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BASES MOLI~CULAIRES DE LA PATHOLOGIE. 1 1 - 13 septembre 1971.

Intol6rance au fructose.

Yves NORDMANN et F a n n y SCHAPIRA.

lns l i lu t de Pathologic Moldculaire, 24, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris 1# e.

Summary. - - Fructose in to le rance is due to a considerable decrease in the aldolase act ivi ty of the liver, as has been shown by Hers and Joassin, (19619. The spl i t t ing act ivi ty towards f ruc tose - l -phospha te (FIP) fal ls to 3 p. cent of the n o r m a l va lue and towards f ruc tose- l -6-d iphospha te (F16P) to 16-20 p. cent of the normal value.

Two ma in hypotheses could~ be advanced as to the na tu re of the enzymat ic defect : 1) a lack of syn thes i s of adul t l iver type aldolase, 2) a s t ruc tura l anomaly of l iver aldolase which would sti l l be synthe t ized bu t w i th a

great ly decreased activity. We demons t ra t ed in the l iver of three pa t ien t s w i t h fructose in to le rance the presence of

a p ro te in shar ing the immunolog ica l proper t ies of aldolase B (CRM). The l iver of these pa t ien t s conta ined 25-30 p. cent of the no rma l content of immuno-

logical a ldolase prote in . This is in cont ras t w i t h an enzymat ic act ivi ty of only 3 p. cent of the normal va lue (using F1P as subst ra te) . The immunolog ica l da ta were confirmed by double immunodi f fus ion plates, showing a single band of iden t i ty be tween no rma l and pathological l iver. The Michaelis cons tan t (Km) us ing F1P as subs t ra t e is s ignif icantly increased. All these data suppor t the hypothes i s of s t ruc tura l anoma ly of l iver aldolase.

I,n three o ther cases, we found only a round 5 p. cent of l iver a ldolase- l ike CRM. It is more difficult to explain these eases. If we exclude the fact t h a t l iver biopsies could be damaged we have to discuss the poss ib i l i ty of a real lack of synthes is of aldolase B ; t ha t woulcL therefore be ano t he r type of enzymat ic defect in fructose intolerance. In the paren ts of fructose in to lerance pat ients , no rma l a ldolase act ivi t ies are found in the liver.

L ' i n t o l 6 r a n c e h 6 r 6 d i t a i r e au f r u c t o s e (I .H.F.) es t u n e m a l a d i e ~ t r a n s m i s s i o n p r o b a b l e m e n t au toso - m i q u e r 6 c e s s i v e , d o n t les s i g n e s c l i n i q u e s et b io lo - g i q u e s s o n t b i e n c o n n u s [1, 2, 3] . Nous n ' a b o r d e - t o n s p a s le p r o b l 6 m e d u m 6 c a n i s m e de l ' h y p o g l y - c6mie , de l ' h y p o p h o s p h o r 6 m i e ou de l a p a t h o g 6 n i e des 16sions t u b u l a i r e s r 6 n a l e s , e t n o u s n ' e n v i s a g e - r o n s que la 16sion e n z y m a t i q u e e l l e -m6me.

