La Fécondation

1. Définitions

Fécondation : rencontre puis fusion de deux cellules haploïdes (cellules venant de la méiose) pour donner une cellule unique et diploide. Spz + ovocyte = c unique avec lot paternel et maternel.

La   rencontre   des   gamètes   dépend   de   conditions   chronologique   (période   de   fécondabilité)   et topographiques (site de fécondation, trajet des spz).

La fécondation produit le zygote.

Période   de   fécondabilité :     période   du   cycle  menstruel   pendant   laquelle   un   rapport   peu   être fécondant et suivi d’une grossesse.

Elle dépend :

-  date ovulation : entre 12ème et 14ème jour du cycle normal (28 jours)-   durée de survie des gamètes : 3-4 jours pour les spz dans la glaire cervicale, et 24h pour 

l’ovocyte après ovulation 

Si le cycle modifié, la date d’ovulation est aussi modifiée. Pour un cycle plus long, l’ovulation est décalée d’autant de jours. Pour un cycle raccourci, la date d’ovulation est plus précoce. La deuxième partie de l’ovulation dure tjrs 14j, au dépend de la première partie du cycle.

La période pendant laquelle une femme peut être fécondée est assez courte (24h). Mais comme les spz peuvent survivre pls jours dans le tractus génital féminin, la période de fécondabilité peut aller jusqu’à 5 jours. Un rapport antérieur peut donc être à l’origine d’une grossesse.

Les  données  physiologiques  sont   importante  quand un couple  essaye de procréer.  Des  rapports réguliers permettent de couvrir l’ovulation, sinon il faut cibler les rapport par rapport à  l’ovulation. Il faut éviter d’avoir des rapports dans la deuxième partie pour avoir enfant, et privilégier la première partie du cycle après les règles. Il n’est pas nécessaire d’avoir des rapports trop fréquents (bien tt 2-3 j).

2. Migration des spermatozoïdes dans les voies génitales fémininesA. Sélection

Lors rapport de  l’éjaculation, 40 et 300 millions de spz sont déposés dans le vagin. Ce nombre varie selon les hommes. Plus il y a de spz mieux c’est. La moyenne est de 60-80 millions de spz dans un éjaculat.

En période pré-ovulatoire, les sécrétions des trompes diminuent l’activité des spz et favorisent leur survie. En période ovulatoire, elles activent les spz. En période ovulatoire et pré-ovulatoire, la glaire 

cervicales est abondante et filante, élastique, caractère optimal pour la pénétration et la sélection des spz.

30 min après l’éjaculation : 3-4 millions de spz vont envahir le mucus cervical.

L’éjaculat d’abord coagulé va se liquéfier. La coagulation de l’éjaculat est importante dans le contact avec le vagin qui est maintenu pendant quelques minutes. Si  la liquéfaction se fait tt suite après l’éjaculation il y a trop peu contact avec le col utérin.

Quelques milliers de spz vont ensuite migrer jusqu’au mucus du segment de l’isthme. Puis enfin, quelques dizaines seulement se retrouvent dans les trompes, ce sont eux qui seront en mesure de féconder l’ovule.

S’il n’y a pas d’ovulation, ils restent dans les trompes pour attendre l’ovocyte. Les secrétions des trompes se modifient pendant le cycle. Les spz vont être détruits.

Les spz dans la trompe peuvent aller jusque dans la cavité péritonéal, ce qui est favorable à leur survie.  Des   contractions  permettent   de   les   faire   revenir   dans   les   trompes.   L’ovocyte  peut   être expulsé hors du pavillon mais y  est ramené.

B. Capacitation

Les spz qui quittent les testicules dans le liquide séminal ne sont pas fécondants. Ils acquièrent leur propriété de mobilité et  leur capacité à féconder par une maturation post-testiculaire qui se déroule dans le tractus génital  masculin   et   le   tractus   génital   féminin.   Ces  modifications   intervenant   dans   le   tractus   féminin   se nomment la capacitation. Il s’y déroule aussi la réaction acrosomique.

L’épididyme est un organe de la fécondance des spermato. Le spz n’est pas fécondant quand il est éjaculé. La capacitation permet l’interaction des spz avec  le gamète femelle.   Ils  deviennent fécondants dans  les voies féminines (glaire cervicale).

Capacitation = Modifications structurales et fonctionnelles qui permettent l’acquisition de la fécondace du spz. C’est un processus indispensable pour que les spz réalisent la réaction acrosomique. Dure entre 2 à 5h.

