tractus respiratoire) _ ERO, cytokines I ERO, cytokines

DU B(a)P _

MACROMOLECULES CELLULAIRES

CYCLE CELLULAIRE CYCLE CELLULAIRE

bq bc12

PROLIFEIW TION APOPTOSE MUTAGENESE

SPUE = benzo(a)pyretx dial-bpoxyde. Ft = ferritine.

:YP 1Al = cytochrorre P450 1Al. GST-cx = glutathion S-transfbrases-alpha. IHm = Bpoxyde hydrolase microsomale. IRP = iron responsive element. IRO = esp&ces reactIves de I’oxyg&ne. NFl = nuclear factor 1.

NF-KB = nuclear factor kappa B. Tf = transferrine.

TfR = r&epteur de la transferrine. TNF-(r = tumor necrosis factor-alpha.

et au B(a)P (figure ?). Les resultats ont montre que I’hematite influait sur la toxicite du B(a)P, non seulement via son role non specifique de vecteur physique de la penetration et de la retention pulmonaires de cet HPA, mais surtout via son implication dans un desequilibre de la balance proteases / anti-proteases, ia production d’un stress oxydant et la genese d’une reponse immune dans les poumons. L’hematite confererait aussi une plus grande biodisponibilite au fer intracellulaire et favoriserait la traduction du CYP 1 Al en proteines fonctionnelles, impliquees dans ur e pIus grande activation metabolique du B(a)P. Enfin, la formation exageree d’adduits a I’ADN par certains metabolites de B(a)P ou par les radicaux hydroxyles lors de la co-exposition influerait sur I’entree des cellules dans les differentes voies de la mort

cellulaire programmee. Toutefois, le role de I’hematite lors de cette co-exposition est encore parfois discute dans la litterature, du fait de I’exposition a des doses

elevees de B(a)P dans les protocoles d’induction de CBP. Ces doses seraient en effet suffisantes pour induire un phenomene de cancero-

genese, independamment du contexte metabolique ou de la presence

de co-facteurs.

Contrairement au milieu professionnel, en environnemen? general, les populations sont exposees a des melanges souvent tres complexes de polluants, tant du point de vue de leur diversite que de leurs proportions souvent tres faibles. En pathologie humaine, ces populations n’etant le plus souvent soumises qu’a de tres faibles doses d’HPA, la synergie provoquee par la presence des oxydes defer pourrait etre determinante pour favoriser le developpement d’un processus cancereux.

Nous adressons nos plus vifs remerciements au Pr P.M. Degand, au Pr N. Porchet, au Dr M. Balduyck, au Dr 6. Huet, au Dr A. Martin et au Dr F. Zerimech du Laboratoire de biochimie et de biologie moleculaire de I’HBpital C. Huriez de Lille pour leurs precieuses collaborations a cette recherche. Nous sommes aussi tres reconnaissants au Pr. C. Creusy et a Mme L. Fleurisse du Laboratoire d’anatomie et de cytologic pathologiques du Groupement hospitalier de I’lnstitut catholique de Lille pour leurs participations a l’etude du cycle cellulaire.

Revue Franc&se des Laboratolres. janvier 2003, N” 349 67

OualitG de I’air et sant6

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68 Revue Franpise des Laboratoires, janvier 2003, N” 349