Utilisation de la pepsine de poulet et de la ficine du figuier comme agents coagula

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE CONSTANTINE -1-

Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-alimentaires

I.N.A.T.A.A.

N° d’ordre :

N° de série :

Mémoire présenté en vue de l’obtention du diplôme de magister en Sciences

Alimentaires;

Option: Technologies Alimentaires.

Thème :

____________________________________________

Utilisation de la pepsine de poulet et de la ficine du

figuier comme agents coagulants du lait.

_________________________________________

Présenté par:

SIAR El-Hocine

Soutenu le : 25 juin 2014

Devant le Jury composé de :

Président : KHELIFI D. Professeur S.N.V. U.C.-1-

Rapporteur : ZIDOUNE M. N. Professeur I.N.A.T.A.A. U.C. -1-

Examinateurs: BENATALLAH L. M.C/A I.N.A.T.A.A. U.C.-1-

OULAMARA H. M.C/A I.N.A.T.A.A. U.C. -1-

Année universitaire 2013-2014.

Remerciements Avant tout je tiens à remercier celui qui nous a créés, protégé, aidé et celui qui m’a

donné la force, la patience et le courage pour pouvoir accomplir mon travail de magister

dans les meilleures conditions en disant « Dieu Merci ».

J’exprime toute ma gratitude et mes sincères remerciements à mon promoteur,

Monsieur ZIDOUNE M. N., pour avoir accepté de m’encadrer, ses conseils et orientations

ainsi que pour la confiance qu’il m’a donnée tout au long de réalisation de ce travail

Je tiens également à remercier

Mr Pr. KHELIFI D. maitre d’avoir accepté de présider le jury. Ainsi que Mm. BENATALLAH

L. et Mm. OULAMARA H. d’avoir accepté d’examiner ce travail. Veuillez trouver, ici

l’expression de ma reconnaissance et mon respect.

Je tien a remercier Monsieur NAMOUNE H. ainsi que tous les enseignants qui ont

assurés le bon déroulement de l’année théorique de ma formation, qu’il trouve ici toute ma

reconnaissance

Je remercie la société SAFILAIT ainsi que l’ensemble de son personnel pour m’avoir

accueilli et permis d’effectuer les différents tests et analyses et pour avoir mis à ma

disposition le matériel et les moyens nécessaires à la réalisation d’une partie de ce travail.

Je remercie particulièrement, les membres de l’équipe T.E.P.A. du laboratoire

L.N.T.A. pour leur contribution et le temps qu’ils ont bien consacrer pour la réalisation de ce

mémoire.

Je tien aussi a remercié l’ensemble de personnel de l’’I.N.A.T.A.A. administrateurs,

enseignants et laborantins pour leurs service et encouragements qu’ils trouvent ici

l’expression de ma profonde gratitude.

Le soutien et l’encouragement de : Alla, Abdelah, Ferhat, Smail, Bachir, Hayet H.

Awatef, Anis, Loucif, Adel, Sabrina, Ouabda, Sarah, Naouel, ainsi que tous mes collègues de

la promotion magistère 2011, ont été très importants pour la réussite de mes études. Qu’ils

trouvent ici l’expression de ma profonde affection.

Je remercie aussi, tous ceux et toutes celles qui m’ont aidé ou encouragé, à quelque

titre ou degré que ce soit, à entreprendre et achever ce mémoire.

DEDICACES

Je dédie ce travail

A ma très chère mère pour tous ses sacrifices et ses soucis pour les

besoins de nos études,

A mon très cher père pour tous les efforts fournis afin de nous voir un

jour réussir nos projets et nos études,

A mes sœurs Malika et Wardia et Fatma ainsi que son mari Hamou

et ses filles Aya et Esrae pour leurs soutien morale

A mes frères, Boudjamaa et Idir ainsi que Lahcen et sa femme

Faroudja pour leur soutien et encouragements sans limite,

A toutes celles et à tous ceux qui m’aiment,

A tous mes amies et amis et plus particulièrement celles et ceux que

j’ai connus à INATAA, Constantine (Allilou, Abdou, Ferhat, Hayet, S,

N, S, O)

Sommaire

Sommaire

SOMMAIRE

Liste des figures

Liste des tableaux

Liste des abréviations

Introduction ........................................................................................................................ 01

Etude bibliographique

I. Présure et succédanés de présure .................................................................................... 03

I.1. La présure ................................................................................................................. 03

I.2. Les succédanés de présure ........................................................................................ 03

I.2.1. Succédanés d’origine microbienne ................................................................... 03

I.2.1.1. Succédanés d’origine bactérienne ........................................................ 04

I.2.1.2. Succédanés d’origine fongique ............................................................ 04

I.2.2. Succédanés d’origine animale .......................................................................... 04

I.2.2.1. La pepsine bovine ................................................................................ 05

I.2.2.2. La pepsine porcine ............................................................................... 05

I.2.2.3. La pepsine de poulet ............................................................................ 05

I.2.3. Succédanés d’origine végétale ......................................................................... 07

I.2.3.1. Généralité sur les enzymes d’origine végétale .................................... 07

I.2.3.2. Cas de l’extrait de ficine ...................................................................... 07

II. Le lait .............................................................................................................................. 10

II.1. Dénomination légale du lait cru .............................................................................. 10

II.2. Composition chimique globale de lait ................................................................... 11

II.2.1. Eau ................................................................................................................... 11

II.2.2. Matière grasse ............................................................................................................ 11

II.2.3. Les vitamines ...................................................................................................... 12

II.2.4. Glucides ........................................................................................................ 12

II.2.5. Matières minérales (taux de cendres) ...................................................................... 12

II.2.6. Matières azotées ................................................................................................... 12

III. Mécanismes de coagulation ......................................................................................... 15

II.1. Coagulation acide .................................................................................................... 16

II.2. Coagulation mixte .................................................................................................. 16

II.3. Coagulation enzymatique ........................................................................................ 16

III.3.1. Phase primaire .......................................................................................... 16

III.3.2. Phase secondaire ...................................................................................... 17

Sommaire

III.3.3. Phase tertiaire ............................................................................................ 18

VI. La fabrication des fromages .......................................................................................... 18

VI.1. Définition des fromages ....................................................................................... 18

VI.2. Le fromage à pâte molle exemple « camembert » ................................................. 18

VI.2.1. Définition .................................................................................................. 18

VI.2.2. Technologie de fabrication des fromages ................................................. 18

VI.3.Les défauts des fromages ....................................................................................... 21

Partie expérimentale

I. Matériel et méthodes

I.1. Matières premières ................................................................................................... 22

I.1.1. Le lait ........................................................................................................... 22

I.1.2. La présure ..................................................................................................... 22

I.1.3. La ficine ....................................................................................................... 22

I.1.4. La pepsine .................................................................................................... 23

I.2. Caractérisation du lait ............................................................................................... 25

I.3. Caractérisation de l’extrait enzymatique ................................................................... 26

I.3.1. Teneur en protéine ....................................................................................... 26

I.3.2. Activité coagulante ...................................................................................... 27

I.3.3. Force coagulate ............................................................................................ 29

I.3.4. Mesure de l’activité spécifique ..................................................................... 29

I.3.5. Activité protéolytique .................................................................................. 29

I.3.6. Profile électrophorétique............................................................................... 30

I.4.Détermination des conditions optimales d’activité des extraits de ficine et pepsine . 31

I.4.1. pH optimal ................................................................................................... 31

I.4.2. Température optimale .................................................................................. 32

I.4.3. Concentration en CaCl2 ............................................................................... 32

I.5. Etude des interactions impliquées dans la formation de coagulum .......................... 32

I.6. Essai fabrication d’un fromage à pâte molle type « Camembert » ........................... 33

I.6.1. La technologie de fabrication de Camembert au niveau de SAFI Lait ........ 33

I.6.2. Analyses physicochimiques de lait utilisé pour la fabrication du fromage 36

I.6.3. Analyse effectuées pour les fromages fabriqués .......................................... 37

I.6.3.1. Echantillonnage ..................................................................................... 37

I.6.3.2. Analyses physico-chimiques des fromages fabriqués ........................... 37

I.6.4. Suivi de l’évolution de la texture .................................................................. 38

Sommaire

I.6.5. Suivi de la protéolyse .................................................................................... 38

I.6.6. Analyses sensorielles .................................................................................... 41

II. Résultats et discution

II.1. Caractéristiques de lait utilisé .................................................................................. 44

II.2. Caractéristiques des extraits enzymatiques ............................................................. 44

II.2.1. Activité protéolytique .................................................................................. 46

II.2.2 Profil électrophorétique ................................................................................ 47

II.3. Conditions optimales de coagulation ....................................................................... 49

II.3.1. Effet de pH ................................................................................................. 49

II.3.2. Effet de la température ............................................................................... 50

II.3.3. Effet de la concentration en CaCl2 .............................................................. 51

II.4. Les interactions impliquées dans le gel obtenu par l’extrait de ficine et de pepsine 52

II.4.1. Interaction hydrophobes (dissocié par l’SDS) ............................................ 52

II.4.2. Intéraction hydrogène (dissocié par l’urée) ................................................ 54

II.4.3 Ponds calciques (dissocié par l’EDTA) ........................................................ 55

II.5. Essai de fabrication d’un fromage à pâte molle type « camembert » par l’utilisation de

la ficine ou de la pepsine de poulet ...................................................................................... 57

II.5.1. Caractéristiques physicochimiques du la utilisé ......................................... 57

II.5.2. Paramètres physicochimiques des fromages fabriqués .............................. 58

II.5.3. Le rendement .............................................................................................. 59

II.5.4. Evolution de la texture des fromages .......................................................... 59

II.5.5. L’évolution de la protéolyse ........................................................................ 61

II.5.5.1. Evolution qualitative ........................................................................... 61

II.5.5.2. Evolution quantitative .......................................................................... 65

II.5.6. Evolution des caractéristiques organoleptiques........................................... 67

Conclusion ........................................................................................................................... 73

Références bibliographiques ................................................................................................ 76

Annexes

Liste des figures

Figure n° 01 : (A) Appareil digestif du poulet ; (B) Complexe stomacal du poulet ; (C)

Anatomie du complexe stomacal des Galliacées .................................................................... 06

Figure n° 02 : photo d’un figuier ........................................................................................... 08

Figure n° 03 : micelle de caséine vue par un microscope électronique ................................. 14

Figure 04 : Structure de la micelle de caséine ......................................................................... 15

Figure n° 05 : phases de coagulation de lait et formation de réseau ..................................... 17

Figure n° 06 : Diagramme générale de fabrication de fromage a pate mole type camember

.................................................................................................................................................. 20

Figure n° 07: Diagramme d’extraction de la pepsine de poulet selon BOHAK, (1970) ........ 24

Figure n° 08 : Courbes étalonS obtenue avec : A : BSA ; B : la caséine et C : la tyrosine .... 28

Figure n° 09 : Diagramme de fabrication Camembert adopté par la laiterie SAFILAIT ..... 35

Figure n° 10 : Préparation de l’échantillon pour le test de pénétromètrie. ............................ 40

Figure n ° 11 : Extraction des fractions protéiques solubles et insolubles à pH= 4,6

(FALLICO et al., 2004) ........................................................................................................... 40

Figure n° 12 : Quantité de produit d’hydrolyse libérés par les extraits enzymatique étudiées

.................................................................................................................................................. 47

Figure n° 13: Profils électrophorétiques sur SDS-PAGE des extraits de ficine et de pepsine

de poulet ................................................................................................................................... 48

Figure n° 14 : Effet du pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait de ficine, de pepsine et

de présure ................................................................................................................................. 49

Figure n° 15 : Effet de la température du lait sur l’activité coagulante de ficine, de pepsine de

poulet et de la présure ............................................................................................................... 50

Figure n° 16 : Effet de la concentration de CaCl2 sur l’activité coagulante de l’extrait de

ficine, de pepsine et de présure animale ................................................................................... 52

Figure n° 17 : Effet de SDS sur les gels présure, pepsine et ficine ......................................... 53

Figure n° 18: Effet de l’urée sur les gels présure, pepsine et ficine ........................................ 55

Figure n° 19 : Effet de l’EDTA les gels présure, pepsine et ficine ........................................ 56

Figure n° 20 : Evolution de la profondeur de pénétration de cône du pénétromètre dans les

trois fromages au cours de l’affinage ...................................................................................... 60

Figure n° 21 : profil électrophrètique des protéines du fromage issu de la coagulation par

l’extrait de ficine ..................................................................................................................... 63

Figure n° 22 : profil électrophrètique des protéines du fromage issu de la coagulation par la

pepsine du poulet ...................................................................................................................... 64

Figure 23 : profil électrophrètique des protéines du fromage témoin (issu de la coagulation

par une présure microbienne) ................................................................................................... 65

Figure n° 24 : Evolution du taux de protéines solubles à pH = 4,6 par rapport aux protéines

totales des différents fromages au cours de l’affinage ............................................................. 66

Figure n° 25 : Profil sensoriel des trois fromages au 1er

jour de fabrication ......................... 68

Figure n° 26: Profil sensoriel des trois fromages au 6ème

jour d’affinage .............................. 69

Figure n° 27 : Profil sensoriel des trois fromages au 13ème

jour d’affinage ........................... 69


jour d’affinage ........................... 70


jour d’affinage ........................... 70

Figure n° 30: Profil sensoriel des trois fromages au 37ème

jour d’affinage ............................ 71

Liste des tableaux

Tableau n° 01 : Composition générale du lait de vache (FILION, 2006) ............................... 11

Tableau n° 02 : proportions relatives des protéines de sérum (g/100g des protéines totales du sérum)

de quelques mammifères (HUPPERTZ et al., 2006) .................................................................. 13

Tableau n° 03 : comparaison entre un caillé lactique (voie acide) et un caillé présure (voie

enzymatique(VIGNOLA, 2002) ............................................................................................... 15

Tableau n° 04 : composition des gels d’acrylamide en milieu urée ....................................... 40

Tableau n° 05 : caractéristiques physicochimique de la poudre de lait et de substrat de

BERRIDGE. ............................................................................................................................. 44

Tableau n° 06 : principales caractéristique des enzymes extraites ......................................... 44

Tableau n° 07 : composition physicochimique du lait cru utiliser pour la fabrication

fromagère ................................................................................................................................. 57

Liste des abréviations

AFNOR : Association Française de Normalisation

ANOVA : Analyse de la variance

ANP : Azote Non Protéique

BSA : Bovin Sérum Albumine

CMP : Caséinomacropéptide

EDTA : Ethyle Diamine Tétra Acétique

ESD : Extrait Sec Dégraissé

EST : Extrait Sec Total

FAO : Food and Agriculture Organization

FIL : Federation International du Lait

ISO : International Standard Organization

MG : Matière Grasse

Rdt : Rendement

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TCA : Acide Trichloacitique

DTT : DL-Dithioreitol

T.E.P.A. : Transformation et Elaboration des Produits Agro-alimentaires

U.A.C. : Unité d’Activité Coagulante

U.P. : Unité présure

αs1-CN : Caséine αs1

β-CN : Caséine β

Ps : Protéines solubles

Pt : Protéines totales

Introduction

Introduction

1

La fabrication du fromage est apparue il y a 8000 ans, peu après la domestication des

animaux. A l’origine, l’intérêt majeur de la transformation du lait en fromage était de

conserver les principaux constituants du lait. Aujourd’hui, il s’agit plutôt d’un aliment,

possédant des qualités nutritionnelles indéniables (CHOLET, 2006).

La première étape de fabrication du fromage est la coagulation, considérée comme la

clé de la réussite de n’importe quelle préparation. Elle consiste à la formation d’un gel suite à

des modifications physico-chimiques intervenant sur les micelles de caséines.

L’agent coagulant le plus anciennement utilisé en fromagerie est la présure. Cette

enzyme est extraite à partir de la caillette de veau non sevré. Elle est constituée de 80 %

chymosine et de 20% pepsine (DESMAZEAUD, 1997). Bien qu’elle soit encore l’enzyme la

plus utilisée en fromagerie, sa production connaît une pénurie mondiale. Elle est due

essentiellement à une augmentation croissante de la production et de la consommation des

fromages et à l’impossibilité d’augmenter en parallèle la production de présure (BANGA-

MBOKO et al., 2002).

Pour des raisons sociales et religieuses comme l’utilisation interdite de la présure dans

certains pays tels que l’inde et l’Israël, les questions qu’elle pose dans les pays musulmans à

cause des rituels d’abattage et l’interdiction d’utilisation de la pepsine porcine, ainsi que la

non stabilité de la qualité et des prix et la difficulté d’approvisionnement en présure, la

recherche de nouvelles sources d’enzymes capables de remplacer la présure traditionnelle

dans l’industrie fromagère a été imposée.

Parmi ces succédanés, les protéases d'origine végétale sont très anciennement utilisées

dans des préparations traditionnelles telles que celles provenant de l'artichaut, du chardon et

de latex du figuier. D'autres enzymes ont été testées telles que les protéases d'origine

fongique synthétisées par diverses espèces. Il existe aussi des succédanés d'origine animale

tels que les pepsines porcines, bovines et les pepsines extraites des proventricules des

volailles.