L ' I .H.F . es t c a r a c t 6 r i s 6 e p a r u n e d i m i n u t i o n c o n s i d 6 r a b l e de l ' a c t i v i t 6 de l ' a l d o l a s e h 6 p a t i q u e ( a l d o l a s e B), et s u r t o u t p a r u n e m o d i f i c a t i o n de sa sp6c i f i c i t6 de s u b s t r a t , c o m m e l ' o n t m o n t r 6 H e r s et J o a s s i n en 19'6,1 [4] . Vis -$-v is d u f r u c t o s e - I - p h o s p h a t e ( F I P ) l ' a c t i v i t 6 de l ' e n z y m e es t m o i n s de 3 p. c e n t de la v a l e u r n o r m a l e , t a n d i s que v i s -a -v i s d u f r u c t o s e - l - f - d i p h o s p h a t e ( F D P ) , el le se m a i n t i e n t ~ 15-20 p. c e n t de la n o r m a l e ; p a r c o n s 6 q u e n t le r a p p o r t d ' a c t i v i t 6 de l ' e n z y m e v i s -$ -v i s de ces d e u x s u b s t r a t s , au l i eu d ' 6 t r e c o m - p r i s e n t r e 1,0 et 1,1, s '61bve e n m o y e n n e ~ 6 dar ts ce t t e m a l a d i e . N o t o n s que ce t te 616vat ion d u r a p - p o r t d ' a c t i v i t 6 r a p p r o c h e l ' e n z y m e << t y p e F o i e >> ( a ldo l a se B) de l ' e n z y m e << t y p e Musc le >> (a ldo- l a se A). L ' u n de n o u s , a v e c J . C. D r e y f u s , a v a i t p u m o n t r e r que cc t t e a c t i v i t 6 a l d o l a s i q u e a v a i t des p r o p r i 6 t 6 s a n a l o g u e s ~ ce l le d u fo ie foetal : n o n

s e u l e m e n t la m o d i f i c a t i o n de sp6c i f i c i t6 de sub- s t r a t , m a i s auss i l ' i n h i b i t i o n p a r I ' A T P et p a r l ' a n t i s 6 r u m a n t i a l d o l a s e A [5].

Nous a v o n s f o r m u l 6 a v e c J . C. D r e y f u s /~ p a r t i r de ces d o n n 6 e s d e u x h y p o t h e s e s s u r la n a t u r e d u t r o u b l e e n z y m a t i q u e :

1) ou bien absence de synth~se de l ' a l do - lase ¢ B ~.

2) ou bien anomalie structurale de l a m o l 6 c u l e e n z y m a t i q u e qu i b i e n que s y n t h 6 t i s 6 e n ' a u r a i t q u ' u n t r6s f a i b l e r e l i q u a t d ' a c t i v i t 6 . D a n s les d e u x h y p o t h 6 s e s l ' a c t i v i t 6 v i s -a -v i s d u F D P s e r a i t e n f a i t d u e e s s e n t i e l l e m e n t ~ l a p e t i t e q u a n t i t 6 d ' a l d o - lase A ( t y p e << M u s c l e >>) et aus s i d ' a l d o l a s e C ( t ype << C e r v e a u >>) p r 6 s e n t e s d a n s le fo ie foetal e t q u i p e r s i s t e r a i e n t i n t a c t e s .

U n c e r t a i n n o m b r e de d o n n 6 e s f a v o r i s e la s e c o n d e h y p o t h 6 s e m a i s , c o m m e n o u s a l l o n s le v o i r , la p r e m i 6 r e h y p o t h b s e n e p e u t 6 t re e x c l u e d a n s t ous les cas .

a) E n f a v e u r d ' u n e a n o m a l i e s t r u c t u r a l e p l a i - d e n t les r 6 s u l t a t s s u i v a n t s q u e n o u s r a p p e l l e r o n s b r i 6 v e m e n t , la t e c h n i q u e e m p l o y 6 e a y a n t d6jh 6t6

d 6 e r i t e [6, 73. 50

742 Yoes N o r d m a n n el F a n n y S c h a p i r a .

L'ant is6rum antialdolase B (aldolase h6patique adulte) est pr6par6 par inject ions h des coqs de pr6para t ion d 'a ldolase B pure de foie de lapin. On sait en effet que darts ces condi t ions l 'anti- s6rum, qui a une tr6s bonne sp6cificit6 de type (moins de 2 p. cent de r6action crois6e avec les aldolases A (type Muscle) ou C (type Cerveau) [8] pr6sente tr6s peu de sp6cificit~ d'esp~ce, et peut donc serv i r h l '6tude de l 'a ldolase h6pat ique humaine . Dans ces condi t ions nous avons corn- par6 la consomnlat ion d 'an t icorps neutral isants par des extraits de foie d ' In to l6rance au Fructose et par des extrai ts de foie normal adulte.