Modification de membrane plasmique des spz

- Enlèvement et redistribution des protéines

Sous le contrôle des glycosaminoglycanes (héparine, chondroitine sulfate) présentes dans le tractus féminin qui fixent les protéines provenant de l’épididyme et les glandes annexes.

- Modification de la composition lipidique membranaire

La membrane plasmique est asymétrique et organisée en 2 feuillets. Les mouvements de pidides au sein de la membrane plasmique se font par : diffusion latérale, flip-flop, rotation et flexion.

Dans la membrane il y du cholestérol qui a pour rôle la stabilité de la membrane plasmique. Plus il  y a de cholestérol   plus   la  membrane   est   rigide.   C’est   une  molécule   qui   donc   rigidifie   la  membrane   et   qui   est constituée d’une partie polaire tournée vers l’extérieur de la membrane et une partie apolaire tournée vers l’intérieur.

La   membrane   est   composée   également   de   plusieurs   phospholipides :   la   phosphatidylsérine   (PS),   la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylcholine (PC) et la sphingomyéline (SM).

L’asymétrie de la membrane est maintenue par 3 enzymes qui transfèrent les phospholipides d’un côté à l’autre de la membrane.

Aminophospholipides translocase ( flippase) : Transfert PS et PE dans le feuillet interne.

Floppase : Transfert PC, SM et le cholestérol vers le feuillet externe.

Scramblase : Transfert tous les phospholipides dans les 2 sens.

Modifications au cours de la capacitation : perte de l’asymétrie membranaire

Conséquences : augmentation de la  fluidité membranaire suite à  l’efflux de cholestérol

Dans les voies féminines, il y a des accepteurs de cholestérol (albumine, lipoprtéines) ce qui permet l’efflux. Cet efflux augmente la fluidité membranaire car il y a moins de cholestérol.

Mécanismes à l’origine de modifications membranaire

La capacitation est déclenchée suite à l’entrée massive de Ca2+ et de HCO3- dans le cytoplasme de la 

cellule.

- Action directe du HCO3-

Entrée de bicarbonate : ↗ HCO3- intracellulaire

Augmentation du pH Activation des canaux potassiques : sortie de potassium hors du spz Conséquence : Hyperpolarisation

- Action directe du Ca2+

Entrée calcium

Inhibition flippase, activation scramblase Efflux de cholestérol : mouvement des protéines au sein de la membrane Conséquences :   perte   d’asymétrie   membranaire,  ↗  de   la   fluidité   membranaire, 

externalisation de récepteurs nécessaires à la fixation du spz à la zone pellucide

- Action indirecte de Ca2+ et HCO3-

Entrée calcium et bicarbonate

activation adénylcyclase : catalyse la transformation de l’ATP en AMPc AMPc active PKA : PKA phosphoryle pls protéines ce qui a pour effet de les activer ou de la 

inhiber Conséquences :   phosphorylation   de   protéines   flagellaires,   les   spz   deviennet   alors 

hyperactifs ; ↗ de calcium intracellulaire nécessaire à la réaction acrosomique

3. Phénomènes cellulaires de la fécondationA. Traversée du cumulus oophorus

L’ovocyte libéré dans le tractus féminin est entouré du cumulus oophorus qui compte plus de 3000 cellules folliculaires dans une matrice d’acide hyaluronique. Seuls les spz ayant subit la capacitation et   n’ayant pas subit   la réaction acrosomique passent dans les cellules du cumulus oophorus.  La protéine PH20 présente à la surface du spz a une activité hyaluronidase et permet de séparer les cellules folliculaires.

B. Fixation et traversée de la zone pellucide

La spécificité d’espèce de la fécondation est assurée par la zone pellucide (pas de reproduction entre un chien et un chat). La souris est le modèle mammifère le mieux connu.

Liaison primaire à ZP  RA  Liaison secondaire à ZP  Traversée de ZP

Liaison primaire à ZP

Elle met en jeu des structures oligosaccharidiques des protéines ZP et récepteurs sur la membrane des spz. Ils varient d’une espèce à l’autre.

Chez la souris, la zone pellucide est composée de glycoprotéines ZP1, ZP2 et ZP3. Les récepteurs sur le spz sont GalT, Zonadésine, SED1 ainsi que ZP3R/sp56. La partie de la zone pellucide reconnue dans la liaison primaire est ZP3.

Tandis  que chez  l’Homme,   la  zone pellucide  est  composée de ZP1,ZP2,  ZP3,  et  ZP4.  Le recpetur principale est la fucosyltransférase-5. Et la partie reconnue dans la liaison primaire, ZP3 et ZP4.

Réaction acrosomique

L’acrosome est un granule sécrétoire dérivé de l’appareil de Golgi et recouvrant les 2/3 antérieurs du noyau du spz sous la membrane plasmique.