Bien qu’elle ait un potentiel de production en succédanés capables de subvenir aux

besoins en agents coagulants, l’Algérie reste dépendante des fournisseurs étrangers en matière

d’approvisionnement et importe la quasi-totalité des quantités d’enzymes nécessaires à

l’industrie fromagère. En 2011, environ 25 mille tonnes de fromages ont été vendus dans le

marché algérien. Selon l’Office National des Statistique (O.N.S), l’industrie fromagère

Introduction

2

algérienne a utilisé près de 1,5 tonne de présure et ses substituts. Le coût élevé d’importation

(plus de 102 millions de Dollars) ainsi que la dépendance de l’Algérie vis-à-vis des

fournisseurs étrangers en matière d’approvisionnement en présure et/ou ses succédanés, nous

a encouragé à mettre en valeur des sources locales pour la production d’agents coagulants

utilisables en industrie fromagère.

Bien que la recherche des succédanées de présure soit depuis de nombreuses années

entamée en Algérie, les études ont montré un intérêt certain de ces enzymes sur les plans de la

faisabilité et de la stabilité technologique. Cependant, ces recherches menées au stade

expérimental n'ont jusqu’à nos jours, pas suscité l’intérêt d’une application industrielle. Parmi

ces travaux, nous évoquons ceux menés par l’équipe de rechercher T.E.P.A. (Transformation

et Elaboration des Produits Agro-alimentaires) de l’I.N.A.T.A.A qui ont porté sur l’extrait des

fleurs de cardon (ZIKIOU, 2013) et sur la pepsine extraite des proventricules de poulet

(ADOUI, 2007 ; BOUGHALUOT, 2007 ; BENYAHIA-KRID et al., 2010). Vu l’importance

des sources disponibles de notre pays, nous avons jugé important d’entreprendre une étude

comparative sur la pepsine de poulet et la ficine extraite de latex de figuier en offrant aux

investisseurs algériens plus d’opportunités pour exploiter la biodisponibilité locale.

Ces deux extraits sont exploités depuis une époque lointaine pour la production des

fromages traditionnels Algériens, tels que le fromage Takammérit consommé dans les régions

sud de l’Algérie préparé par utilisation de la pepsine de poulet ainsi que le fromage Agugli

préparé par utilisation de latex de figuier (ficine) principalement dans la Kabylie en l’Algérie.

L’objectif de ce travail est la valorisation des pratiques traditionnelles par la

caractérisation de l’extrait clarifié de la pepsine de poulet et de l’extrait brut de la ficine, ainsi

que par l’étude de la possibilité de leur utilisation comme succédanés de présure en

fromagerie. Pour parvenir à ces objectifs nous avons procédé comme suit :

- Récupération des matières premières (latex de figuier et proventricules de poulet) ;

- Extraction des systèmes enzymatiques contenus dans chacune des matières

premières (ficine et pepsine de poulet);

- Caractérisation des extraits enzymatiques obtenus (ficine et de pepsine);

- Détermination du type d’interactions impliquées dans la formation et le maintien

des coagulums (gels);

- Utilisation des extraits étudiés dans la fabrication d’un fromage à pâte molle type

« Camembert » par comparaison avec celui obtenu avec la présure microbienne.

Etude

bibliographique


3

I. Présure et succédanés de présure

La présure et ces succédanés sont des enzymes capables de coaguler le lait. El sont

d’origine animale, végétale ou microbienne (ECK et GILLIS, 1997 ; SCRIBAN, 1999 ;

VIERLING, 2003). Les enzymes coagulantes sont des protéases. Elles ont une action

analogue à celle de la présure sur les caséines. Les inconvénients des succédanés de présure

sont la baisse du rendement, la texture molle et les gouts anormaux dû a leur activité

protéolytique (ALAIS, 1971 ; AMIOT, 2002). L’utilisation d’enzymes protéolytiques pour la

coagulation est parmi les plus anciennes opérations de transformation alimentaires (RAMET.

1985 ; HUPPERTZ et al., 2006).

I.1. La présure

Selon la fédération internationale du lait (FIL) la dénomination «présure» est donnée à

l’extrait coagulant provenant des caillettes de jeunes ruminants abattus avant sevrage

(RAMET, 1985 ; ANDREN, 2002). Elle est traditionnellement à la base de la fabrication des

fromages (VIERLING, 2003). De petites quantités de présure sont produites à partir de

l'estomac de chevreau et d'agneau (RAMET, 1985 ; DESMAZEAUD, 1997).

La présure se compose de deux fraction, 80% chymosine et 20% pepsine (SCOTT,

1981 ; HUPPERTZ et al., 2006). La chymosine (EC 3.4.23.4) est la principale enzyme de

coagulation du lait présente dans la présure. C’est une protéase acide, secrétée sous forme de

proenzyme inactive appelée prochymosine. L’activation de la prochymosine en chymosine se

fait spontanément dans la caillette aux pH inferieurs à 5,0 par hydrolyse de l’extrémité N-

terminale de la molécule (MAHAUT et al., 2000, 2003). Elle a un poids moléculaire de 35

KDa avec 323 résidus d’acides aminés (SCRIBAN, 1999).

I.2. Les succédanées de présure

De nombreuses raisons on stimulées la recherche de succédanées capable de remplacer

la présure et de trouver de nouvelles sources d’enzymes pour l’industrie. Selon BOUDIER,

(1974), RAMET, (1985) ; ECK et GILLLIS, (1997) ; KUMAR et al., (2005), les principales

raisons sont :

A. Sociales et religieuses, où l’utilisation de la présure est interdite dans certains pays

tel que l’inde et l’Israël ;

B. La non stabilité de la qualité et le prix élevé de la présure industriel sous l’effet de

l’élevage moderne et l’augmentation de la production fromagère mondiale ;

C. économiques où la présure ne peut plus répondre à la demande croissante ;


4

D. Nécessité pour l’industrie fromagère d’approvisionnement régulier en enzymes

coagulante.

I.2.1. Succédanées d’origine microbienne

Le développement de domaine microbiologique a permis de mieux comprendre la

synthèse des enzymes chez les microorganismes, ce qui a orienté la production industrielle

vers le processus fermentaire (SANDHYA et al., 2005). Un grand nombre de protéases

susceptibles de coaguler le lait sont obtenues à partir de la culture de microorganismes.

(DALGLEISH, 1997 ; RAMET, 1985). De plus à l’inverse des protéases gastriques qui sont

synthétisées sous formes de zymogènes inactifs, les protéases microbiennes sont produites

sous formes active (DALGLEISH, 1997).

I.2.1.1. Succédanés d’origine bactérienne

Les souches de Bacillus ont été les plus étudiées pour la production d’enzymes

coagulantes en particulier Bacillus subtilis, B. cereus et B. polymexa. Des essais assez poussés

ont mis en évidence une activité protéolytique trop forte par comparaison à la présure dans les

même conditions de la coagulation et les caillés obtenus manquaient de cohésion (ALIAS,

1971 ; MAHON et BROWN, 1985).

I.2.1.2. Succédanés d’origine fongique

Ils ont donné des résultats, souvent comparables à ceux obtenus avec la présure;

plusieurs préparations sont déjà commercialisées et utilisées à plus ou moins grande échelle

selon les pays. Ces préparations proviennent de trois genres de moisissures : Endothia

parasitica (E.p.), Mucor pusillus (M.p.), Mucor miehei (M.m.) (RAMET, 1985). Certains

chercheurs n’ont trouvé pratiquement aucune différence entre les fromages fabriqués par ces

enzymes et ceux fabriqués par la présure (PAQUET, 1977). D’autre part, une large variété de

protéases sont également élaborées par les moisissures (RAO et al., 1998; WU et al., 2006).

I.2.2. Succédanés de présure d’origine animale

De nombreuses protéases d’origine animale ont fait l’objet d’expérimentation en vue

d’une potentielle utilisation en fromagerie. Cependant, toutes ne sont pas pour autant aptes à

la fabrication fromagère; seules les pepsines porcines et bovines présentent un intérêt

industriel (ECK, 1987).


5

I.2.2.1. La pepsine bovine

La pepsine bovine (E.C.3.4.23.1) est extraite à partir des caillettes des veaux sevrés.

Elle a un poids moléculaire de 33,4 KD et se compose de deux pepsine I et II (RODNEY et

al., 1988). Elle représente environ 6% de l’activité protéolytique de la présure commerciale et

elle est proche de celle de la chymosine (BARBANO et RASMUSSEN, 1992). Elle est

utilisée en fromagerie en mélange avec la présure à des proportions égales (RAMET, 1997).

I.2.2.2. La pepsine porcine

La pepsine porcine (E.C.3.23.2.) est formée de 321 résidus d’acides aminés. Son poids

moléculaire est de 35 KDa (KAGEYAMA et TAKAHASHI, 1976). Les principaux

inconvénients limitant son utilisation comme agent coagulant de lait sont : la forte

dépendance de son activité de pH. En effet, aux valeurs de pH utilisée en fromagerie (pH 6,5

et T° = 30°C) la pepsine porcine est partiellement inactivée et après une heure elle perd 50%

de son activité (ANDREN, 2002, RODNEY et al., 1988) ainsi que sa forte activité

protéolytique (BRULE et al., 1997).

I.2.2.3. La pepsine de poulet

La pepsine de poulet est une enzyme extraite à partir des proventricules du poulet

(Gallus gallus) considérés comme un sous-produit d’abattage. Ces organes de longueur

moyenne de 3 cm, situé au-dessus du gésier recouvert d’une couche d’épithélium formé de

cellules cylindriques visibles à l’œil nu. Ces cellules sont responsables de la sécrétion de

pepsinogéne et de l’acide chlorhydrique (ALAMAREOT, 1982). La figure 01 représente

l’appareil digestif du poulet, complexe stomacal du poulet et anatomie du complexe stomacal

des Galliacées.

BOHAK, (1969) estime que le pepsinogène de poulet a un poids moléculaire de 43

KDa avec 387 résidus d’acides aminés, alors que la pepsine purifiée a un poids moléculaire de

35 KDa et 308 résidus d’acide aminé. GREEN et LLEWELLIN, (1973), ont confirmé ce

résultat (un poids moléculaire de 34 à 36 KDa).

La pepsine de poulet est sensible au changement de pH. En effet, l’optimum de son

activité est entre pH 1,5 et 4,5. A pH 1,5 elle est active à 90% et elle perd son activité avec

l’augmentation de pH pour atteindre 35% de sont activité maximale à pH 4,5 et reste stable

jusqu’à pH de 8 et elle est totalement inactivée au-delà de pH 8,5, sont pH optimum sur

l’hémoglobine est de 2,8 (BOKAK, 1969). CREVIEU-GABRIEL et al., (1999) ont rapportés


6

que son pH optimal est de 2,5 à 3 sur l’hémoglobine. Le pH optimal de la pepsine de poulet

est de 1 à 1,5 sur les protéines des pois, 1,5 sur le gluten et 2,5 à 3 sur l’hémoglobine

(CREVIEU-GABRIEL et al., 1999). La pepsine garde la majorité de sont activité pendant 24

heures à 37°C et une semaine à 4°C (DONTA et VAN VUKIS, 1970). La pepsine de poulet

est plus protéolytique et moins stable à la chaleur que la chymosine (GORDIN et

ROSENTHAL, 1978).

Figure n° 01 : (A) Appareil digestif du poulet ; (B) Complexe stomacal du poulet ; (C)

Anatomie du complexe stomacal des Galliacées (LARBIER et LECLERCQ, 1992).

En 1973 - 1974, 50% des fromages en Israël sont fabriqués par la pepsine de poulet

(RODNEY et al., 1988). Elle permet la fabrication de fromage cheddar si sa maturation ne

dépasse pas trois mois (FINDLAY et al., 1984). GREEN et al., (1984) l’ont utilisé en

mélange avec la pepsine porcine pour la fabrication de fromage Cheddar. PAEZ DE LEON et


7

al., (1995) l’ont utilisé dans la production de fromage pasteurisé. STANLEY et al., (1980) ;

GREEN et al., (1984) ; FINDLAY et al., (1984) ont signalés que la texture du fromage

Cheddar obtenu par la pepsine de poulet manquait de fermeté et a développé un goût amère

après trois mois de fabrication. Ils ont également signalés, que les rendements fromagère été

plus faible que ceux de la chymosine.

I.2.3. Succédanés d’origine végétale

I.2.3.1. Généralités sur les enzymes d’origine végétale

La coagulation du lait peut venir des pratiques que l’on retrouve dans le monde entier,

par l’emploi, non pas d’acide lactique ou d’enzymes animales, mais d’extraits végétaux

(FROC, 2001). De très nombreuse préparation coagulante sont issues du règne végétal (ECK

et GILLIS, 1997). Ces protéases sont réparties en groupes basés sur le mécanisme catalytique

utilisé pendant le processus hydrolytique. Les principaux types catalytiques sont aspartate,

sérine, cystéine et métalloprotéases (BAH et al., 2006). Les protéases végétales coagulantes

appartiennent aux trois premiers groupes (BRUNO et al., 2006).

L’Espagne et le Portugal ont la plus grande production de variété de fromages en

utilisant l’extrait de Cynara comme agent coagulant (ROSEIRO et al., 2003). Ces extraits

sont utilisé dans la fabrication des fromages portugais Serra et Serpa (MACEDO et al., 1993)

et l’Espagnol de Los Pedroches et La Serena (ROA et al., 1999) et Tortadel Casar ainsi que

le fromage Los Ibores et le fromage Flor de Guía (FERNANDEZ-SALGUERO et al., 1991,

1999 ; SANJUAN et al., 2002). Dans certains pays d’Afrique comme le Nigéria et la

République du Bénin, les extraits de Calotropis procera (pomme de Sodome) sont utilisés

dans la fabrication de fromage Peulh (ROSEIRO et al., 2003). Dans les régions chaudes

plusieurs plantes renferment des principes coagulants telle que la ficine provenant de latex du

figuier, la papaïne issu de papayer et la bromelaine issu du l’ananas (ECK et GILLIS, 1997).

Toutefois, la nature protéolytique excessive de la plupart des coagulants végétales a limitée

leur utilisation dans la fabrication des fromages en raison de rendement fromagère réduit et

des défauts de saveur et de texture (LO PIERO et al., 2002).

I.2.3.2. Cas de l’extrait de ficine

I.2.3.2.1. Généralités sur le figuier

Le figuier dont le nom botanique Ficus carica L., est un arbre à feuilles caduques de la

famille des Moraceae qui comprend environ 1500 espèces classées en 52 genres dont le genre


8

ficus (VIDAUD, 1997 ; SOLOMON et al., 2006 ; RAMEAU et al., 2008 ; NICOTRA et al.,

2010 ; MAWA et al., 2013). Du points de vue systématique, la classification botanique du

figuier comme décrite par GAUSSEN et al., (1982) ; BABY et RAJ, (2011) est la suivante :

Règne Végétal

Embranchement Phanérogames

Sous embranchement Angiospermes

Classe Dicotylédones

Sous classe Hamamélidées

Série Apétales unisexuées

Ordre urticales

Famille Moracées

Genre Ficus

Espèce Ficus carica L.

L’origine de figuier n’est pas déterminé. Selon VIDAUD (1987), le figuier est

originaire de bassin méditerranéen et du moyen orient. VILMORIN, (2003) rapporte qu’il est

originaire d’Asie occidentale, d’Afrique de nord ou des Canaries. Selon FOREST et al.,

(2003) il serait originaire d’ Hawaï. Selon MAWA et al., (2013) il est originaire du Sud-ouest

d'Asie et de la Méditerranée.

Le figuier est une espèce de grande importance commerciale (OLIVEIRA et al,.

2010). Il est cultivé surtout pour ses fruits qui sont une excellente source de minéraux, de

vitamines, de fibres alimentaires et d'acides aminés (VEBERIC et al., 2008 ; SOLOMON et

al., 2006). Traditionnellement, les figues sont utilisées pour leurs vertus médicinales comme

remèdes laxatifs, cardiovasculaires, respiratoires et anti-inflammatoire (GUARRERA, 2005,

BABY et RAJ, 2011).

Figure n° 02 : photo d’un figuier


9

I.2.3.2.2. Le latex

Le latex est un liquide visqueux de couleur blanche, il est largement distribué dans la

plante (KIM et al., 2003). Ce matériel contient divers métabolites secondaires comme les

composés phénoliques et des protéines à savoir les protéases à cystéine (AGRAWAL et

KONNO, 2004). Le latex est constitué de caoutchouc, résine, albumine, sucre et acide

malique, enzymes protéolytiques, diastase, estérase, lipase, catalase et peroxydase (BABY et

RAJ, 2011). Traditionnellement, il est utilisé dans le traitement de la goutte, des ulcères et des

verrues (LANSKY, 2008 ; OLIVEIRA et al., 2010). Il contient une enzyme protéolytique

capable de coagulation de lait et de digérer la caséine (DEVARAJ et al., 2008).

I.2.3.2.3. Localisation et caractéristiques de la ficine (ficain) (EC 3.4.22.3)

Il est connu depuis bien d'années que le latex contient une activité protéolytique. Le

nom ficine a été inventée par ROBBINS (1930) pour la poudre blanche purifiée dotée d’une

activité antihelminthique obtenu à partir de latex de genre Ficus (SINGLETON et al., 2013).

Ficine, est le nom donné pour l’enzyme protéolytique (endopeptidase) isolée à partir

de latex des arbres du genre Ficus. Elle appartient à la famille des protéases à cystéine

(LOWE, 1976 ; NASSAR et al., 1987 ; GRZONKA et al., 2007 ; NOUANI et al., 2009 ;

PAYNE, 2009 ; DEVARAJ et al., 2008, 2011 ; AZARKAN et al., 2011 ; ZARE et al.,

2013 ; SHAH et al., 2014). Les informations disponibles indiquent que la ficine a beaucoup

de propriétés communes avec la papaïne (DEVARAJ et al., 2011).