Dans 3 cas sur 6 off nous avons pu faire cette recherche , nous avons trouv6 26, 24 et 30 p. cent de consomnlat ion d 'an t icorps (ramen6s h la m~me quantit6 de prot6ine) pour les foies d ' IHF com- par6s au foie normal.

La mesure de la Constante de Micha~lis (Km), ut i l isant le F1P comme substrat, donc 6valuant vra i inent l 'affinit6 de l 'a ldolase B et non celle de l 'a ldolase A coexis tante a montr6 une augmenta- t ion significat ive : 10 h 60 raM, au l ieu de 2 h 3 dans le foie normal ou foetal (Fig. 1).

Toutes ces donn6es permet ten t d 'af f i rmer l 'exis- tence d 'une prot6ine ant ig6niquement semblable l 'a ldolase B, mais d 'act ivi t6 presque nulle et de tr6s faible affinit6. Une anomalie s t ructurale li6e i a u n e mutat ion d 'un g6ne de s t ructure est donc vraisemblable .

Des r6sultats comparables aux n6tres ont 6t6 r6- ceinrnent publi6s sur d 'autres enzymopathies . Feinste in et coll. [9], 6tudiant des souches mu- tantes de souris, ont montr6 qu 'une prot6ine immunolog iquement iden t ique /a la catalase nor- male peut 6tre raise en 6vidence dans les globules

TABLEAU I.

Pourcentage de ¢ mater ie l d rdaction crois~e >> avec l'aldolase B dans des foies de malades porteurs d' intoldrance au fructose.

Tissus humaias i Prot6ines ] mg/0,t ml !

Intol6rance au fructose

Foie a ~ 0,75 b 0,80 c j 1,16

Consommation d'anticorps

neutralisants tunit6s ~)

0,66 0,71 0,84

Quantit6s 6qu!va- Mat6rielh r6action tlenLes oe protelnes] crois6e ""

de loie normal

0,18 24 0,24 30 0,30 26

( ' ) Unit6 z quan*tit~ d ' an t i co rps i n h i b a n t 0,06 uni t6s d 'aet ivi t6 FDP a ldolas ique .

(**) Colonne 3 × 100

Colonne 1

I1 existait donc un << mat6riel h r6action croi : s6e >> puisque l 'act ivi t6 aldolasique pour le Fruc- tose- l -phopshate (presque sp6cifique de l 'a ldo- lase B) n 'est que de 2 ~ 3 p. cent de la normale. Dans trois autres cas, le taux de la prot6ine immu- nologiquement semblable ~ l 'a ldolase B ne diff6- rai t pas sensiblement du taux de l 'act ivi t6 F1,P aldolasique restante.

Ajoutons que la m6thode de double immuno- diffusion d 'Ouchter lony nous a permis de met t re en 6vidence une bande de pr6c ip i ta t ion entre le puits contenant l ' ant is6rum ant ialdolase << B >> et des extrai ts de qnatre foies diff6rents atteints d ' IHF, Cette l igne de pr6cipi ta t ion para i t 6tre sp6- cifiqne mais n 'a qu 'une identit6 par t ie l le avec les l ignes de pr6c ip i ta t ion obtenues avec le foie nor- mal adulte et foetal.