La réaction acrosomique est induite par ZP3 chez la souris et ZP3 et ZP4 chez l’Homme.

Au cours de la RA, le contenu enzymatique (acrosine, hyaluronidase) est libérée par un mécanisme d’exocytose  qui   comprend  la   fusion  ponctuelle  et   la  vésiculation des  membranes  plasmiques  et acrosomale externe, et l’externalisation de la membrane interne de l’acrosome. Il y a libération des enzymes contenus dans l’acrosome.

La réaction acrosomique :

- Liaison de la ZP à des récepteurs tyrosine kinase- Phosphorylation de transporteurs Ca (entrée de Ca)- Activation de phospholipase PLCᵧ1- DAG active PKC qui active PLA2 qui produit des lipides fusiogène (lysophospholipides)

La RA est accentuée par une voie de la protéine G sensible à la toxine pertussique :

- Activation échangeur Na+/H+ avec influx NA+ et ↗pH- ↗Ca++ intracellulaire via canaux calciques voltage dépendants

- Activation adénylate cyclase avec ↗AMPc et activation PKA- Activation PLCᵧ1 (Insp3 et DAG)

Liaison secondaire

Une fois la RA faite, le spz reste fixé à la zone pellucide. La fixation est assurée par ZP2 grâce à des composants spécifiques de la matrice acrosomique exposés du fait de la RA (sp56, Zonadésine, Pro-acrosine).

Traversé de la ZP

Après la capacitation et la RA, le spz est hyperactivé : le mouvement de la tête permet la pénétration de la ZP. La pénétration est facilitée par la libération d’enzymes protéolytiques (acrosine).

C. Fusion spz-ovocyte

Après la traversée de la ZP, le spz se retrouve au niveau de l’espace péri-vitellin. Il  va se lier puis fusionner avec la membrane de l’ovocyte. Enfin, le spz est incorporé dans le cytoplasme de l’ovocyte (sauf membrane plasmique).

Acteurs de la liaison gamétique

- IZUMO – pour le spz

Elle a été identifiée et clonée grâce à un Ac monoclonal qui inhibait la fusion gamétique. Elle est spécifique du testicule et exposée à la surface du spz après RA. Chez la souris la protéine fait 56 kDa et chez l’homme elle fait 37 kDa.

Le gène code pour un protéine transmembranaire de type 1 de la superfamille des immunoglobulines avec un domaine extracellulaire qui contient un site putatif de glycosylation.

Les souris femelles KO IZUMO ont une fertilité normale. Les souris mâles KO IZUMO sont stériles. Les spz des souris KO IZUMO sont présents dans l’espace péri-vitellin d’ovocytes prélevés in vivo ce qui est en faveur d’un défaut de fusion. Cela est confirmé par les études in vitro. Des Ac polyclonaux bloquent la fixation et la fusion des spz humains sur les ovocytes dépellucidés de hamster.

- JUNO – pour l’ovocyte

Elle est le récepteur de IZUMO sur l’ovocyte.

JUNO   (déesse   de   la   lumière   dans   la   mythologie   romaine,   elle   est   par   dérivation   celle   de l’enfantement. Elle occupe une grande place dans les cérémonies du mariage et dans leur suites) est un membre de la famille des récepteurs aux folates qui ne fixe pas l’acide folique.

Les souris femelles KO JUNO sont stériles et les spz ne se fixent pas sur la membrane plasmique de l’ovocyte. 

JUNO disparait de la membrane ovocytaire après la fusion gamétique probablement avec la réaction corticale. Son rôle est le blocage de la polyspermie.

Acteurs de la fusion gamétique

- Protéine de la famille ADAM – chez le spz

ADAM pour A Disintegrin  And Metalloprotease.  Initialement mise en evidence chez  le  cobaye  la protein PH30 est  un hétérodimère compose de deux sous  unites   :   la   fertiline  α  (ADAM 1) et   la fertilline β (ADAM 2) ainsi que la cyritestine (ADAM 3). L’Ac anti PH30 inhibe la fusion des gamètes.

Les   protéines   ADAM  sont   des   protéines   transmembranaires   qui   ont   6   domaines :   prodomaine, domaine métalloprotéase, domaine disintégrine, domaine riche en cystéine, répétition « EGF-like » et segment transmembranaire avec une queue cytoplasmique courte.

Ces deux sous unités seront identifiée chez d’autres espèces de mammifères. La sous unité  α n’est pas toujours fonctionnelle notamment chez l’homme.