Le poids moléculaire de la ficine purifiée est compris entre 20 et 35 KDa. Selon

DEVARAJ et al., (2008, 2011) il s'agit d'une seule chaîne polypeptidique ayant un poids

moléculaire de 23,1 KDa. PAYNE (2009) estime que sa masse moléculaire est comprise

entre 25 et 26 KDa. LAWE (1976) et KATSAROS et al., (2008) ont évalués son poids

moléculaire à 25 KDa. Selon DEVARAJ et al., (2008) la ficine est composée de 210 résidus

d’acides aminés. Son site actif est constitué de deux acides aminés qui sont la cystéine (Cys-

25) et l’histidine (His-159) (KATSAROS et al., 2008 ; FEIJOO-SIOTA et al., 2011). Cette

enzyme intervient sur la protéine au niveau de résidus d’acide aminé tyrosine et phénylalanine

(DICTIONARY OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, (2009) ; PAYNE, (2009) ;

WHITEHURST et al., 2010) .

Le fractionnement et la purification par chromatographie échangeuse d’ion a donnée 5

isoformes de ficine (A, B, C, D1 et D2) selon leur ordre de l'élution (AZARKANE et al.,


10

2011 ; DEVARAJ et al., 2008). L’autolyse de la ficine peu donné des peptides qui ont des

poids moléculaires compris entre 14 et 18 KDa (AZARKANE et al., 2011). ZARE et al.,

(2013) ont signalé la présence de 4 isoformes (A, B, C et D).

La ficine présente une grande stabilité thermique. Sa température d’activité est

comprise entre 67 et 77°C (NASSAR et al., 1987). Elle est de 60°C selon FADYLOGLU,

(2001). GRZONKA et al., (2007) ont reportés des température de 45 à 55 °C. FEIJOO-

SIOTA et al., (2011) et BEKHI et al., (2013) l’ont évaluée à 65°C. Selon PAYNE (2009) et

NOUANI et al., (2009) elle est de 82°C. L'activité maximale de la ficine est obtenue dans

une gamme de pH de 5 à 8,5. FADYLOGLU, (2001) a évalué le pH optimal de coagulation à

5. GRZONKA et al., (2007) ont signalé qu’elle est très active dans la gamme de pH de 5 à 8.

Selon DEVARAJ et al., (2011) et FEIJOO-SIOTA et al., (2011) elle est active à des valeurs

de pH comprissent entre 6.5 et 8.5. Cependant, PAYNE (2009) a obtenu une activité

maximale dans la zone de pH 5 à 7.

I.2.3.2.4. Utilisation de la ficine

Les protéases végétales ont été employées depuis les périodes antiques. On indique

que le latex du figuier est utilisé pour la fabrication du fromage et comme un antihelminthique

(FADYLOGLU, 2001; FEIJOO-SIOTA et al., 2011 ; NOUANI et al., 2009 ; SHAH et al.,

2014).). Dans le secteur de la brasserie afin d'obtenir de bonnes propriétés colloïdales à de

basses températures (JONES, 2005). Ou dans le domaine pharmaceutique (FEIJOO-SIOTA et

al., 2011 ; AZARKANE et al., 2011). La ficine est aussi utilisée pour l’attendrissement de

la viande (GRZONKA et al., 2007 ; PAYNE, 2009). En Italie, la ficine est utilisée pour la

fabrication d’un fromage traditionnelle le Cacioricotta (FACCIA et al., 2012). Selon ONER

et AKAR, (1993), la ficine peut remplacer avec succès la chymosine dans la fabrication de

fromage Gaziantep. Traditionnellement, dans les montagnes d’Algérie, particulièrement la

Kabylie, le latex de figuier (ficine brute) est utilisé comme agent coagulant pour la

préparation d’un fromage connu sous le nom AGUGLI ou IGUISSI selon la région.

II. Le lait

II.1. Dénomination légale du lait cru

Le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompu d’une femelle laitière

bien portante bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir

de colostrum. Telle est la définition adapté par le premier congrès international pour la

répression des fraudes alimentaires tenue à Genève en 1908 (VEISSEYRE, 1979). La


11

dénomination "lait" sans indication de l'espèce animale de prévenance est réservée au lait de

vache. Tout lait d'une femelle laitière autre que la vache doit être désigner par la

dénomination lait suivie de l'indication de l'espèce animale dont il provient

(J.O.R.A. N° 69, 2003).

II.2. Composition chimique globale de lait

En général, les constituants principaux du lait sont l'eau, le lactose, les protéines, les

graisses et sels ou cendre; également, le lait contient des constituants mineurs tels que les

vitamines et les enzymes (HUPPERTZ et al., 2006). Les constituants majeurs du lait de

vache sont présentés dans le tableau 01.

Tableau n° 01 : Composition générale du lait de vache (FILION, 2006)

Constituants Teneur du lait en ses constituants en g/l

Constituants minéraux

Eau

Constituants salins minéraux

Gaz dissous

902,0

6,9

0,1

Constituants organiques

Constituants salin

Lactose

Matière grasse

01,7

49,0

38,0

Protéique, ou constituants azoté

Protéique

Caséine

Protéines dites solubles

32

26

06

Constituants azotés non protéiques 1,5

II.2.1. Eau

L'eau représente environ 87 à 88% du poids total du lait. Elle se trouve sous deux formes,

l'eau libre (96%) et l'eau liée (4%) (LUQUET, 1985).

II.2.2. Matière grasse

La matière grasse (MG) est présente dans le lait sous forme de globules gras de dimension

de 0,1 à 10 µm. Essentiellement constituer de triglycérides (98%), phospholipides (1%) et d’une

fraction insaponifiable (1%) constituée en grande partie de cholestérol et de β-carotène. Elle est


12

constituée de 65% d’acides saturés et de 35% d’acide gras insaturés (3% d’acides gras (AG)

polyinsaturés) (VIGNOLA, 2002).

II.2.3. Vitamines

Le lait ne permet pas de satisfaire tous les besoins vitaminiques. Ce sont surtout les

vitamines A, B1 et B2 qui constituent la valeur nutritive du lait (HUPPERTZ et al., 2006).

II.2.4. Glucides

Le sucre le plus abondant du lait est le lactose. C’est le constituant majeur de la matière

sèche du lait (environ 40%). C’est un disaccharide (LUQUET et BONJEAN-LINCZOWSKI,

1986 ; DEBRY, 2001 ; FREDOT, 2005). On peut retrouver d’autres glucides en faibles

quantité tel que le glucose et le galactose qui provient de l’hydrolyse du lactose (VIGNOLA,

2002). Il joue un rôle important, car il est fermenté lors de fabrication de divers produits

laitiers (MAHAUT et al., 2000).

II.2.5. Matières minérales

La quantité des minéraux contenue dans le lait après incinération varie de 0,60 à 0,90%

(VIGNOLA, 2002). Les principaux sont le potassium, le calcium, le chlore, le phosphore, le

magnésium, et le sodium. On note également la présence des oligo-éléments (ALIAS, 1974 ;

HUPPERTZ et al., 2006 ; JEANTET et al., 2008). Ils se trouvent sous deux formes principales,

surtout sous forme de sels ionisés et solubles dans le sérum et sous forme micellaire. Les éléments

basiques majeurs (Ca, K, Mg et Na) forment des sels avec les constituants acides qui sont les

protéines, les citrates, les phosphates et les chlorures (VIGNOLA, 2002 ; MAHAUT et al., 2003).

II.2.6. Matières azotées

On distingue deux groupes de matières azotées dans le lait : la matière azotée protéique et la

matière azotée non protéique.

II.2.6.1. Azote non protéique (ANP)

L’azote non protéique représente en moyenne 5% de l’azote total du lait et se présente

sous forme d’urée, créatine, créatinine, ammoniaque, acides aminés libres, vitamines et

nucléotides. (LUQUET et BONJEAN-LINCZOWSKI, 1986 ; MAHAUT et al., 2003).

II.2.6.2. Azote protéique

Technologiquement, les protéines du lait sont probablement les constituants les plus

importants du lait. La recherche sur des protéines du lait remonte au début du 19ème

siècle. Ils


13

sont probablement les mieux caractérisées de toutes les protéines alimentaires. Les protéines

du lait peuvent être divisées en deux classes selon leurs solubilité à pH 4,6, les protéines

insoluble à pH 4.6 s'appellent les caséines et les protéines solubles à pH 4.6 sont les protéines

de sérum ou les protéines de petit lait (FOX, 2003 ; HUPPERTZ et al., 2006).

II.2.6.2.1. Les protéines de sérum

Les protéines de sérum représentent environ 20% des protéines totales. Elle se trouve

sous forme de solution colloïdale. Les deux principales sont β-lactoglobuline et α-

lactoglobuline, les autres protéines du sérum sont des immunoglobulines, le sérum albumine

bovine (SAB) et la lactoferrine. En plus de ces protéine, des enzymes sont présentes dans le

sérum (WALSTRA et al., 1999 ; VIGNOLA, 2002 ; HUPPERTZ et al., 2006). Le tableau 02

résume la composition protéique de lactosérum de quelques espèces animale.

Tableau n° 02 : proportions relatives des protéines de sérum (g/100g des protéines totales du sérum)

de quelques mammifères (HUPPERTZ et al., 2006).

Bovine Ovine Caprine

β-Lactoglobulin

Albumins

Protease peptone

Immunoglobulines

50

25

13

12

51

25

06

18

39

40

09

12

II.2.6.2.2. Les caséines

Les caséines représentent 80% des protéines totales du lait et se composent de quatre

protéines majeures, les caséines αs1, αs2, β, et la caséine-қ. Leur point isoélectrique est de

4,65 (BRULE et al., 1997 ; JEANTET et al.; 2008). Il existe également une caséine γ qui est

formée par l’hydrolyse de la caséine β par le plasmide. Les micelles de caséines sont

constituées de 92% de protéines et de 8% de minéraux (VIGNOLA, 2002).Il existe plusieurs

variantes génétiques pour les caséines et leur fréquence est plus ou moins importante selon les

espèces (GROSCLAUDE, 1988).

Les caséines sont une classe des phosphoprotéines, dont les propriétés diffèrent

considérablement de la plupart des autres protéines. Elles sont hydrophobes et ont une charge

relativement élevée et contiennent beaucoup de la proline et peu de résidus de cystéine

(HUPPERTZ et al., 2006). Ces protéines possèdent un certain nombre de caractères

communs, la présence de phosphore sous forme de groupements phosphoséryles, leur richesse


14

en certains acides amines (glu, leu, pro) et la forte proportion de résidus apolaires (MAHAUT

et al., 2000). Le diamètre moyen généralement admis est voisin de 180 nm avec une

distribution entre 100 et 500 nm (CAYOT et LORIENT, 1998). On estime que la masse

micellaire est comprise entre 0,5 et 1 × 109 Da. La forme est considérée comme sphérique

mais avec une surface granuleuse la faisant ressembler à une framboise (SCHMIDT, 1982 ;

WALSTRA, 1999). La figure 03 représente une micelle de caséine.

Figure n° 03 : micelle de caséine vue par un microscope électronique (CAYOT et LORIENT,

1998, VIGNOLA, 2002).

A la différence des protéines solubles qui ont une structure globulaire compacte, les

caséines présentent une structure lâche et peu ordonnée ce qui les rend accessible aux

enzymes protéolytiques (SCHMIDT, 1982). Leur constitution diffère entre le centre et la

périphérie, les caséines β et αs1 sont plus présentes au centre de la micelle et forment le cœur

hydrophobe, tandis que la partie externe de la micelle est formée de caséines αs1, αs2 et κ

(VIGNOLA, 2002).

La caséine κ est la seule à présenter des résidus glycosylés liés essentiellement au

niveau des résidus thréonine situés dans la partie C-terminale de la protéine. Cette dernière

forme une chevelure hydrophile, chargée négativement à la surface de la micelle ce qui

augmente sa stabilité (WALSTRA, 1990). De plus, la caséine κ présente une très grande

sensibilité à l'action de la chymosine au niveau de la liaison Phe105-Met106 conduisant à la

libération du glycomacropeptide et de paracaséine κ (MAHAUT et al., 2000, VIERLING,

2003). La figure 04 présente la structure de la micelle de caséine


15

Figure 04 : Structure de la micelle de caséine (WAUGH et al., 1970 ; AMIOT et al., 2002 ;

WALSTRA, 1999)

III. Mécanismes de coagulation

La coagulation du lait avec la présure est la première étape dans la production des

fromages (MEHMET Ak, 2003 ; HUPPERTZ et al., 2006). La transformation du lait en

fromage comporte trois étapes principales : la coagulation, l’égouttage et l’affinage. La

coagulation correspond à une déstabilisation des micelles de caséines. elle peut être provoquer

par acidification, par l’action d’une enzyme ou par l’action combinée des deux (VIGNOLA,

2002, HUPPERTZ et al., 2006). Le tableau 03, résume les différances entre les caillés

obtenus par coagulation acide et par coagulation enzymatique.

Tableau n° 03 : comparaison entre un caillé lactique et un caillé présure (VIGNOLA, 2002).

Paramètres Type de caillés

Lactique Présure

Egouttage Faible Elevé

Teneur en eau Elevé Faible

Teneur minérale Faible Elevé

Pouvoir tampon Faible Elevé

Teneur résiduelle en lactose Elevé Faible

Structure des caséines Etat dissocié Etat micellaire

pH Faible < 4,6 Elevé > 5,00

Type de texture Plastique, fragile Elastique, solide

Durée de conservation Faible (quelques semaines) Elevé (plusieurs mois)


16

III.1. Coagulation acide

Elle consiste à précipiter les caséines à leur point isoélectrique (pHi = 4,6) par

acidification biologique à l’aide des ferments lactiques qui fermentent le lactose en acide

lactique, ou par acidification chimique par injection de CO2, addition de glucono-δ-lactone ou

ajout de protéines sérique à pH acide (MAHAUT et al., 2003). Le gel obtenu par

acidification présente une bonne perméabilité mais une friabilité élevée. Le manque de

structuration du réseau a pour conséquence une élasticité et une plasticité pratiquement nulle

et une faible résistance aux traitements mécaniques (VIGNOLA, 2002 ; JEANTET et al.;

2008).

III.2. Coagulation mixte

La coagulation mixte est réalisée par acidification de lait et adition enzymes

coagulantes. En pratique cette méthode est utilisée pour la fabrication des fromages frais ou

fromages à pâte molle (CHEFTEL et CHEFTEL, 1977 ; WIGLEY, 1996). Le coagulum

obtenu présente des caractères intermédiaires entre ceux de gel lactique et présure. Il est

caractérisé par une souplesse et une élasticité moins grande, une fermeté et friabilité plus

accentuées que celle du gel présure (VEISSEYRE, 1975 ; JEANTET et al., 2008)

III.3. Coagulation enzymatique

La coagulation enzymatique du lait est un processus en trois étapes qui sont : la phase

primaire ou enzymatique, la phase secondaire et la phase tertiaire (DALGLEISH, 1993; FOX

et al., 1996; FOX et McSWEENEY, 1997 ; MAHAUT et al., 2003 ; HORNE et BANKS,

2004). La figure 05 montre les phases de coagulation enzymatique.

III.3.1. Phase primaire

Cette phase dite enzymatique, correspond à une attaque de l’enzyme sur la caséine-κ

(composante qui stabilise la micelle) au niveau de la liaison PHE105-MET106. La chaine

peptidique se trouve ainsi coupée en deux segments, le segment 1-105 est la paracaséine-κ et

le segment 106-169 qui est le caséinomacropeptide (CMP). La paracaséine-κ liée aux caséines

α et β reste intégrée à la micelle hydrophobe et le CMP contenant tous les glucides est libéré

dans le lactosérum. Ce qui entraine une réduction de la charge négative et leurs degrés

d’hydratation (LUCEY, 2002 ; MAHAUT et al., 2003 ; HUPPERTZ et al., 2006).


17

Figure n° 05 : Phases de coagulation de lait et formation de réseau (VIGNOLA, 2002).

III.3.2. Phase secondaire

Cette phase commence dés que 85% de la caséine-κ est hydrolysée (HUPPERTZ et

al., 2006). Elle est dite phase d’agglomération ou d’agrégation ou phase de coagulation

proprement dit (LUCEY, 2002). Durant laquelle la libération du macropeptide de la caséine-κ

sous l’action de l’enzyme entraine la réduction des répulsions électrostatiques entre les

micelles de caséines hydrolysées. L’élimination de ces macropeptides entraine également une

réduction du diamètre hydrodynamique et une perte de la stabilité (WALSTRA et al, 1981 ;

LUCEY et al., 2003).

La nature des interactions intervenant durant cette phase n’est pas encore bien connue

(SCHMIDT, 1982, VIGNOLA, 2002).Toutefois, les ponts calciques et les forces de Van der

Waals ainsi que les interactions hydrophobes semble être impliquées (SCHMIDT, 1982). Les

micelles déstabilisées s’agrège en présence des ions de calcium libres (Ca++

) (LUCEY et

FOX, 1993 ; DALGLEISH et HOLT, 1988). Au début, il ya formation de chaines linaires de

micelles qui continuent de s’agréger pour former des amas. Ces derniers constituent le gel

protéique qui se sépare nettement de lactosérum (LUCEY, 2002).


