Vecteurs de Clonage

Année universitaire 2012/2013 DR. OULDJAOUI AHMED

A. DéfinitionsUn vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.

L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule.

l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

B. Utilité

● Permet de conserver une séquence d'ADNdonnée.

● Permet de la multiplier pour en accroître laquantité.

● Permet de la modifier pour y introduire desmutations, délétions.

● Permet de la réintroduire dans des cellules.

C. Principes

● Un Vecteur Circulaire

Linéaire

● Une Cellule hôte Procaryote

Eucaryote

●Un fragment d'ADN ADN génomique d'intérêt. ADNc

I - Propriétés des vecteurs de clonage

• capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée

(origine de réplication de type procaryotique et/ou eucaryotique)

• possèdent un polylinker ou site multiple de clonage

•Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance ATB)

•supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand.

II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

- Préparation du vecteur

- Préparation de l’ADN à insérer

- Réalisation d’un recombinant

- Incorporation à l’hôte

1. Obtention de l’ADN recombinant

+ traitementPAL

2. La ligation (ligature...)

Une enzyme, la ligase, est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une.

3.Différents vecteurs pour différentes utilisations

VECTEURS HOTE INSERT (Kb)

Plasmides Bactérie 10

Phage lambda Bactérie 25

Cosmide Bactérie 45

Phage P1 Bactérie 100

BAC (bacterial artificial chromosome)

Bactérie 300

YAC (yeast artificial chromosome) Levure 1000

Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur

4. Les plasmides comme vecteurs de clonage

Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne

Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb

Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène

Peut être considérée comme un minichromosome capable de réplication autonome

Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques= sélection

5. Les classes de plasmides

5.1. Les plasmides de première génération :Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique. Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides suivants :

• ColE1• RSF 2124• pSC 101

5.2. Les plasmides de deuxième génération : Ce ne sont pas des plasmides naturels mais résultent de plusieurs transformations : plasmides "artificiels".La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR 312 à pBR 322. Le plasmide pBR 322 est constitué de 4,4 Kb et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline (TcR), l’autre pour l’amplicilline (ApR). il possède, en plus, 20 sites uniques pour les endonucléases de restriction dont 11 localisés sur les deux gènes de résistance.

Carte du plasmide pBR322

pUC8 ACGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCACTG

Polylinker

pUC 9 ACGCCAAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCACTG

Polylinker

polylinkers de pUC8 et pUC9

5.3. Les plasmides de troisième génération :La famille pUC : Ont une taille qui avoisine 2,6 Kb et ayant intégré les gènes de résistance à l’ampicilline (ApR) et lacZ. Un polylinker identique à celui duphage M13 est associé à lacZ. Les différents pUC (de pUC8 à pUC19) ne différent que par le nombre de nucléotides et l’emplacement du polylinker

Les plasmides comme vecteur de clonage

De type procaryotique (bactéries):

Cas d’un vecteur plasmidique: l’ADN est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique.

6. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules

hôtes

électroporateur

6.1. Identification des clones intéressantsDans ce cas les bactéries transformées avec le

vecteur ne possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées un criblage est nécessaire

AmpR

TetRAmpR

TetS

Clone intéressant

6.2. Criblage des clones intéressants

pBR322

6.3. Criblage -screening- des clones intéressantsTest blanc-bleu (α-complémentation)

LES PHAGESLES PHAGESVirus de bactérie-infectieux : Rendement +++Virus de bactérie-infectieux : Rendement +++

• • λλ : 48 Kb: 48 Kb • • Les phages et les bactéries hôtes sont Les phages et les bactéries hôtes sont généralement mutées pourgénéralement mutées pour éviteréviter le cycle de le cycle de LysogénieLysogénie au profit du cycle au profit du cycle lytiquelytique.. • • Grande partie non essentielleGrande partie non essentielle

VECTEURSVECTEURS2 Types :2 Types :• • Insertion (Insertion (λλ zap, gt CHARON cDNAzap, gt CHARON cDNAFaible capacité ≤Faible capacité ≤ 10 Kb10 Kb• • Délétion : substitutionDélétion : substitution• • (Charon, EMBL, DASH, FIX…)(Charon, EMBL, DASH, FIX…)Partie non essentielle « stuffer » est Partie non essentielle « stuffer » est délétée et remplacée : ≤délétée et remplacée : ≤ 25 Kb25 Kb• • Sélection spi.Sélection spi.

7. Les phages comme vecteurs de clonage

Phage = virus de bactéries

De type procaryotique:

Cas d’un vecteur phagique

7.1. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes

8. Les cosmides comme vecteurs de clonage

9. Les YACs comme vecteurs de clonage

YAC : Yeast Artificial

chromosome

10. Bacterial Artificial Chromosomes BAC

7.4kb

● parA, parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.● OriS est une origine de réplication● CM : gène de résistance au chloramphenicol

● Avantages :– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement

III - APPLICATIONS DES VECTEURS- Clonage et amplification d’une

séquence d’ADN

- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc

- Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des organismes (animaux transgéniques)

- Production d’ARN

- Production de protéines codées par les gènes insérés

Banques d’ADN

-Banques d’ADN génomique

- Banques de cDNA

Principe du clonage (cas d’une banque génomique)

Banque (librairie) d’ADN génomique

Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un fragment d’intérêt?Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée dans une banque.

N=In(1-P)/In(1-f) N=In(1-P)/In(1-f)

N: nombre de recombinants N: nombre de recombinants P: probabilité désiréeP: probabilité désiréef: proportion de génome dans un seul f: proportion de génome dans un seul recombinantrecombinant

Ex: Ex: 99% de probabilité 99% de probabilité d’avoir une d’avoir une séquence représentée dans une banque séquence représentée dans une banque de fragments de de fragments de 17kb 17kb d’un génome d’un génome eucaryote eucaryote (3.10(3.1099pb)pb)N= In(1-0.99)/In(1-N= In(1-0.99)/In(1-(1,7.10(1,7.1044/3.10/3.1099))=8,1.10))=8,1.105 5 coloniescolonies

Banque d’ADNc

Le problème ici est l’obtention de clone dit « full length ».

Obtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARN:

Principe de la "reverse

transcription":

Production de protéinesUtilisation de vecteur

d’expression

Production de protéines humaines à but thérapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A

- Hormone de croissance

- Insuline

Exemple de l’insuline

-Bactéries : E. Colipremier hôte utilisénombreux vecteurs plasmidiques connus

et utilisablesculture en masse dans les fermenteurstaux d’expression élevés (plusieurs g de

protéine/litre)MAIS secrètent mal les protéines : éclatement des bactéries

-pas de modifications post-traductionnelles

-Levure saccharomyces cerevisiaemodifications post traductionnelles

MAIS pas de secrétion, moins bon rendement

-Cellules CHO (chinese hamster ovary)culture de masse en bioréacteurs,

protéines complexesMAIS cher et rendement plus faible

CELLULES HÔTES

Transfert et clonage du gène de l’insuline

MERCI POUR VOTRE

ATTENTION