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rOuges de souris, acastalas6miques eomme hypo- catalas6miques ; et ils concluent h une muta t ion s t ructurale por tant sur le site enzymat ique et respectant les sites antig6niques. De m6me Tedesco et Mellman [10] ont mis en 6vidence un << mat6riel h r6action crois6e >> pour la t ransf6rase de galactos6miques, ce qui est en faveur d 'une mutat ion s t ructurale ne modi f ian t que le site enzy- matique. Nous c i terons aussi cer tains mutants pour la glncose-6-phosphate d6shydrog6nase 6ry- throcyta i re , 6tudi6s par R. Rosa et coll. [11], et les r6cents t ravaux de Rubin [12] sur l 'Hypoxan- th ine-guanine-phospho-r ibosyl t ransf6rase darts la maladie de Lesch-Nyhau.

b) Dans les trois autres cas off nous n 'avons pas d6cel6 de << mat6riel ~ r6act ion crois6e >>, si nous 6cart0ns l 'hypoth6se d 'une d6na tu ra t ion par t ie l le

ln toldrance au fructose . 743

a y a n t m o d i f i 6 les s i tes a n t i g 6 n i q u e s , o n p e u t d i s - cu t e r , so i t u n e i n s t a b i l i t 6 a n o r m a l e de la p r o t 6 i n e , so i t u n e a b s e n c e ou u n e t r~s g r a n d e d i m i n u t i o n de la s y n t h b s e de l ' a l d o l a s e B.

l ' e x e m p l e de la c a t a l a s e des g l o b u l e s r o u g e s de s o u r i s m u t a n t e s i9] , ce lu i de l ' h y p o x a n t h i n e gua- n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f 6 r a s e c h e z les m a l a d e s a t t e i n t s de s y n d r o m e de L e s c h N y h a n I14~ et c e lu i

v l

/ / ,/ // : / / * / • ~oo~ / ./ : / /

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,,r2

Foies de m a l a d e s a v e c

i n t o l 6 r a n c e a u F r u t o se

Foies n o r m a u x

,o~ ~ ~o ,oo 200 ,oo

Abcisse 1/S : inverse de la concent ra t ion en F-1-P Ordonn6e 1/V : inverse de l 'act ivi t6 aldolasique. Cons tante de Mieha~tis pour te F ruc to se - l -Phospha t e dans les Foies no rmaux et darts les Foies avee Into-

16rance H6r6ditaire au Fructose.

Cet te d i f f 6 r e n c e avec les cas off u n ¢ m a t 6 r i e l h r 6 a c t i o n c ro i s6e )) a 6t6 d6ce l6 c o n d u i r a i t a d m e t t r e u n p o l y m o r p h i s m e de la m a l a d i e . U n te l p o l y m o r p h i s m e g 6 n 6 t i q u e a 6t6 d6ce l6 p a r G o e d d e

de la p h o s p h o r y l a s e m u s c u l a i r e d a n s la g lyco- g6nose t y p e V [15]. Des m u t a t i o n s s t r u c t u r a l e s p e u v e n t a f f ec t e r d i f f 6 r e m m e n t le t a u x de s y n t h ~ s e d ' u n e e n z y m e , c o m m e Y o s h i d a l ' a r a p p e l 6 [16].

TABLEAU II.

Aetioit~s aldolasiques calcnl~es chez l'h~t~rozygote t en p o u r c e n t a g e de l ' a c t i v i t 6 n o r m a l e ) .

Aldolase B - synth~tis6e par le g~ne normal . . . . . - synth6tis6s par le g~ne mut6 . . . . . .

Aldolases A et C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Activit6 totale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aetivit~s aldolasiques

FDP FIP

50 50 1 . 5 1.5

10 0 .5

61.5 51

Rapport FDP/FIP

I 1 . 2

et A t l a n d d a n s des cas de d 6 f i e i e n e e en p s e u d o - c h o l i n e s t 6 r a s e [13] : si l ' a c t i v i t 6 d e la p s e u d o c h o - l i n e s t 6 r a s e s 6 r i q u e y es t t o u j o u r s t r b s bas se , le p o u r c e n t a g e de p r o t 6 i n e s 6 r i q u e i m m u n o l o g i q u e - mer i t s e m b l a b l e h l ' e n z y m e p e u t v a r i e r de 0 90 p. c e n t d u t a u x n o r m a l . On p e u t d o n n e r auss i