18

III.3.3. Phase tertiaire

Durant cette phase, les micelles agrégées subissent une profonde réorganisation par la

mise en place de liaisons phosphocalciques et peut être de ponts disulfures entre les para

caséines (MAHAUT et al., 2000; VIGNOLA, 2002 ).

VI. Fabrication des fromages

VI.1. Définition des fromages

Le fromage est le produit affiné ou non de consistance molle, semi-dure, dure ou

extra-dure obtenu par coagulation complète ou partielle de lait. Les propriétés du gel formé

diffèrent selon la nature de l'agent coagulant et le type de fromage. La coagulation peut être

lactique ou enzymatique (VIGNOLA, 2002).

VI.2. Le fromage à pâte molle exemple « Camembert »

VI.2.1. Définition

Le Camembert est un fromage à pâte molle, affiné en surface principalement par des

moisissures. Il se présente sous la forme d’un cylindre plat ou de morceaux cylindrique. La

pâte a une couleur allant du blanc cassé au jaune pâle et une texture molle mais non friable,

affinée de la surface au centre (CODEX STAN, 2010). Le Camembert n’est pas prêt à la

consommation immédiatement après la fabrication. Il doit être maintenu pendant un certain

temps dans des conditions nécessaires pour que s’opère les changements biochimiques et

physiques caractéristiques du fromage (ECK, 1987).

VI.2.2. Technologie de fabrication du Camembert

La transformation de lait en fromage, comporte pour la plus part trois étapes

principales qui sont la coagulation, l’égouttage et l’affinage (VIGNOLA, 2002). Selon

JEANTET et al., (2008) la standardisation de lait précède ces étapes. ECK, (1987) a signalé

le salage avant l’affinage.

VI.2.2.1. La standardisation

La qualité du lait de fromage peut être définie comme l’aptitude à donner un coagulum

permettant d’aboutir dans des conditions normales de travail à un fromage aux

caractéristiques physicochimiques définies et avec un rendement satisfaisant. Le lait présente

une grande variabilité dans sa composition et afin de passer de ses variations l’industriel

standardise les déférents paramètres (taux de protéine, de matière grasse, la teneur en chlorure

de calcium et le pH à des valeurs voulus) (VIGNOLA, 2008).


19

VI.2.2.2. La coagulation

La coagulation correspond aux modifications physicochimiques des micelles de

caséine sous l’action d’enzymes protéolytiques et/ou d’acide lactique ce qui aboutis à la

formation d’un coagulum (ECK, 1990 ; VIGNOLA, 2002 ; JEANTET et al., 2008).

VI.2.2.3. L’égouttage

Cette étape consiste a éliminé de la majorité de lactosérum expulsé par synérèse, qu’il

soit à l’intérieure ou à l’extérieure de gel (ECK, 1990, JEANTET et al., 2008). En pratique

l’égouttage comprend deux périodes, la première est l’égouttage proprement dit ou

l’égouttage principal au cours de la quelle la plus part de lactosérum est éliminé, elle se situe

entre la fin de la coagulation et le démoulage, la seconde est l’égouttage complémentaire,

allant de démoulage à l’affinage. Il est généralement dû au salage (ECK, 1987).

VI.2.2.4. Le salage

C’est une opération d’enrichissement de la pâte en chlorure de sodium (NaCl) à des

doses de 1 à 2% (Eck, 1990). Le salage complète l’égouttage du fromage en favorisant le

drainage du lactosérum. Il apporte ainsi le goût caractéristique du fromage et il agit sur

l’activité de l’eau qui influence le développement des microorganismes (Eck, 2006).

VI.2.2.5. L’affinage

Cette étape correspond à une digestion enzymatique des constituants protéiques et

lipidique du caillé (Eck, 1987 ; JEANTET et al., 2008) ce qui donne aux caillés une texture et

une saveur caractéristique selon le type de fromage (VIGNOLA, 2002). C’est une étape

complexe à cause de la grande hétérogénéité physicochimique dans la matrice fromagère et le

type d’enzymes intervenant dans cette étape qui peuvent avoir différents origines, il peut

s’agir d’enzymes endogènes du lait (plasmide, lipase, etc.), ou ajoutés au lait au cours de

fabrication ou produites au cours de l’affinage (MAHAUT et al., 2003).

L’affinage est dominé par des phénomènes biochimiques qui sont : la fermentation du

lactose résiduel et consommation de lactate, l’hydrolyse de la matière grasse et des protéines

et la production d’arôme (JEANTET et al., 2008). La figure 06 représente le diagramme

général de fabrication de fromage à pâte molle type « Camembert ».


20

Figure n° 06 : Diagramme générale de fabrication de fromage a pâte molle type camembert

(JEANTET et al., 2008).

Camembert

Lait entier crus

Maturation chaude 33-37°C/30-90min

Prématuration 10-12°C/ 15-20h

Standardisation (MG : 2,8-3,2%,

MP : 3,1-3,6%, Ca²+

: 0,03 g/l)

Thermisation (65°C/15s)

Pasteurisation 70°C/15-20 sec

Décaillage (1,5-2cm²)

Moulage

Coagulation (45min)

Affinage (10 - 11 jours12 - 15°C, HR

95-98 %)

Salage (sel sec ou saumure)

Démoulage (J+1) pH 4,7 - 5,1

Ferments mésophiles mixtes et

protéolytique

Crème

Ferments méso- et thermophiles

Ajustement pH

Emprésurage 25 à 25 ml/ 100 l

Brassage (1 à 3 selon synérèse)

Soutirage sérum (20 à 30%) Retournement

Refroidissement jusqu’à 20°C

Ressuyage (1 jours, HR=85%)

Écrémage


21

VI.3.Les défauts des fromages

VI.3.1. Défauts de texture

Ils sont dus aux défauts d’égouttage. Fromage à pâte sèche où fromage est dit plâtreux.

C’est le résultat d’un affinage insuffisant provoqué par un égouttage très poussé. Fromage à

pâte collante, lorsque l’égouttage est insuffisant, le caillé très humide est le siège d’un

développement excessif de la flore protéolytique entraînant une digestion prononcée de la

caséine. Ou fromage gonflé où la pâte a l‘aspect d’une éponge (VEISSEYRE, 1975 ;

MAHAUT et al., 2003).

VI.3.2. Défauts d’aspect et de croûtage

La présence de certains microorganismes indésirables peut entrainer des défauts de

présentation et parfois une altération de la texture et de la croute (MAHAUT et al., 2003).

L’accident du « bleu » caractérisé par l’apparition à la surface de taches bleuâtres ou verdâtres

provoquées par Penicillium glaucum ou de Penicillium requiforti (BOTTON et al., 1990 ;

MAHAUT et al., 2003). « Graisse » ou « Peau de crapaud », l’agent responsable de ce défaut

est Géotrichom candidum qui fait partie de la flore normale de nombreux fromages (pâte

molle), son développement peut devenir trop important lorsque la température de l’égouttage

est trop élevée et le salage est insuffisant. La surface du fromage devient glaiseuse et jaunâtre

avec une fente de protéolyse (DESFLEURS, 1980 ; MAHAUT et al., 2000, 2003).

VI.3.3. Défauts de saveur et d’arôme

Goût d’amertume, est un défaut de saveur relativement fréquent dans divers types de

fromage notamment les pâtes molles. Le défaut peut avoir plusieurs origines, mais il est le

plus souvent dû à l’accumulation de peptides de petites tailles qui proviennent de la

protéolyse. La formation des peptides amers dans les fromages au cours de la maturation est

inévitable (BARS-BAILLY et al., 1979; MAHAUT et al., 2003 :ECK, 2006). Goût de rance,

apparaît lorsqu’il y a une lipolyse excessive donnant naissance à une quantité élevée d’acides

gras libres à chaînes courtes et moyenne (C4 et C12) (MOLLIMARD et al., 1997; MAHAUT

et al., 2003).

Matériel et

méthodes

Matériel et méthodes

22

I.1. Matières premières

I.1.1. Le lait

Le lait utilisé est un lait écrémé en poudre, de qualité moyen chauffage (SOLAREC

S.A. ; Belgique). Cette poudre est importée par l’ONIL-Algérie (Office National

Interprofessionnel du Lait).

Il est reconstitué par dissolution de 12g de poudre de lait écrémé dans 100 ml d’une

solution de chlorure de calcium 0,01M. Il est appelé substrat standard de Berridge

(BERRIDGE, 1955. LIBOUGA D.G, 2008 ; BENYAHIA-KRID et al., 2010). L’azide de

sodium (0,04% p/v) est ajouté pour éviter le développement des microorganismes. Le

substrat standard de Berridge est conservé à 4°C pendant 12 h pour de permettre l’équilibre

physico-chimique.

La poudre du lait utilisée provient du même lot et conservée à température ambiante et

à l’abri de la lumière et de l’humidité.

I.1.2. La présure

La présure utilisée est une présure commerciale présentée sous forme de poudre

(Rhodia food, Marshall TM, France) de force 1/100.000 à 520 mg de chymosine /1 g de

présure. La poudre de présure est conservée à 4°C. A partir de celle-ci, nous avons préparé

une solution mère par reconstitution à 1 g de poudre dans 100 ml d'eau distillée. Cette

solution est conservée à 4°C durant 3 jours maximum. Lors de chaque utilisation nous avons

procédé à des dilutions dans de l’eau distillée à partir de la solution mère d’une façon à avoir

un temps de floculation à 30°C compris entre 12 et 15 min.

I.1.3. La ficine

I.1.3.1. Récupération du latex

La matière première végétale utilisée dans cette étude est le latex du figuier (Ficus

carica L.) qui est le liquide blanc visqueux qui s’échappe des feuilles et des fruits quand ils

sont séparés des tiges ou quand les jeunes tiges sont cassées. Le latex est récupéré durant la

période qui s’étale de la fin de mois de mai jusqu’au mois de septembre dans la région de Tizi

Ougeni, Adekar (Wilaya de Bejaia), la variété de figuier visée est « Melloui».

Dans le but de caractériser l’extrait brut coagulant du figuier, le latex est récupéré dans

des flacons propres et protégé de l’air pour prévenir l’oxydation des constituants ainsi que la

prise en masse des gommes de latex. Après que les fruits ou les feuilles sont arrachées ou les


23

jeune rameaux cassés, deux à trois gouttes de latex s’échappent et sont directement récupérées

dans un flacon propre conservé au réfrigérateur (4 à 8°C) jusqu’à extraction de système

enzymatique. Le volume total de latex récupéré pour cette étude est d’environ 200 ml.

I.1.3.2. Extraction de la ficine

Le latex est soumis à une centrifugation de 3200 g pendant 15 min à une température

de 4°C, pour l'élimination de la gomme (RIFAAT et al., 1970; MAMORU S. et al., 1974 ;

ONER et AKAR., 1993 ; FADYLOGLU, 2001 ; LOW et al., 2006 ; NOUANI et al.,2009).

Le surnageant, qui contient l’extrait brut de l'enzyme, est ajusté à pH 5 par utilisation de

l'acide chlorhydrique à une concentration de 2M et maintenu à -18° C jusqu'à utilisation.

I.1.4. La pepsine

I.1.4.1. Préparation des proventricules de poulet

Les proventricules utilisés ont été récupérés de l’abattoir « El-nour » situé dans la

région El-Menia (Constantine). Après abattage, déplumage et éviscération, les proventricules

sont séparés du tube digestif de poulet, débarrassés de la matière grasse qui les entoure, puis

transportés dans une glacière. Au laboratoire, les proventricules, sont ouverts par incision

longitudinale et vidés de particules alimentaires adhérentes aux parois. Après lavage et

égouttage, ils sont repartis en lots de 100g environ, emballés dans des feuilles d’aluminium

puis conservés au congélateur (environ – 18°C) jusqu'à utilisation.

I.1.4.2. Extraction de la pepsine de poulet

L’extraction de la pepsine est réalisée en suivant le protocole d’extraction proposé par

BOHAK, (1970) cité par BENYAHIA-KRID et al., (2010) et NOUANI et al., (2011), les

principales étapes sont présentées en figure 07.

Les proventricules décongelés, sont hachés à l’aide d’un hachoir ménager à couteaux

(KENWOOD). Les proventricules hachés sont versés dans une solution saline de macération

(30 g/l de NaCl et 7 g/l de NaHCO3), à raison de 300 ml de la solution de macération pour

100 g des proventricules hachés (VALLES et FURET, 1977 ; BENYAHIA-KRID et al.,

2010 ; NOUANI et al., 2011).

Après 3 Heures de macération sous agitation, le pepsinogène est activé par

acidification à l’aide d’une solution d’HCl 3N jusqu’à pH = 2 (GLICK et al., 1989).


24

Figure n° 07: Diagramme d’extraction de la pepsine de poulet selon BOHAK (1970).

Le mélange est maintenu à température ambiante pendant 15 minutes, pour faciliter

l’élimination ultérieure de mucilages en provoquant leur floculation; ce qui facilitera la

clarification. Ce mélange qui représente l’extrait brut de pepsine de poulet, est filtré sur une

gaze et le retentât est éliminé, le filtrat est enfin centrifugé à une force centrifuge de 3200g

pendant 30 min à 4°C dans une centrifugeuse (SEGMA model 3-30K, Allemagne). Le

surnageant obtenu, représentant l’extrait d’enzyme clarifié est récupéré, puis ajusté à pH 6,4

par une solution de NaOH 3N et conservé à – 18 °C (congélation) jusqu’à utilisation. Le

culot qui représente le mucilage et les débris des tissus est éliminé.

Conservation (Congélation)

300 ml de la solution de

macération (3% NaCl,

0,7% NaHCO3)

Retentât (débris de tissus)

Décongélation des proventricules à T°C ambiante

Hachage (Hachoir KENWOOD)

Macération sous agitation

(3h, à température ambiante 20 à 25 °C)

Filtration sur gaze

(Pepsinogéne, pH 7,9 à 8)

Activation à pH = 2 et repos de 15 min à

température ambiante (pepsine)

Clarification par centrifugation

(3200g, 30 min à 4°C)

Mucilage (culot)

HCl 3N

Pepsine clarifiée pH 2

NaOH 3N

Ajustement de pH à 6,4


25

I.2. Caractérisation du lait

I.2.1. Détermination du pH de lait reconstitué (substrat de Berridge) (AFNOR 1993)

Le pH représente l’acidité de lait à un moment donné et nous renseigne sur l’état de

fraîcheur du lait, c’est une mesure de l’activité des ions H+ dans une solution dont le but est

de déterminer quantitativement l’acidité ou la basicité de celle-ci.

Mode opératoire

Le pH est déterminé directement en utilisant un pH-mètre électronique qui affiche la

valeur sur son écran après avoir plongé son électrode dans un bécher contenant l’échantillon

de lait. Cet appareil doit être étalonné avec deux solutions tampons à pH 7 et 4 (HANNA

instruments, Roumanie).

Expression des résultats

La valeur de pH s’affiche sur l’écran de l’appareil, la mesure est réalisée avant chaque

utilisation de lait.

I.2.2. Détermination de l’acidité titrable

L’acidité titrable exprime le nombre de grammes d’acide lactique présent dans un litre

de lait. Elle consiste en une neutralisation par la soude (N/9) des composants acides du lait en

présence d’un indicateur coloré qui est la phénolphtaléine. L’unité conventionnelle de

l’acidité est le degré dornic ou 1°D représente 0,1 g d’acide lactique par litre de lait (AFNOR

1993).

Mode opératoire

Introduction de 10 ml de lait reconstitué dans un bécher, ajout de 2 à 3 gouttes de

phénolphtaléine puis titration avec la soude (NaOH 0,1N) jusqu’à apparition de la coloration

rose pâle qui persistera pendant 10 secondes. Détermination du volume de NaOH utilisé pour

la neutralisation.

Expression des résultats

L’acidité est exprimée en gramme d’acide lactique par litre de lait, selon la formule

suivante : acidité = 10 (V/V1) 0,9

V : volume de soude utilisée ;

V1 : volume de la prise d’essai.


26

II.2.3. Extrait sec total (EST)

La matière sèche est le produit résultant de séchage par un humidimètre infrarouge

(SARTORIUS AG, Cottinen, Allemagne) de 1 ml du lait à une température de 105 °C jusqu’à

poids constant. Elle est exprimée en pourcentage de matière sèche pour 1 ml de lait

reconstitué ou pour 1 g de poudre de lait.

Mode opératoire

Placer la capsule en aluminium sur la balance qui se trouve à l’intérieur de la chambre

chaude du dessiccateur. Déposer 3 ml de substrat de Berridge (3 g pour la poudre de lait) et

bien étaler à l’aide d’une spatule. La dessiccation démarre juste après fermeture du couvercle.

Lecture

L’appareil affichera le résultat en pourcentage d’humidité. La mesure est réalisée trois

fois est le résultat est présenté sous forme d’une moyenne avec un écart type.

I.3. Caractérisation de l’extrait enzymatique

I.3.1. Teneur en protéines

La teneur en protéines de l’extrait enzymatique brut est déterminée selon la méthode

classique de LOWRY et al., (1951). Cette méthode est basée sur un procédé en deux étapes,

la première est la réduction de cuivre (Cu2+

en Cu+) par les protéines dans une solution

alcaline, la deuxième est la réaction au réactif de Folin-Ciocalteu ce dernier, à base de

phosphomolybdates et de phosphotungstates réagit avec les acides aminés tyrosine et

tryptophane et à moindre degré avec la cystéine et l’histidine pour donner une coloration bleu

caractéristique avec des maximum d’absorbance à 750 nm (NOBLE et BAILY, 2009)

Réactifs et solutions

- Solution (A): solution de Na2 CO3 anhydre à 2 % (P/V) dans Na OH à 0,1 N.