De   nombreux  membres   de   cette   famille   seront   découverts   avec   différentes   fonctions   (activité protéolytique ou rôle dans l’adhésion cellulaire).

- Intégrines – chez l’ovocyte

Des intégrines sont supposées intervenir comme médiateur dans la liaison ovocyte – spz. Ce sont des molécules hétérodimériques composées de sous unités α et de sous unités β.

Parmis   ces   intégrines,   l’α6β1   est   un  membre   de   la   sous   famille   des   intégrine   qui   à   l’origine reconnaissaient les laminines et a été identifié comme récepteur potentiel pour la fertiline  β et la cyritestine.

- Tétraspanine – chez l’ovocyte

Les tétraspanines constituent une famille de protéines. Plusieurs tétraspanines sont exprimées par l’ovocyte. CD9 est abondant et exprimé sur la totalité de la membrane de l’ovocyte à l’exception de la région dépourvue de microvillosités (face au fuseau de métaphase).

Les tétraspanines interagissent entre elles et avec d’autres proteines de surface construisant ainsi un réseau d’interactions moléculaires dont la plupart ne sont pas directes.

D. L’activation ovocytaire

Le signal calcique

Seuls les spz fécondants peuvent déclancher l’activation ovocytaire. Ils possèdent la phospholipase PLC zeta nécessaire au déclenchement du signal calcique. Le signal calcique est un signal ocsillant et auto-entretenu.

Pls étapes :

- Dans les minutes qui  suivent  la fusion du spz avec l’ovocyte,  il  y a activation des canaux calciques (InsP3)

- Mobilisation rapide du Ca++ lioée à la calréticuline (réserve du réticulum endoplasmique) par les canaux InsP3

- ↗ du Ca++ libre intracellulaire et multipliée par 10  fermeture canaux InsP3- Ca++ intracellulaire est soit réintégré dans RE grâce aux pompes ATPases, soit expulsé hors 

de l’ovocyte  ↘ de la concentration intracellulaire en Ca++- La baisse de concentration intracellulaire ouvre les canaux InsP3 et il y a sortie de Ca++ lié à 

la calréticuline

On  voit  donc   l’apparition  d’ocscillations   auto-entretune  de   la   concentration  en  Ca++   libre  dans l’ovocyte. Elles modifient l’activité des protéines dont les propriétés sont dépendantes de leur liaison au calcium.

La réaction corticale

Elle est déclanchée par une ↗ de Ca++. Elle consiste en l’exocytose des granules corticaux remplis d’enzymes :

- La  β-   hexoaminidase  détruit   les   chaines   oligosaccharidiques   de   ZP3   ce   qui   empêche   la polyspermie (liaison d’un autre spz à la zone pellucide).

- Une   protéase   clive   ZP2,   modifie   la   structure   de   la   zone   pellucide   et   bloque   ainsi   la polyspermie.

Achèvement de la méiose

Le MPF est un hétérodimère composé de 2 sous unités, une sous unité catalytique (la P34 cdc2) et la cycline B. L’arrêt de l’ovocyte en métaphase II est maintenu par la persistance des cyclines (cycline B) stabilisées par le facteur cytostatique (CSF).

La libération de Ca++ active une protéase qui élimine CSF. La cycline se retrouve sans CSF, ce qui entraine sa dégradation et l’inactivation de P34. La méiose II reprend.

E. L’achèvement de la fécondation

Formation et migration des pronoyaux

Pour le spz :

- Dissolution de l’enveloppe nucléaire- Décondensation de la chromatine : le noyau du spz devient pronoyau- Formation d’une nouvelle enveloppe nucléaire- Réplication de l’ADN dans le pronoyau- Rapprochement des pronoyaux en cours d’individualisation

Pour l’ovocyte :

- Décondensation de la chromatine du pronoyau femelle- Réplication de l’ADN- Rapprochement des pronoyaux en cours d’individualisation

Amphimixie = mise en commun du patrimoine génétique

Il   y   a  disparission  de   l’enveloppe  nucléaire  entourant   chacun  des  pronoyaux  pour  permettre   la formation d’une membrane unique autour des deux patrimoines génétique.

Première division de segmentation

On a disparition des membranes des pronoyaux et formation de microtubules à partir du centriole dupliqué. Les chromosomes se placent sur la plaque équatoriale. Le clivage s’achève en première division du zygote (22-26 ème heure)

4. Conséquences de la fécondation

Rétablissement du nombre diploïde de chromosomes.

Brassage des caractères héréditaires de l’espèce.

Détermination du sexe génétique (mâle hétérogamétique 23Y ou 23X, femelle homogamétique 23X).

Déclenchement de l’ontogenèse (=début du développement).