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c) Nous v o u d r i o n s d i s c u t e r b r i ~ v e m e n t de ce p r o b l 6 m e sous l ' a n g l e de la g 6 n 6 t i q u e . R a i v i o et coll . o n t 6 tud i6 des b i o p s i e s de p a r e n t s de m a l a d e s a t t e i n t s d ' I .H .F . [17]. Le r a p p o r t d ' a c t i v i t 6 F D P / F I P 6 ta i t d a n s les l i m i t e s de la n o r m a l e . On p o u r - r a i t p e n s e r que ces r 6 s u l t a t s p l a i d e n t en f a v e u r de

744 Y v e s N o r d m a n n

l ' h y p o t h 6 s e d ' u n e m u t a t i o n s u r u n g6ne de r6gu- la t ion . Mais un ca lcu l a p p r o c h 6 p e r n l e t de m o n - t r e r que chez un h6 t6 rozygo te qui p o s s 6 d e r a i t p a r h y p o t h b s e un g6ne de s t r u c t u r e ( p o u r l ' a l d o l a s e B) n o r m a l et un g6ne mut6, le r a p p o r t des ac t iv i t6s a l d o l a s i q u e s ne p o u r r a i t p a s 6tre t r6s s u p 6 r i e u r h l ' un i t6 c o m m e le m o n t r e le t ab l eau II.

I1 c o n v i e n t en effet d a n s l ' e s t i m a t i o n de ce r a p - po r t , de t e n i r c o m p t e des a ldo la ses A e t C ex is - t a n t e s d a n s le fo ie e m b r y o n n a i r e , c o m m e n o u s l ' a v o n s m o n t r 6 [18], et i n c h a n g 6 e s d a n s le fo ie d ' I .H .F , et d o n t l ' ac t iv i t6 sp6c i f ique est b e a u c o u p p lus g r a n d e que cel le de l ' a l d o l a s e B [19]. Dans ccs c o n d i t i o n s on vo l t que le r a p p o r t t rouv6 chez les h 6 t 6 r o z y g o t e s en l ' a b s e n c e m ~ m e de tou te i n t e r v e n t i o n d ' u n gbne de r6gu la t ion ne p e u t pus 6tre t r6s d i f f6 ren t du r a p p o r t t rouv6 duns le fo ie n o r m a l adul te . P a r con t r e , l ' ac t iv i t6 a l d o l a s i q u e to ta le d e v r a i t 6tre aba i s s6e (mais les l im i t e s e x t r 6 m e s de la n o r m a l e ne s o n t pus e n c o r e b i en d6f in ies) ,

E n conc lu s ion :

Nos r6su l ta t s m o n t r e n t q u ' a u m o i n s duns cer - t a i n s cas on p e n t d6ce l e r d a n s l ' I n t o l 6 r a n c e au F r u c t o s e un <~ m a t 6 r i e l h r 6 a c t i o n c ro i s6e >> t6moi - g n a n t de la p e r s i s t a n c e de la s y n t h b s e d ' u n e p r o - t6 ine p r e s q u e d6nu6e d ' ac t iv i t6 e n z y m a t i q u e . Cette a ldo la se est a n o r m a l e c o m m e en t 6 m o i g n e sa fai- ble aff ini t6 p o u r le F r u c t o s e - l - p h o s p h a t e . La m u t a - t i o n est d o n c v r a i s e m b l a b l e m e n t s t r u c t u r a l e et n o u s p e n s o n s que l ' I n t o l 6 r a n c e au F r u c t o s e et les e n z y m o p a t h i e s off des c o n s t a t a t i o n s ana logues on t p u 6tre fa i tes , r e n f o r c e n t la th6se expos6e p a r J'. C. D r e y f u s s u r le t y p e g6n6ral des m u t a t i o n s d a n s les e n z y m o p a t h i e s h u m a i n e s [20, 21].

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