- Solution (B): 2 ml de Cu SO4. 5H2O à 0,5 % + 2 ml de tartrate de Na + K à 1

%. (Solution stable une journée).

- Solution (C): 50 ml (A) + 1 ml (B).

- Solution (D): réactif de Folin-Ciocalteu commercial dilué à 1/2 dans de l’eau

distillée.


27

Protocole expérimental

Pour 200 µl de l’extrait enzymatique dilué, 1ml de la solution réactive (C) est ajouté,

homogénéisé immédiatement avec un vortex (VELP SCIENTIFICA, Europe). Après 10

minutes de repos à l’obscurité et à température ambiante, 100 µl du réactif de Folin-Ciocalteu

dilué au ½ dans de l’eau distillée est ajouté; après agitation on laisse incuber 30 minutes à

l’obscurité ; l’absorbance est par la suite mesurée au spectrophotomètre (SECOMAM, Prim,

France) à 750 nm.

Pour déterminer la quantité des protéines totales contenues dans l’extrait enzymatique

des solutions de sérum albumine bovine (SAB) de concentration variant entre 0 et 200 μg/ml

ont été utilisée pour la courbe d’étalonnage (figure 08 A). Pour mesurer son activité

protéolytique (dosage des produits d’hydrolyse) la courbe d’étalonnage est tracée par

utilisation de concentrations variant entre 0 à 100 μg/ml de tyrosine (figure 08 C). Une courbe

d’étalonnage est tracée en utilisant la caséine à des concentrations variant de 0 à 100 μg/ml

pour le dosage des protéines dans l’étude des interactions impliquées dans la formation de

différents gels et le taux de protéines dans les fromages (figure 08 B).

I.3.2. Activité coagulante

L’activité coagulante s’exprime par la rapidité avec laquelle l’enzyme coagule le lait ;

elle est déterminée par mesure du temps de floculation selon la méthode de BERRIDGE

(LIBOUGA et al., 2006). Le temps de floculation est l’intervalle de temps compris entre

l’addition de l’extrait enzymatique et l’apparition des premiers flocons de caséines visibles à

l’œil nu.

L'unité d'activité coagulante (U.A.C.) ou l’unité présure est définit par la quantité

d'enzyme contenue dans 1ml de la solution enzymatique qui peut coaguler 10 ml de lait

(substrat standard de Berridge : 12% p/v de lait écrémé en poudre dissout dans une solution de

CaCl2 0.01M) en 100 sec à 30°C (ALAIS, 1974 ; RAMET, 1997). L’activité coagulante est

calculée par la formule suivante :

Où : V: volume du lait ;

V': volume de l'extrait enzymatique ;

T : temps de floculation.


28

Figure n° 08 : Courbes étalons obtenues avec : A : BSA ; B : Caséine et C : Tyrosine.

y = 0,0022x

R² = 0,9739

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 50 100 150 200 250

DO

à 7

50 n

m

SAB µg/ml (A)

y = 0,0034x

R² = 0,9793

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 20 40 60 80 100 120

DO

à 7

50 n

m

Caséine µg/ml (B)

y = 0,0119x

R² = 0,9704

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120

DO

à 7

50 n

m

Tyrosine µg/ml (C)


29

Le procédé consiste à ajouter 1 ml d’extrais enzymatique à un volume de 10 ml de

substrat de Berridge dans un tube à essai porté à 30°C dans un bain Marie puis noter le temps

de floculation. Le tube immergé est maintenu incliné, de telle sorte que le niveau de l’eau soit

au-dessus de celui du lait. Il est régulièrement animé d'un mouvement rotatif autour de son

axe. Le lait forme ainsi un film mince et homogène. Au moment de la floculation, des petits

flocons apparaissent au sein de ce film : c’est le temps de floculation.

I.3.3. Force coagulante

L’activité coagulante peut être également exprimée en force coagulante de Soxhlet

(TSOULI, 1979 ; NOUANI et al., 2009). Cette force coagulante définit le volume de lait

coagulé par unité de volume de l’extrait enzymatique ou d’une enzyme, en 40 minutes, à

35°C et pH 6,4 du substrat (lait).

La force coagulante est exprimée par la formule suivante :

F : Force de l’enzyme (Soxhlet) ;

V : Volume du lait ajusté (pH : 6,4, T° :35°C) ;

v : Volume de la solution enzymatique ;

T: Temps de coagulation du lait (en secondes) ;

Temps standard du test = 2400 secondes (40 min).

Nous avons procédé de la même manière que pour la détermination de l’activité

coagulante sauf que les tubes sont maintenus pendant 30 minutes à 35°C au bain Marie pour

la stabilisation du lait. Le temps de coagulation correspond au temps qui sépare le moment de

l’emprésurage (ajout de l’extrait enzymatique) et la formation de gel (coagulation du lait).

I.3.4.Activité spécifique

L’activité spécifique est exprimée par le rapport entre l’activité coagulante de l’extrait

enzymatique et le taux de protéines de cet extrait. Ce rapport nous renseigne sur le niveau de

pureté de la solution recherchée (NOUANI et al., 2009).

I.3.5. Activité protéolytique

L’activité protéolytique de l’extrait enzymatique est déterminée selon la méthode de

GREEN et STACKPOOLE, (1975). Cette mesure permet d’évaluer le taux de dégradation du

substrat (caséine) par l’enzyme pendant la phase primaire (phase enzymatique). Pour cela,


30

nous avons mesuré la concentration des produits d’hydrolyse de la caséine, solubles dans

l’acide trichloracétique (TCA) à 12% concentration finale.

L’addition de TCA dans le milieu réactionnel stoppe la réaction et une filtration

permet de séparer le précipité de caséine et les produits d’hydrolyse solubles.

Les résultats s’expriment en µg d’équivalent tyrosine par ml d’extrait enzymatique

(FEDERICI, 1982), par référence à une courbe d’étalonnage établi à partir de concentration

en tyrosine variant de 10 à 100 µg/ml (figure 08 : C).

Mode opératoire

Deux millilitres de la solution de caséine à 1% dans le tampon acétate de Na de pH =

5,2 sont additionnés de 1ml de l’extrait enzymatique dilué. Le mélange réactionnel ainsi

préparé est incubé pendant 10 min à 35°C. Après incubation, la réaction enzymatique est

arrêtée par addition de 5 ml de solution trichloracétique (TCA) à 19%, après un temps de

repos de 15 minutes, les produits d’hydrolyse sont séparés par centrifugation à 6200g pendant

10 minutes, le culot est éliminé et le surnagent est récupéré pour estimer la quantité des

produits d’hydrolyse par la méthode de Lowry. Les activités protéolytiques des extraits de

ficine et de pepsine sont comparées à celle de la présure.

I.3.6. Profil électrophorétique

Pour déterminer les poids moléculaire des constituants des extraits enzymatiques, un

kit de protéines de référence est utilésé (68 KDa, 66 KDa et 36 KDa). Dans notre travail nous

avons utilisé l’électrophorèse SDS-PAGE selon le protocole décrit par LAEMMELI (1970).

Le sodium dodécyl sulfate (SDS) de formule CH3-(CH2)11-SO3-Na

+est un détergent

anionique qui se fixe aux protéines et leurs confère ainsi une charge globale négative. Si ces

dernières sont mises dans ces conditions sous un champ électrique, elles ne pourront se

séparer que sur la base de leur taille et leur forme, autrement dit selon leurs poids moléculaire

(PM).

La séparation est conduite selon la méthode de LAEMMELI et FAVRE (1973), qui se

base sur un système biphasique, un gel de concentration sur un gel de séparation où les

concentrations d’acrylamide et son co-monomère, le NN’, méthylène bis acrylamide, sont

définies par les paramètres T et C

T= ((a+b)/v).100% C = (b/a+b).100%


31

Où a : acrylamide (g) ; b : bis acrylamide (g) ; v : volume de la solution (g).

I.3.6.1. Préparation des échantillons

La préparation de l’échantillon consiste à dénaturer les protéines dans une solution de

dénaturation dont la composition : 37,84 g/l de Tris-HCl, 0,14 g/l d’EDTA (ethylenediamine-

tetraaciticacid), 23,2 g/l DTT (DL-Dithioreitol), 75 g/l de SDS, 0,5g/l de Bleu de

bromophénol et 250 g/l de glycérol, son pH est ajusté à 6,8 par ajout de HCl.

A 60 μl de chaque échantillons, sont ajouté 15 μl de tampon de dénaturation . Les

échantillons sont ensuite chauffés dans un bain Marie à une température de 90°C pendant 5

minutes afin d’accélerer la dénaturation, puis sont conservés au congélateur jusqu’à

utilisation.

I.3.6.2. Dépot, migration et révélation des protéines

Déposer 15 µl de chaque échantillon dans le gel polymérisé. Remplir la cuve de

migration par le tampon de migration qui se compose de : 25 mM de Tris, 192 mM de glycine

et 0,1%de SDS, son pH est ajusté à 8,3. La migration se produit sous une tension de 90 volts

pendant 15 à 20 min. Ensuite elle se poursuit à 140 volts pendant 2 à 3 heures.

A la fin de la migration, le gel est démoulé et mis dans une solution de fixation (30 %

éthanol et 5 % acide acétique) pendant 30 minutes. Le gel est ensuite coloré (solution de 40%

de l’éthanol, 10 % d'acide acétique et 2,9 mM du bleu de Coomassie R 250) pendent 2 heures

sous agitation. Enfin, une décoloration du gel par des lavages successifs est effectuée sous

agitation dans la solution de décoloration, qui a déjà servie pour la fixation.

I.4. Détérmination des conditions optimales d’activité des extraits de ficine et de pepsine

I.4.1. pH optimal

Le pH a une forte influence sur l’activité enzymatique et par conséquent sur le temps

de floculation du lait (RAMET, 1997 ; HUPPERTZ et al., 2006 ).

Pour étudier l’effet du pH sur l’activité coagulante de l’extrait enzymatique, le pH du

lait (substrat de Berridge) est ajusté aux valeurs suivantes: 5 ; 5,5 ; 6,0 ; 6,2 ; 6,4 ; 6,6 ; 6,8 ;

7,0 par addition d’une solution d’HCl ou de NaOH 1N. Le choix de cet intervalle de pH est

basé sur le fait qu’à des valeurs de pH inférieur à 5 la coagulation peut devenir une

coagulation acide. L’augmentation du pH à des valeurs supérieures à 7,0 peut provoquer

l’inactivation de la protéase employée. L‘activité coagulante est mesurée pour chaque valeur


32

de pH en U.A.C. /ml. La valeur de chaque activité coagulante correspond à la moyenne de

trois essais.

I.4.2. Température optimale

L’influence de la température d’incubation du lait sur l’activité coagulante de l’extrait

enzymatique est déterminée dans un intervalle de température allant de 30 à 80 °C en fixant la

température aux valeurs suivantes : 30 ; 35 ; 40 ; 45 ; 50 ; 55 ; 60 ; 65 ; 70, 75, 80.

Le choix de ces températures est justifié par le fait que la coagulation du lait en

fromagerie s’effectue à des températures supérieures à 30°C, mais à partir de 70°C l’extrait

enzymatique risque d’être inactivé (RAMET, 1985). Pour les extraits d’origine végétale, cette

température est insuffisante pour les inactiver (thermorésistantes) ce qui nous a poussé à

utiliser des températures plus élevées pour déterminer l’optimum d’activité.

L‘activité coagulante mesurée pour chaque valeur de température est donnée par la

moyenne de trois essais répétés et tous les essaies sont réalisés dans les mêmes conditions de

pH et de concentration en CaCl2.

I.4.3. Concentration du lait en CaCl2

Afin de déterminer la concentration en CaCl2 qui permet d’obtenir le meilleur temps

de floculation, nous avons fait varier les concentrations de lait en CaCl2 dans la gamme

suivante: 0,005M, 0,01M, 0,02M, 0,03M, 0,04Met 0,05M. Le temps de floculation est mesuré

pour chaque concentration, dans les mêmes conditions de pH et de température.

I.5. Etude des interactions impliquées dans la formation du coagulum

La méthode utilisée est celle décrite par LEFEBVRE-CASES et al., (1998) ;

BOUGHELLOUT, (2007) ; BENYAHIA-KRID et al., (2010) ; ZIKIOU, ( 2013). Le principe

est basé sur la destruction des interactions impliquées dans la formation et le maintien des

structures des gels par des agents dissociants : Sodium dodecyl sulfate (SDS), urée, et acide

éthyle diamine tétra acétique (EDTA)

L'urée dénature la protéine en rompant les liaisons hydrogènes intramoléculaires. Les

détergents ioniques tels que le SDS sont incapables de détruire les liaisons hydrogènes des

peptides qui stabilisent la structure secondaire des protéines. Cependant, le SDS réagit avec

les groupes chargés des chaînes latérales des protéines provoquant ainsi des répulsions

électrostatiques intramoléculaires conduisant à une destruction compétitive des interactions


33

hydrophobes. L'EDTA est utilisé comme agent chélateur du calcium et permet d’estimer

l’importance des liaisons calciques.

Le lait destiné à l’étude des interactions est maintenu à 30°C pendant 2 heures pour

s’équilibrer, puis la présure, la ficine ou la pepsine est additionnée (1 ml de la dilution qui

donne un temps de floculation de 15 min pour 10 ml de lait), après un temps de floculation de

15 min, suivi de 15 min supplémentaires, le gel formé est dilué avec la solution dissociante à

raison de 1/5 (4ml de gel dans 16ml de l’agent dissociant). Pour l'échantillon témoin, le gel est

dilué dans de l’eau distillée. Les échantillons sont ensuite homogénéisés rapidement à l'aide

d'un Polytron (KINEMATICA AG. PT 2100. SUISSE) pendant 30 secondes à 20000t/min.

Les dispersions de gel ainsi obtenues sont ensuite ultra centrifugées à 26000g pendant 90

min. Le surnageant est délicatement récupéré et stocké à 4°C jusqu'à analyse.

Les protéines libérées dans le surnageant sont estimées par dosage de Lowry, en se

référant à une courbe d’étalonnage de la caséine (figure 08. B). Pour chaque type d’agent

dissociant nous avons procédé à trois répétitions, les résultats seront exprimés en moyenne

suivi de l’écart type. Le niveau de signification des différences de l’effet de chaque agent

dissociant par type de gel sera étudié par une analyse de la variance (ANOVA).

I.6. Essai de fabrication d’un fromage à pâte molle type « Camembert »

Les extraits enzymatiques étudiés : ficine et pepsine de poulet ont été utilisés comme

succédanés de présure et ce pour tester la faisabilité de préparation d’un fromage à pâte molle

type « Camembert ».

Cet essai est réalisé au niveau de la laiterie SAFILAIT de Ain Smara wilaya de

Constantine.

I.6.1. La technologie de fabrication de Camembert au niveau de SAFILAIT

Le lait frais collecté est refroidi à 4°C et stocké dans des tanks isothermes. Il est

pasteurisé à une température de 72 °C pendant 15 à 20 secondes, puis maintenu à une

température de 36 °C environ, enrichi en calcium par ajout d’une solution de CaCl2. Il est

ensemencé par les ferments lactiques (d’acidification) et ferments d’affinage. Après une

période d’incubation de 30 minute environ, les ferments abaissent le pH par fermentation du

lactose et production d’acide lactique et le pH requis est atteint (pH = 6 à 6,4 et une acidité de

20°D).


34

Le lait ainsi enrichi et acidifié est réparti dans des bassines de 100 litres, une quantité

de présure (35 ml environ) suffisante pour donner un temps de coagulation d’environ 10

minute est versée au préalable dans les bassines. Deux d’entre ces bassins contenant 50 litres

de lait chacune, sont ensemencées par l’extrait de ficine pour la première et l’extrait de la

pepsine pour la deuxième, les quantités d’extrait ajoutées ont été fixées pour donner un temps

de coagulation proche de celui fixé par la laiterie (environ 10 min).

Après coagulation, le caillé est tranché verticalement et horizontalement pour former

des cubes de 1 cm3 environ en s’assurant à chaque fois de la libération des surfaces

périphériques des récipients et cela pour activer la synérèse (diffusion de lactosérum).

Le tranchage est suivi d’un brassage qui consiste à mélanger le caillé pour activer la

synérèse et permettre au lactosérum de remonter à la surface et au caillé de précipiter. Nous

avons réalisé 2 à 3 brassages selon le caillé, jusqu'à libération de 30 à 40 % du volume total de

lactosérum qui sera éliminé. Cette étape est suivie d’un moulage et d’un égouttage qui

consiste à verser le caillé dans des moules de forme ronde pour permettre l’égouttage ou la

diffusion du lactosérum, donc le durcissement de la pâte. Après 30 minutes de moulage, nous

avons effectué le premier retournement, suivi de deux retournements après 8 et 16 heures de

fabrication, enfin le démoulage après 24 heures de fabrication, puis saumurage (320 g NaCl/l

d’eau), le fromage salé est affiné dans un hâloir conditionné par deux paramètres principaux :

une humidité relative de 90 à 95 % et une température de 12 °C pendant huit jours, ce qui

permet le développement de Penicillium camembertti sur la pâte et donne la couleur blanche

caractéristique de la croûte. Durant l’affinage, le fromage subit des retournements au

quotidien pour permettre l’obtention d’une croûte homogène. Afin d’estimer l’influence de

nos extraits coagulants sur l’évolution de la texture, la protéolyse et caractéristiques

organoleptiques du fromage type Camembert, nous avons comparé avec le fromage témoin

fabriqué par l’unité en utilisant la chymosine microbienne.

La figure 09 présente le diagramme de fabrication au niveau de l’unité fromagerie de

SAFILAIT.


35

Figure n° 09 : diagramme de fabrication au niveau de l’unité fromagerie de SAFI

LAIT.

Remarque

Pour l’emprésurage, nous avons utilisé la présure microbienne pour les fromages

témoins (18 ml/50 l), la ficine (7 ml/50 l) et la pepsine de poulet clarifiée (50 ml/50 l)

pour les fromages testés.

Commercialisation

Lait cru

Refroidissement (4°C)

Refroidissement à 30°C et enrichissement avec le CaCl2

Ensemencement par des ferments lactiques et ferments d’affinage

Emprésurage

Coagulation (temps de prise + 2 fois temps de prise = 30 min)

Tranchage, brassage, moulage et égouttage

Démoulage (après 24 h de fabrication)

Affinage (HR 95%, T°C 12° / 8 jours)

Conditionnement et stockage (4°C)

Saumurage (Salage) (320 g NaCl/l)

Pasteurisation (72 °C, 20 à 25 secondes)


36

I.6.2. Analyses physicochimiques de lait utilisé pour la fabrication du fromage

I.6.2.1. Détermination du pH (AFNOR, 1993)

La détermination de pH est réalisée de la même manière que pour le substrat de

Berridge.

I.6.2.2. Acidité titrable (AFNOR, 1993).

La détermination de l’acidité titrable est réalisée de la même manière que pour le

substrat de Berridge

I.6.2.3. Extrait sec total (EST)

La détermination de l’EST est réalisée de la même manière que pour la substrat

de Berridge.

I.6.2.4. La densité (NA n° 2787, 1993)

La densité d’un liquide est le rapport entre la masse volumique de ce liquide et

celle d’un même volume d’eau à 15°C.

Mode opératoire

À l’aide d’un thermo lactodensimètre que l’on plonge dans une éprouvette contenant le

lait, la densité est lue sur le ménisque formé par le lait et la température est directement lue sur

la partie graduée. La densité relevée peut être corrigée, si la température du lait est différente

de 15°C par la formule suivante valable pour une mesure faite entre 10 et 20 °C :

D = d + 0,2 (T° - 15°C)

D : densité corrigée, d : densité brute, T° : température

I.6.2.5. Teneur en matière grasse (méthode de Gerber. ISO : 3433-2002).

La matière grasse du lait est déterminée par la méthode de Gerber ou méthode

acidobutyrometrique

Principe

Le principe est la séparation de la matière grasse du lait par centrifugation, dans un

butyromètre, après avoir dissous les protéines du lait par l’acide sulfurique. La séparation de

la matière grasse est favorisée par l’addition d’une petite quantité d’alcool iso-amylique.

Mode opératoire

Introduire 10 ml d’acide sulfurique dans le butyromètre (de densité 1,813–1,825) puis

ajouter 10 ml de lait bien agité. Verser à la surface 1 ml d’alcool iso-amylique. Boucher le


37

butyromètre et agiter jusqu'à dissolution complète. Le butyromètre est ensuite placé dans une

centrifugeuse (1200 t/min) pendant 5 min et à une température de 65°C. Deux phases

apparaissent : l’une foncée et l’autre claire. Cette dernière représente la quantité en

pourcentage de matière grasse dans le lait qu’on peut lire sur l’échelle graduée du

butyromètre.

I.6.2.6.Extrait sec dégraissé (ESD)

L’extrait sec dégraissé est la différence entre l’extrait sec total et la teneur en matière

grasse, il est déterminé de la manière suivante : ESD = EST – MG.

I.6.3. Analyses effectuées pour les fromages fabriqués

I.6.3.1. Echantillonnage

Les échantillons qui ont servis pour les différentes analyses sont prélevés à différentes

durées de l’âge du fromage, selon le programme suivant :

- Le jour de salage et d’introduction de fromage à l’hâloir (J. 1) ;

- Après 6 jours d’affinage (J. 6) ;

- A la fin d’affinage (après 13 jours de fabrication) (J. 13) ;

- Après 20 jours de fabrication (J. 20) ;

- Après 28 jours de fabrication (J. 28) ;

- Après 37 jours de fabrication (J. 37).

Après affinage (13ème

journée), les pièces de fromage ont été mises à une température

de 4 à 8°C, dans un réfrigérateur.

I.6.3.2. Analyses physico-chimiques des fromages fabriqués

I.6.3.2.1. Détermination de pH

Le pH est déterminé par introduction de l’électrode (sonde) de pH et de température dans

une masse de fromage stabilisé à une température de 20 à 25°C. La mesure est répétée trois

fois pour chaque échantillon.

I.6.3.2.2. Extrait sec total

L’analyse est réalisée de la même façon que le lait, mais ici la prise d’essai est de 3

grammes de fromage.


38

I.6.3.2.3. Le rendement de la production

Le rendement fromager ou le rendement de la transformation du lait en fromage est

l'expression mathématique de la quantité de fromage obtenu à partir d'une quantité donnée de

lait (souvent 100 litres ou 100 kg) (VANDEWEGH, 1997, JEANTET et al., 2008). Le

rendement fromager est exprimé selon la formule suivante (LIBOUGA et al., 2006) :

é

é

I.6.4. Suivi de l’évolution de la texture

La texture est un élément majeur dans la détermination de la qualité des fromages à

pâte molle. Dans le cas précis du camembert, on assiste au cours de la maturation au

ramollissement de la partie externe du fromage. Cette zone modifiée s'étend progressivement

vers l'intérieur, dans certains cas on peut même observer des pâtes coulantes. Ce changement

de texture est généralement attribué à l'activité des différentes protéases présentes dans le

fromage y compris l’agent coagulant utilisé (ABRAHAM et al., 2006, WRIGHT et al., 2001).

La texture peut être évaluée au moyen de techniques instrumentales ou sensorielles, la

méthode instrumentale présente l’avantage d’être corrélée à l’analyse tout en étant facile à

mettre en œuvre (LAITIER et al., 2009)

Le test de pénétrométrie est effectué sur une tranche coupée perpendiculairement,

après que celle-ci soit équilibrée à la température ambiante. Un pénétromètre (PNR10) est

utilisé pour cette mesure, il est muni d’un cône qui pénètre en chute libre dans l’échantillon,

pendant une durée de 5 secondes, la moyenne de 5 mesures de pénétration en mm, nous donne

ainsi une idée sur la fermeté du fromage. La figure 10 montre la méthode de préparation de

l’échantillon pour la pénétrométrie.

I.6.5. Suivi de la protéolyse

Le degré de protéolyse est suivi par dosage qualititatif (eléctrophorèse UREA-PAGE

sur la fraction protéique insoluble à pH 4,6) et quantitatif (dosage par la méthode de Lowry de

la fraction soluble à pH 4,6) des protéines, pour séparer les deux fractions protéiques, nous

avons utilisé le protocole proposé par FALLICO et al., (2004). La figure 11 résume les

principales étapes de separation des fractions protéiques solubles et insoluble à pH 4,6.


39

Figure n° 10 : Préparation de l’échantillon pour le test de pénétrométrie.

Une masse de 25 g de fromage est dissoute dans 50 ml d’eau distillée par

hommogénéisation au Stomacher pendant 10 minutes ; Après homogéniésation, le pH est

ajusté par addition d’une solution d’HCl 1N jusqu’à stabilisation à 4,6, ensuite les

échontillions sont chauffés au bain Marie pendent 1 heure à 40 °C, pour la séparation des deux

phases, une centrifugation de 11000 g à 4°C pendant 30 min est nécessaire. Le culot est

récuperé pour le suivi qualitatif (UREA-PAGE), le surnagent obtenu servira au suivi

quantitatif (dosage Lowry).

Figure n° 11 : Extraction des fractions protéiques solubles et insolubles à pH = 4,6

(FALLICO et al., 2004).

Fromage (25g)

Dissolution de 25g de fromage dans 50 ml d’eau distillée (agitation pendant 10min)

Ajustement à pH = 4,6 (Adition d’HCl 1N)

Chauffage à 40°C /1heure

Centrifugation 1100g/ 30min à 4°C

Culot Surnagent

UREA-PAGE Dosage des protéines


40

I.6.5.1. Suivi qualitatif par électrophorèse UREA-PAGE

Pour la séparation des protéines de la fraction insoluble nous avons opté pour

l’électrophorèse en présence d’urée (UREA-PAGE). Elle est particulièrement adaptée pour la

séparation des protéines non globulaires comme les caséines (PELISSIER, 1984). La

sensibilité et le pouvoir de résolution de cette technique lui ont valu d’être considérée comme

un outil performant pour l’évaluation de la protéolyse des caséines. Ceci est rendu possible par

l’action des agents dissociants utilisés, dont le rôle est de rompre les liaisons hydrogènes (cas

de l’urée) et les ponts disulfures (cas du β-mercaptoéthanol), permettant ainsi aux entités

protéiques de migrer sous leur forme la plus simple (DAMERVAL et al., 1993).

L’UREA-PAGE est réalisée selon la méthode proposé par ANDREWS (1983), dans un

système composé de deux gels complémentaires : un gel supérieur dit gel de concentration

(4% p/v d’acrylamide), dont le tampon est constitué de 8,30 g/l de Tris, 300g/l d’urée et un pH

de 7,6 et un deuxième gel inférieur dit gel de séparation (12% p/v acrylamide), son tampon

contient : 64,30 g/l de Tris, 385,7g/l d’urée et un pH de 8,9. La composition globale des deux

gels est présentée en tableau 04.

Tableau n° 04 : composition des gels d’acrylamide en milieu urée

Gel de séparation Gel de concentration

Solution tampon de gel de séparation 52,5 ml /

Solution tampon de gel de concentration / 45 ml

Solution d’acrylamide 40% (p/v) 22,5 ml 5 ml

Bis-acrylamide 0,375 g 0,1 g

Temed 37,5 µl 25 µl

APS (Ammonium Persulfate) 282 µl 300 µl

I.6.5.1.1. Préparation et dépôt des échantillons

Pour la préparation des échantillons nous avons solubilisé 10 mg de chaque échantillon

dans 1 ml de tampon de solubilisation (de dénaturation ou tampon échantillon), qui est

composé de 7,5 g/l de tris, 490 g/l d’urée et a un pH de 8,4, le mélange est additionné de 10 µl

d’une solution à 1% de bleu de bromophénol puis agiter jusqu’à solubilisation totale de

l’échantillon.15 µl de chaque échantillon sont déposés dans un puits de gel déjà polymérisé et

la migration est lancée.


41

I.6.5.1.2. Migration et révélation des protéines

La migration s’effectue dans une cuve pleine d’une solution de migration (3 g/l tris, 14,6

g/l glycine et pH = 8,4), en appliquant un courant de 90 v jusqu’à ce que le front de migration

atteint le gel de séparations (20 à 30 minute environ), puis un courant de 180 v pendant 2

heures. A la fin de la migration, les gels obtenus sont colorés dans une solution de coloration

(10 % d’acide acétique, 30 % d’alcool (éthanol), 60% d’eau distillée et 0,025% bleu de

coomassie) pendant 2 heures, la décoloration ce fait dans une solution de décoloration (5%

acide acétique, 30% éthanol et 65% eau distillée).

I.6.5.2. Suivi quantitatif de la protéolyse dans le fromage

Le suivi quantitatif de la protéolyse dans les trois fromages fabriqué est réalésé par

dosage de la fraction protéique soluble à pH 4,6, la méthode utilisée est celle décrite par

LOWRY et al., (1951).

Les résultats obtenus sont exprimés en mg de protéines solubles à pH 4,6 par rapport

aux protéines totales (Protéines solubles (P.S.) / protéines totales (P.T.)).

I.6.6. Analyses sensorielles

Les tests sensoriels peuvent être classés de plusieurs façons. Les statisticiens les

classent comme étant paramétriques ou non paramétriques selon le type de données obtenues.

Les spécialistes de l'analyse sensorielle et les chercheurs en alimentation les classent en tests

axés sur le consommateur (affectif) ou axés sur le produit (analytique) en fonction de

l'objectif à atteindre. Les tests qui servent à évaluer la préférence, le niveau d'acceptation ou le

degré de goût des consommateurs pour les produits alimentaires sont dits axés sur le

consommateur. Les tests servant à déterminer les différences entre les produits ou à mesurer

des caractéristiques sensorielles sont dit axés sur le produit (WATTS et al., 1991).

Nous avons réalisé l’analyse sensorielle dans le but de concéder les changements

induits par le remplacement de l’agent coagulant utilisé quotidiennement en fromagerie

(présure), par les extraits enzymatiques étudiés (ficine et pepsine de poulet) ainsi que pour

estimer le degré d’acceptabilité de nouveau produit par les consommateurs.

Pour arriver aux objectifs fixés par cette analyse nous avons réalisé deux tests, le test

de classement par rang et le test descriptif ou d’intensité.


42

I.6.6.1. Le panel de dégustation

L'instrument de vérification pour l'analyse sensorielle est le panel de personnes (les

sujets) qui ont été recrutées pour réaliser des tâches précises d'évaluation sensorielle (FELIX

et STRIGLER, 1998).

Notre panel de dégustation est composé de 10 sujets, étudiants en graduation, étudiants

en post-graduation et enseignants de l’Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des

Technologies Agro-Alimentaires (I.N.A.T.A.A.). Les sujets sont recrutés selon leur

motivation et leur disponibilité pour participer aux tests. Avant de procéder aux tests nous

avons montré aux sujets la façon dont les bulletins seront remplis, en se servant d’un bulletin

brouillon.

Il faut recommander aux dégustateurs d'éviter l'utilisation de produits à odeur

prononcée, comme les savons et les parfums avant de participer à un panel et d'éviter de

manger, de boire ou de fumer avant de participer aux essais.

I.6.6.2. Local

L’analyse sensorielle a été réalisée au Laboratoire de Nutrition et Technologie

Alimentaire (L.N.T.A.) équipe Transformation et Elaboration de Produits Alimentaire

(T.E.P.A.) de l’I.N.A.T.A.A.

I.6.6.3. Déroulement des tests

Les analyses sensorielles ont été partagées en deux tests ; test de classement par rang

et test d’intensité. Avant l’analyse, les échantillons à analyser sont au préalable découpés en

tranches triangulaires d’environ 15 g et équilibrées à la température ambiante.

I.6.6.5. Le test de classement par rang

Le test de classement par rang a pour objectif de déterminer la mesure dans laquelle le

consommateur accepte un produit. Comme il peut servir, à obtenir des renseignements

préliminaires sur des différences entre les produits préparés avec les différents agents

coagulants étudiés.

Déroulement de test

Nous présentons aux dégustateurs trois échantillons dans des contenants identiques,

codés au moyen d'un numéro aléatoire à 3 chiffres. Chaque échantillon a un numéro de code

différent. Tous les échantillons sont présentés au même temps à chaque dégustateur.


43

On demande aux dégustateurs de classer par rang des échantillons codés en fonction

de l'acceptation en allant du moins acceptable au plus acceptable.

Traitement des résultats

Le total des classements attribués à chaque échantillon est réalisé. Ensuite la

signification des différences est déterminée en comparant les totaux des classements pour

toutes les paires possibles des échantillons en se servant du test de Friedman. Les différences

entre toutes les paires possibles des classements totalisés sont comparées à la valeur critique

du tableau donné dans l’annexe 03, pour un niveau de signification de 5 %.

I.6.6.6. Test d’intensité

Au cours de ce test, les dégustateurs doivent noter les échantillons, sur des échelles

linéaires ou selon l'intensité perçue d'une caractéristique sensorielle (attribut). Les

dégustateurs donnent ainsi une description sensorielle totale de l'échantillon de point de vue :

apparence, odeur, saveur, texture et arrière-goût (fiche annexe 03).

Le test descriptif permet donc de déterminer le profil sensoriel de l’échantillon et de

mesurer l'importance des différences entre les échantillons.

Déroulement du test

Les échantillons sont présentés dans des contenants identiques, codés avec un numéro

aléatoire à 3 chiffres (ou une lettre (A, B ou C). Chaque échantillon a un numéro distinct, et

dans une fiche conçue pour le test descriptif (Annexe 03) chaque dégustateur note l'intensité

perçue des caractères choisis de chaque échantillon sur un échelle allant de 1(faible intensité)

à 9 (forte intensité).

Traitement des résultats

Les notes de chaque échantillon sont présentées sous forme de tableau et analysées au

moyen de l'analyse de variance (ANOVA) à l’aide d’un logiciel statistique XLSTAT (2009)

afin de déterminer s'il y a des différences significatives entre les échantillons au seuil de

signification de 5%. Ainsi que le profil sensoriel pour chaque journée sera établi au moyen de

Microsoft Excel 2007.

Résultats et

discussion

Résultats et discussion

44

II.1. Caractéristiques physico-chimiques du lait utilisé

Les caractéristiques physicochimiques de la poudre de lait écrémé (SOLARC.S.A.

Belgique) et celle du substrat de BERRIDGE (dissolution de 12 g de la poudre de lait écrémé

dans 100 ml d’une solution de chlorure de calcium 0,01M) sont présentées en tableau 05.

Tableau n° 05 : caractéristiques physicochimiques de la poudre de lait et du substrat de

Berridge.

Substrat de Berridge Poudre de lait

EST (%) 10,78 ± 0,95 91,17± 0,48

pH 6,40 ± 0,03 /

Acidité titrable (g/l) 1,658 ± 0,023 (16,58°D) /

Le lait reconstitué selon la méthode de Berridge présente un pH de 6,4, une acidité

estimé à 16,58°D et un extrait sec total (EST) de 10,78%. Ces valeurs sont proches de celles

données par différents auteurs (pH 6,6, acidité titrable 15 à 17°D et EST de 10 à 13%)

(AFNOR, 1993 ; RIBADEAU-DUMAS, 1991 ; SILVA et MALCATA, 2005).

II.2. Caractéristiques des extraits enzymatiques

L’extraction de la ficine à partir du latex est effectuée par centrifugation (3200g

pendant 15 min à 4°C). Le rendement est d’environ 71,42% (7,4 ml de la ficine brute pour 10

ml de latex). Les caractéristiques de l’extrait de ficine et de pepsine de poulet sont présentées

en tableau 06.

Tableau n° 06 : Principales caractéristique des enzymes extraites

Caractéristiques Ficine Pepsine

Taux de protéine (mg/ml) 89,31 ± 0,96 20,10 ± 0,73

Activité coagulante (UAC) (UP) 121,09 ± 4,81 18,61 ± 0,33

Force coagulante 1/42059,76 1/6041,64

Activité spécifique UP/mg 1,35 0,92

Couleur Brune claire Jaunâtre

Texture Visqueux Liquide

L’extrait clarifié de pepsine de poulet, est obtenue selon le protocole proposé par

BOHAK (1970), (macération de 100g de proventricules de poulet dans 300 ml d’une solution

saline de 30g/l de NaCl et 7g/l de NaHCO3). Le rendement d’extraction est d’environ 84,43


45

% (pour 100 g de proventricules nous avons récupéré 253,29 ± 5,06 ml d’extrait enzymatique

clarifié). Le rendement exprimé en unité d’activité coagulante par 100g de proventricules est

égale à 4714 U.P. Ce rendement correspond à l’activité enzymatique du volume total de

l’extrait obtenu de l’extraction à partir de 100g de proventricules de poulet dans 300ml de

solution d’extraction. Les caractéristiques de l’extrait enzymatique clarifié sont présentées en

tableau 08.

L’extrait de la ficine obtenu est une solution visqueuse de couleur brune claire. Ces

caractéristiques sont confirmées par les résultats de NOUANI et al,. (2009). Caractérisé par

une teneur en protéine de 89,31± 0,96 mg/ml, cette valeur est inférieure à celles obtenues par

FADYLOGLU, (2001) ; WILLIAMS et al., (1968) évaluée à 116 mg/ml et 156 mg/ml

respectivement. Elle est également inférieure à celle obtenue par DEVARAJ et al., (2008b)

pour la ficine extraite de latex de Ficus racemosa qui est de 156 mg/ml.

Son activité coagulante est de 121,09 U.P. Ces résultats sont inférieurs à ceux

rapportés par NOUANI et al., (2009), FADYLOGLU, (2001) estimé à 1500 U.P. et

WILLIAMS et al., (1968) évalué à 320 U.P.. La force coagulante de l’extrait obtenu est de

1/42059,76. En terme de quantité de lait coagulable, 1ml de cet extrait enzymatique peut

coaguler environ 42 litres, donc 10 ml de latex peuvent coaguler environ 310 litres de lait,

cette force est très proche de celle rapportée par NOUANI et al., (2009) qui est de 1/40000.

L’activité spécifique de la ficine est de 1,35 UP/mg. Ce résultat est proche de celui obtenu par

WILLIAMS et al., (1968) évalué à 2,05.

En comparant ces résultats avec ceux des cardosines, enzymes végétales

traditionnellement utilisée en fromagerie nous constatons que la ficine est dotée d’une activité

coagulante, d’une force coagulante et d’un taux en protéines supérieurs a ceux des cardosines

obtenus par différents auteurs (MARTINS et al. 1996 ; NOUANI et al., 2009 ; ZIKIOU,

2013)

L’extrait clarifié de pepsine obtenu selon le protocole de BOHAK, (1970) est une

solution de couleur jaunâtre. Ce résultat est comparable à celui rapporté par ADOUI, (2007).

Il a la même couleur que celle d’une présure extraite par macération à partir des caillettes de

veau (FAO, 1988), le rapport indiqué pour l’extraction de la présure est de 80 g de caillettes

pour 1000 à 1600 ml de la solution de macération (VEISSEYRE, 1979 et WANGOH et al.,

1993). Le protocole que nous avons appliqué recommande 100g de proventricules de poulet

pour 300 ml de la solution de macération. La teneur en protéines de l’extrait clarifié de


46

pepsine de poulet obtenu est de 20,10 mg/ml. Ce résultat est supérieur à celui obtenu par

ADOUI, (2007) qui est de 8,77 mg/ml et largement inférieur à celui obtenu par NOUANI et

al., (2011) ayant une valeur de 147,3 mg/ml.

L’extrait clarifié de la pepsine de poulet a une activité coagulante de 18,61 U.P. Cette

activité est supérieure aux activités obtenues par NOUANI et al., (2011) évalué à 13,33 U.P.,

par BOUGHELLOUT, (2007) estimé à 2,42 U.P., par ADOUI, (2007) qui est de 15,08 U.P. et

PAEZ DE LEON et al., (1995) qui ont obtenu 5,52 U.P. En termes de force coagulante

l’extrait de la pepsine que nous avons obtenu a une force de 1/6041,64. Ce résultat est

supérieur à celui obtenu par NOUANI et al., (2011) évalué à 1/3200 et par ADOUI, (2007)

estimé à 1/2579 et une activité spécifique de 0,92 UP/mg. Avec une telle force la quantité

d’enzymes récupérés de 100 g de proventricules peut coaguler environ 1620 litres de lait en

40 min et à 35 °C.

Par comparaison entre les deux extraits obtenus dans notre étude, nous remarquons

que l’extrait d’origine végétale (ficine) a une activité coagulante, une force coagulante et une

teneur en protéines plus élevée comparé à l’extrait d’origine animale (pepsine de poulet).

II.2.1. Activité protéolytique

Toutes les enzymes coagulantes qu’elles soient d’origine animale, végétale ou

microbienne, sont capables d’hydrolyser la caséine κ, provoquant ainsi la coagulation du lait.

Toutefois cette condition est suffisante pour l’utilisation de ces enzymes en industrie

fromagère (ALAIS, 1984), mais pour la production des fromages de qualité, il faut tenir

compte de leur grande activité protéolytique non spécifique supplémentaire qui leur donne le

pouvoir d’hydrolyser les caséines α et β (VIGNOLA, 2002).

Cependant, pour assurer un bon rendement fromager et pour éviter certains défauts de

goût et de texture qui peuvent apparaitre au niveau des fromages, ces coagulases doivent

présentées une faible protéolyse généralement.

La figure 12 montre la quantité des produits d’hydrolyse libérés par chacune des

enzymes étudiées.


47

Figure n° 12 : Quantité des produits d’hydrolyse libérés par les extraits enzymatiques étudiés.

Pour cela, nous avons étudié l’activité protéolytique des extraits de ficine et de pepsine

de poulet par comparaison à la présure animale par la méthode de GREEN et STACKPOOLE

(1975). Les résultats ont montré que l’activité protéolytique de l’extrait de ficine est très

élevée et elle est 4 fois plus élevée que celle de la pepsine et 13 fois celle de la présure. En

effet, nous avons obtenu des valeurs de 469,7 µg/ml pour l’extrait de la ficine contre 117

µg/ml pour la pepsine de poulet et 35,75 µg/ml pour la présure. Cette activité protéolytique

excessive de la ficine a été signalée par plusieurs auteurs (LYNN et CLEVETTE-RADFORD,

1986 ; ONER et AKAR, 1993; FADYLOGLU, 2001; NOUANI et al., 2009 ; FACCIA et al.,

2012 et SHAH, et al., 2014 ).

Concernant la pepsine de poulet nous avons obtenu une activité protéolytique 3 fois

celle de la présure. En effet, nous avons obtenu des valeurs de 117 µg/ml pour la pepsine de

poulet et 35,75 µg/ml pour la présure. Ce résultat est confirmé par plusieurs auteurs qui ont

signalé une activité protéolytique de la pepsine supérieure à celle de la présure (STANLEY et

al., 1980; FINDLAY et al., 1984). Par contre, GORDIN et ROSENTHAL, (1978) ont signalé

des activités protéolytiques de la pepsine inférieure aux activités de la présure dans le fromage

Cheddar, ainsi que ADOUI, (2007) et BOUGHELLOUT, (2007).

II.2.2 Profil électrophorétique

Pour mieux caractériser les extraits enzymatiques étudiés, nous avons réalisé une

électrophorèse SDS-PAGE pour visualiser et localiser les bandes protéiques de chacun des

extraits étudiés (la ficine et la pepsine de poulet).


48

Les profils électrophorètiques des deux extraits (extrait de ficine et pepsine de poulet)

sont présentés en figure 13.

Figure n° 13 : Profil électrophorétique sur SDS-PAGE des extraits de ficine et de pepsine

STD : marqueurs de taille ; E. Ficine: extrait de la ficine ; E. Pepsine : extrait de la pepsine.

Le profil de l’extrait de la pepsine, montre une bande intense (C) d’un poids

moléculaire d’environ 35 KDa. Selon BOHAK, 1969 ; GREEN et LLEWELLIN, 1973, le

poids moléculaire de la pepsine de poulet est de 35 KDa. Donc la bande intense représente la

pepsine de poulet clarifiée. Les bandes claires (D et E) qui sont apparues dans le gel sont des

impuretés de fait que l’extrait n’est pas purifié.

Concernant le profil électrophorétique de l’extrait de la ficine, nous remarquons la

présence de deux bandes très intenses qui ont des poids moléculaires d’environ 24 KDa (A) et

23 KDa (B) respectivement, ces bandes représentent le peptide de la ficine qui a un poids

moléculaire compris entre 23 KDa et 26 KDa selon la bibliographie (DEVARAJ et al., 2011 ;

PAYNE, 2009 ; DEVARAJ et al., 2008b ; KATSAROS et al., 2008 ; LAWE, 1976). Comme

nous remarquons l’apparition de deux bandes claires (F et G) dans le gel qui sont des imputés.


49

II.3. Conditions optimales de coagulation

Plusieurs facteurs influent sur la coagulation tels que la concentration en enzymes, le

pH du lait, la teneur en calcium, la composition en caséines, la dimension des micelles et les

traitements préalables du lait (JEANTET et al., 2008).

Dans le but de déterminer les conditions physico-chimiques optimales pour l’action de

l’extrait de ficine et de pepsine, nous avons essayé de voir l’influence de certains paramètres

sur leur activité coagulante par comparaison à la présure.

II.3.1. Effet de pH

L’effet du pH sur l’activité coagulante de l’extrait de ficine, de pepsine et de la présure

a été étudié en ajustant le pH du lait (substrat de Berridge) aux valeurs de l’intervalle 5 à 7. La

température d’incubation est fixée à 30 °C et la concentration en CaCl2 est de 0,01M.

Le pH optimal de coagulation du lait est déterminé par observation du temps de

floculation le plus court. La figure 14 donne l’évolution de l’activité coagulante des extraits

enzymatiques étudiés en fonction du pH du lait.

Figure n° 14 : Effet du pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait de ficine, de pepsine et

de présure.

Les résultats présentés par la figure 16 indiquent une diminution de l’activité

coagulante des trois préparations enzymatiques au fur et à mesure que le pH du lait augmente.

En effet, l’optimum d’activité est à pH 5,0 avec une activité coagulante de 832,91 U.P. Cette

activité passe à 182,37 U.P. à pH 6,0 pour se stabiliser à 60,99 U.P. à pH 7,0. Ces résultats


50

confirment ceux de NOUANI et al., (2009) et FADYLOGLU, (2001) qui ont estimé que le

pH optimal d’activité pour la ficine est de 5.

Pour l’extrait de pepsine l’optimum d’activité est observé à pH 5 avec une activité

coagulante de 55,92 U.P. puis 46,82 à pH 6 pour se stabiliser à 2,41 à pH 7 et pour la présure

animale, elle passe de 4,43 U.P. à pH 5 puis 4,16 U.P. à pH 6 pour arriver à 1,19 U.P. à pH 7.

ADOUI, (2007) rapporte que la pepsine de poulet est d’autant plus active que le pH est bas.

D’après ces résultats nous constatons que le pH joue un rôle très important dans la

coagulation de lait. En effet, les extraits étudiés montrent un caractère acide (l’optimum

d’activité à pH 5).

II.3.2. Effet de la température

L’effet de la température du lait sur l’activité coagulante des extraits enzymatiques

étudiés est déterminé par la mesure de l’activité coagulante à différentes températures

d’incubation (de 30 à 80 °C).

La figure 15 montre l’évolution de l’activité coagulante des extraits étudiés par

comparaison à la présure en fonction de la température du lait.

Figure n° 15 : Effet de la température du lait sur l’activité coagulante de la ficine, de la

pepsine de poulet et de la présure.


51

Nous avons constaté une différence de comportement entre les trois extraits

enzymatiques suivant les températures étudiées. L’optimum d’activité coagulante pour

l’extrait de ficine est obtenu à une température du lait égale à 75°C avec une valeur de

2487,11 U.P. Ce résultat est proche de ceux donnés par NOUANI et al., (2009) évalué à

80°C, FADYLOGLU, (2001) estimé à 60°C et PAYNE, (2009) qui est de 65°C. Ces résultats

confirment la grande stabilité thermique de la ficine déclarée par plusieurs auteurs (NASSAR

et al., 1987; GRZONKA et al., 2007; FEIJOO-SIOTA et al., 2011 et BEKHI et al., 2013).

Pour la pepsine et la présure animale l’activité optimale est enregistrée à des

températures du lait égales à 55°C et 50°C avec 52,48 U.P. et 7,16 U.P. respectivement, au-

delà de ces températures nous avons constaté une baisse d’activité. Les résultats obtenus pour

la pepsine son proches de ceux donnés par ADOUI (2007) évalué à 55°C et supérieurs aux

résultats obtenus par NOUANI et al., (2011) estimé à 40°C. L’activité de l’extrait de pepsine

diminue au-delà de 55°C. Selon ADOUI (2007) la pepsine est inactivée aux températures

dépassant 65°C. NOUANI et al., (2011) ont signalé que la pepsine de poulet est totalement

inactivée à 55°C.

II.3.3. Effet de la concentration en CaCl2

Pour corriger les variations des teneurs en calcium du lait au cours du stade de

lactation ou les modifications de l’équilibre du calcium provoqué par les traitements

thermiques, les industries ajoutent du CaCl2 à une dose de 80 à 200 mg.l-1

améliorant ainsi

l’aptitude à la coagulation du lait (JEANTET et al., 2008). La figure 16 montre l’influence de

la concentration en CaCl2 sur l’activité coagulante des extraits enzymatiques étudiés.

D’après ces résultats nous constatons que dans l’intervalle de concentration en CaCl2

étudié l’activité coagulante augmente avec la concentration en CaCl2. L’optimum d’activité

pour la ficine estimé à 205,29 U.P. est obtenu à une concentration de 0,03 M. Cette

concentration est supérieure à celle signalée par NOUANI et al., (2009) évaluée à 0,02 M de

CaCl2 par litre de lait. En ce qui concerne la pepsine nous remarquons que l’optimum

d’activité évalué à 22,07 U.P. et observé à une concentration de 0,02 M. Ce résultat est

similaire à celui obtenu par NOUANI et al., (2011) estimé à 0,02 M. Pour la présure

l’optimum d’activité (9,69 U.P) est obtenu à 0,03 M.

Pour des concentrations en CaCl2 supérieures à 0,03M nous remarquons une

diminution d’activité coagulante pour les trois extraits enzymatiques.


52

Figure n° 16 : Effet de la concentration de CaCl2 sur l’activité coagulante de l’extrait de

ficine, de pepsine et de présure animale.

II.4. Les interactions impliquées dans le gel obtenu par l’extrait de ficine et de pepsine

L’utilisation d’agents dissociants, permet de mettre en évidence la nature des

interactions impliquées dans la formation et le maintien de la structure du réseau protéique du

coagulum. Le pourcentage des protéines dissociées par rapport aux protéines totales, reflète

l’action de l’agent utilisé sur le réseau protéique, et par conséquent la présence d’interactions

spécifiques détruites par cet agent. Les liaisons hydrophobes sont sensibles à l’action des

détergents tels que le SDS, les liaisons hydrogènes sont détruites par l’urée et les liaisons

calciques sont détruites par les agents chélateurs tel que l’EDTA (LEFEBVRE-CASES et al.,

1998 ; BOUGHELLOUT, 2007 ; BENYAHIA-KRID et al., 2010).

Pour l’identification des liaisons impliquées dans la formation et le maintien des gels

obtenus par l’extrait de la ficine, l’extrait de la pepsine de poulet et de la présure, nous avons

utilisés différents agents dissociant : le SDS pour la destruction des liaisons hydrophobes,

l’urée pour les liaisons hydrogène et l’EDTA pour les liaisons calciques.

II.4.1. Interactions hydrophobes (dissociés par le SDS)

Le sodium dodecyl sulfate (SDS) agit sur les liaisons hydrophobes des chaines

protéiques ce qui provoque la destruction de ces liaisons. Les taux de dissociation des

protéines des gels ficine, pepsine et présure en fonction de la concentration du SDS sont

montrés en figure 17.


53

Figure n° 17 : effet de SDS sur les gels présure, pepsine et ficine.

(SDS : concentration du sodium dodecyl sulfate en g/l ; présure : gel issu d’une coagulation par la présure

animale ; pepsine : gel issu d’une coagulation par l’extrait de pepsine de poulet ; ficine : gel issu d’une

coagulation par l’extrait de ficine).

L’analyse de la variance ANOVA au seuil de signification de 5%, ne montre aucune

différence de dissociation entre le gel obtenus par la pepsine de poulet et la présure animale

sauf pour la concentration en SDS de 2g/l, par contre pour le gel obtenu avec la ficine le taux

de dissociation montre des différences significatives avec le gel pepsine et présure pour toutes

les concentrations, exception pour la concentration de 2g/l.

D’après les résultats obtenus nous constatons que le SDS semble avoir un effet

important sur les gels pepsine, présure et à moindre degré sur le gel ficine, En effet, à une

concentration de 4 g/l de SDS 81,48% des protéines sont dissociées pour le gel pepsine et

78,59% pour le gel présure alors que pour le gel ficine seulement 50,65% des protéines sont

dissociées. Pour la concentration de 10g/l de SDS, le taux de dissociation des protéines atteint

environ 98,74% pour la pepsine, 97,73% pour la présure et 74,26% pour la ficine.

Ces résultats concordent avec ceux obtenus par BENYAHIA-KRID et al., (2010) et

BOUGHELLOUTE, (2007) qui ont étudié l’effet du SDS sur les gels pepsine et présure.

Aucune différence significative de taux de dissociation n’a été constatée entre les deux gels

au seuil de signification de 5%. En effet, pour une concentration de 10g/l de SDS ; 94,9% des

protéines du gel pepsine sont dissociées contre 96,9% pour les protéines du gel présure estimé


54

par BENYAHIA-KRID et al., (2010) et 99,35% de dissociation pour le gel pepsine et présure

obtenu par BOUGHELLOUTE, (2007).

LEFEBVRE-CASES et al. (1998) ont étudiés l’effet du SDS sur un gel présure et sur

un gel acide. Pour une concentration de SDS de 6 g/l, ils ont constaté une dissociation de

55% dans gel acide contre 90% pour le gel présure.

II.4.2. Interactions hydrogènes (dissociation par l’urée)

L’utilisation de l’urée comme agent dissociant nous permet de faire une estimation sur

l’importance des liaisons hydrogène impliquées dans la formation et le maintien des gels

étudiés. La figure 18 montre les résultats obtenus pour le taux de dissociation des protéines

des gels ficine, pepsine et présure en fonction de la concentration en urée.

L’urée semble avoir un effet important sur les trois gels étudiés. En effet, à une

concentration en urée de 1M le taux de dissociation est de 25,38% pour la ficine, 32,36% pour

la pepsine et 29,65% pour la présure, pour atteindre 64,34%, 79,51% et 71,54% pour le gel

ficine, pepsine et présure respectivement à une concentration en urée de 6M.

L’analyse de la variance ANOVA au seuil de signification de 5% montre que pour la

concentration en urée de 1M le taux de dissociation ne présente aucune différence entre le gel

pepsine et présure. Cependant, le gel ficine présente une différence significative avec ces deux

derniers. Pour une concentration de 2M la différence est significative entre le gel ficine et le

gel pepsine, mais la différence est non significative entre le gel ficine et présure et le gel

pepsine et présure. En effet, le taux de dissociation est de 35,31%, 42,31% et 36,80% pour le

gel ficine, pepsine et présure respectivement. Pour les concentrations de 3M et 4M, l’ANOVA

n’a révélé aucune différence entre le gel ficine et présure qui présentent une différence

significative avec le gel pepsine. Pour les concentrations de 5M et 6M nous remarquons que

l’analyse statistique n’a révélée aucune différence entre les trois gels étudiés.


55

Figure n° 18: effet de l’urée sur les gels présure, pepsine et ficine.

(Urée : concentration en urée (M) ; Présure : gel issu d’une coagulation par la présure animale ; Pepsine : gel

issu d’une coagulation par l’extrait de pepsine de poulet et Ficine : gel issu d’une coagulation par l’extrait de

ficine).

Dans des travaux précédents BENYAHIA-KRID et al., (2010), ont rapporté un taux

de dissociation des protéines de 61,6% pour le gel présure et 59,2% pour le gel pepsine à une

concentration en l’urée de 6M. BOUGHELLOUT (2007) a obtenu un taux de dissociation de

79% pour le gel pepsine et 65% pour le gel présure pour la même concentration en urée.

LEFEBVRE-CASES et al., (1998), ont évalué le taux de dissociation à 64% dans le gel

présure et 81% dans le gel acide pour une même concentration en urée. De même, dans un

autre travail sur l’extrait coagulant de la fleur de cardon, ZIKIOU, (2013) a obtenu un taux de

dissociation de 80%.

Ces résultats montrent que les liaisons hydrogène sont impliquées dans la formation et

le maintien de la structure des gels lactiques à différents degrés. En effet, ces liaisons sont

plus importantes dans le gel pepsine et présure comparé à celui de la ficine.

II.4.3 Dissociation des protéines par l’EDTA

L’ethylenediamine tetracetic acide (EDTA) est considéré comme un agent chélateur de

calcium, son effet sur les gels étudiés est représenté en figure 19.

L’analyse de la variance ANOVA au seuil de signification de 5%, n’a présenté,

aucune différence entre les trois gels pour une concentration de 2 mM d’EDTA, aux


56

concentrations de 4 mM et 6 mM. L’analyse n’a révélé aucune différence entre le taux de

dissociation dans le gel pepsine et le gel présure, alors que le gel ficine présente une

différence significative avec ces derniers.

Figure n° 19 : Effet de l’EDTA sur les gels présure, pepsine et ficine.

(EDTA : concentration de l’ethylenediamine tetracetic acide en mM ; Présure : gel issu d’une coagulation par la

présure animale ; Pepsine : gel issu d’une coagulation par l’extrait de pepsine de poulet; Ficine : gel issu d’une

coagulation par l’extrait de ficine).

En effet le taux de protéines libérées passe de 23,64% pour le gel ficine, 26% pour le

gel pepsine et 25,38% pour le gel présure à une concentration en EDTA de 2mM pour

atteindre les valeurs de 28,44%, 36,32% et 39,69% pour les gels ficine, pepsine et présure

respectivement pour une concentration de 6mM d’EDTA.

Les résultats obtenus pour le gel pepsine et le gel présure à une concentration de 6mM

d’EDTA sont proches des résultats obtenus par BENYAHIA-KRID et al., (2010), pour une

concentration de 100mM d’EDTA, les auteurs ont obtenu un taux de dissociation de 41,35%

pour le gel pepsine et 44,13% pour le gel présure. Ces résultats sont supérieurs à ceux obtenus

pour le gel ficine (28,44%). LEFEBVRE-CASES et al., (1998), ont évalué le taux de

dissociation des protéines à 75,9% pour le gel présure et 26,7% pour le gel acide pour une

concentration en EDTA de 2mM.


57

D’après les résultats obtenus, nous pouvons conclure que :

les trois types de liaisons (hydrophobes, hydrogène et calciques) contribuent à la formation

et au maintien des gels ficine pepsine et présure à différents degrés ;

Les liaisons hydrophobes dans le gel pepsine et le gel présure sont plus importantes que

dans le gel ficine ;

Les liaisons hydrogène sont plus importantes dans les gels pepsine et présure comparées

aux gels ficine ;

Les liaisons calciques sont plus importantes dans les gels pepsine et présure par rapport

aux gels ficine. Ce dernier présente donc les caractéristiques d’un gel acide.

II.5. Essai de fabrication d’un fromage à pâte molle type « camembert » par l’utilisation

de la ficine ou de la pepsine de poulet

En vue d’étudier la possibilité de substitution de la présure par les extraits étudiés, des

essais de fabrication de fromage à pâte molle type « Camembert » ont été effectués à la

laiterie SAFILAIT de Constantine.

Afin d’étudier les modifications apportés par les extraits de substitution, nous avons

comparé les fromages obtenus avec les fromages témoins fabriqués par l’unité de point de vue

sensoriel et physicochimique.

II.5.1. Caractéristiques physicochimiques du lait utilisé

Le lait utilisé pour la fabrication des fromages est collecté dans la wilaya de

Constantine et ses entourages. Le tableau 09 représente la composition physicochimique du

lait utilisé.

Tableau n° 07 : Composition physicochimique du lait crû utilisé pour la fabrication

fromagère.

Lait crû Normes AFNOR (1993)

pH

Acidité (D°)

E.S.T. (%)

M.G. (%)

E.S.D. (%)

Densité

6,6

16

12,3

3,8

8,5

1,027

6,6

15 – 18

12,3 – 12,5

3,2 – 3,6

8,75 – 9

1,027 – 1,032


58

E.S.T. : extrait sec total ; M.G. : matière grasse ; E.S.D. : extrait sec dégraissé = E.S.T.-M.G.

Ces résultats montrent que le lait utilisé dans cette fabrication est conforme aux

normes, sauf pour le taux de la matière grasse qui est légèrement supérieur à la norme ce qui

influence sur l’extrait sec dégraissé. Cella est due principalement à l’alimentation des vaches

durant cette période (mois d’octobre) qui se base principalement sur le foin. Les

caractéristiques physicochimiques du lait sont proche de celles rapportés par plusieurs auteurs

(AFNOR, 1993 ; VIGNOLA, 2002 ; JEANTET et al., 2008).

II.5.2. Paramètres physicochimiques des fromages fabriqués

II.5.2.1. pH

Un changement du pH affecte profondément les propriétés fonctionnelles de fromage

(NOEL et LEFIER, 1991). Ces changements dans les propriétés des fromages se produisent

quand le pH passe de 5.4 à 4.9. Cette baisse de pH résulte de plusieurs facteurs, y compris la

solubilisation de la majeure partie du phosphate de calcium colloïdal (MEHMET AK, 2003).

Le pH des fromages fabriqués est de 4,88, 5,10 et 5,10 pour le fromage obtenu avec

l’extrait de ficine, pepsine et le témoin respectivement. Nous remarquons que le pH des

fromages est proche malgré le changement de l’agent coagulant, cela est dû au fait que l’agent

coagulant n’influence pas le pH de fromage et que celui-ci est influencé par la composition

initiale de lait à l’instant de la coagulation.

II.5.2.2. L’extrait sec total

L’extrait sec total varie selon le type du fromage. Il est influencé par la composition

initiale du lait, le type de coagulation ainsi que le type d’égouttage (les fromages à pâte

pressée ont un extrait sec totale nettement supérieur à celui des autres fromages) (ALAIS,

1984).

L’extrait sec total des fromages fabriqué est de 64,43%, 55,44% et 55,68% pour le

fromage obtenu avec l’extrait de la ficine, l’extrait de la pepsine et le fromage témoin (présure

microbienne) respectivement. Cette différence dans l’extrait sec total est due principalement

aux types des caillés obtenus. En effet, le caillé obtenu avec la ficine donne des grains de

caillés réduits comparées aux grains obtenus dans les coagulums issus de la coagulation par la

pepsine de poulet et celui avec la présure microbienne, ce qui rend l’égouttage facile et

intensif. Selon JEANTET et al., (2008), le gel présure présente une forte cohésion, élasticité

et porosité mais une perméabilité faible, conduisant à un égouttage spontané limité.


59

II.5.3. Le rendement

Le rendement est la quantité de fromage obtenu à partir d’une quantité indiquée de

lait. C’est le paramètre le plus important du point de vue économique dans l’industrie laitière

(EMMONS, 1993 ; MIGLIOR et al, 2005 ; HUPPERTZ et al., 2006 ; BITTANTE et al.,

2013). Il reflète aussi le bon déroulement des conditions de fabrication.

Les rendements obtenus pour les essais réalisés sont : 33,25%, 37,82% et 38,41% pour

les fromages issus de la coagulation par l’extrait de ficine, l’extrait de pepsine et la présure

microbienne (témoin) respectivement. Cette différence de rendement est due à la différence

enregistrée dans la teneur en extrait sec total des trois coagulums obtenus qui sont

respectivement : 31,13%, 28,23% et 28,03%. Nous remarquons que le rendement fromager

obtenu en utilisant la pepsine de poulet est proche de celui de la présure microbienne (0,59%

de différence). Selon STANLEY et al., (1980) l’utilisation de la pepsine de poulet dans la

fabrication de fromage Cheddar conduit à un rendement inferieur à celui de la présure.

RODNEY et EMSTROM (1988) ont estimé que le rendement fromager obtenus par la

pepsine de poulet est inférieur à celui obtenu avec un mélange chymosine-pepsine porcine.

Tandis que FINDLAY et al., (1984) ont obtenus les mêmes rendements fromagers par la

pepsine de poulet et la présure.

Par ailleurs nous remarquons que le rendement par utilisation de la ficine est

largement inférieur à celui de la pepsine et du témoin. En effet, la différence entre le fromage

témoin et celui obtenu avec la ficine est de 5,16%. Cette perte de rendement est due à l’agent

coagulant (ficine) doté d’une activité protéolytique élevée conduisant à la perte des peptides

de masse réduite dans le lactosérum. Ce rendement relativement réduit est signalé par ONER

et AKAR, (1993), FADYLOGLU, (2001) et NOUANI et al., (2009).

II.5.4. Evolution de la texture des fromages

La texture est un aspect primaire pour la qualité des fromages. L'aspect des fromages

dans la bouche est apprécié avant leur saveur (LAWRENCE et al., 1987). La texture peut être

évaluée au moyen de techniques instrumentales ou sensorielles. La méthode instrumentale

présente l’avantage d’être corrélée à l’analyse tout en étant facile à mettre en œuvre

(LAITIER et al., 2009). Le test de pénétrométrie donne la distance parcouru par le cône du

pénétromètre dans la masse d’un échantillon sous l’effet de son propre poids, cette distance

est fonction de la dureté du fromage (FOX et al., 2000).


60

Les résultats de la pénétrométrie sont présentés en figure 20. Nous remarquons que la

profondeur de pénétration augmente avec la durée d’affinage (âge du fromage), ce qui signifie

un ramollissement de la pâte. En effet, la profondeur de pénétration passe de 2,15 mm, 3,6

mm et 2,06 mm au premier jour de fabrication pour atteindre 5,62 mm, 6,07 mm et 4,45 mm

au 37ème

jour d’affinage pour les fromages obtenus avec l’extrait de ficine, l’extrait de pepsine

et la présure respectivement.

Figure n° 20 : Evolution de la profondeur de pénétration de cône du pénétromètre dans les

trois fromages au cours de l’affinage. (F. ficine : fromage issu de la coagulation par l’extrait la ficine; F.

PEPSINE : fromage issu de la coagulation par la pepsine du poulet ; F. présure : fromage issu de la coagulation

par la présure microbienne ; Profondeur de pénétration : la distance de pénétration du cône en mm ; J.1 : 1er jour

d’affinage ; J.6 : 6ème

jour d’affinage ; J.13 : 13ème




jour d’affinage.

Le ramollissement de la pâte des fromages fabriqués avec la pepsine de poulet est

constaté par FINDLAY et al., (1984) et RODNEY et EMSTROM (1988), sur la texture du

fromage cheddar. ONER et AKAR, (1993), FACCIA et al., (2012), ont observé le

ramollissement des fromage fabriqués avec les extraits de la ficine. Cette perte de dureté est

due en major partie à l’activité protéolytique des extraits enzymatiques étudiés.

L’analyse de la variance ANOVA au seuil de signification 5%, n’a révélée aucune

différence significative entre les trois fromages au 1er

et au 13ème

jour d’affinage. Pour les

6ème

, 20ème

, 28ème

et 37ème

jours, la différence est significative. En effet, le fromage témoin

(présure microbienne) présente une texture nettement plus ferme que les fromages obtenus

avec l’extrait de ficine ou l’extrait de pepsine.


61

II.5.5. L’évolution de la protéolyse

La protéolyse est l'événement biochimique principal qui se produit pendant la

maturation de la plupart des variétés des fromages. C’est le phénomène le plus important de la

phase d’affinage car il affecte à la fois la texture et la saveur des fromages. En effet, la pâte

fromagère devienne plus molle et plus onctueuse et il ya production de métabolites qui

confèrent un arôme et une saveur particulière aux fromages (FOX et al., 2000 ; Mc

SWEENEY et SOUSA, 2000; SOUSA et al., 2001; COURTIN et al., 2002 ; SILVA et

MALACATA, 2005 ; O’SULLIVAN et al., 2005 ; HUPPERTZ et al., 2006 ; JEANTET et

al., 2008).

Pour mieux déterminer l’impact des différents agents coagulants utilisés, nous avons

réalisé un suivi de la protéolyse lors de l’affinage du point de vue qualitatif par électrophorèse

UREA-PAGE de la fraction insoluble à pH = 4,6 et quantitatif par dosage des protéines

solubles à pH = 4,6 par la méthode de LOWRY et al., 1951.

II.5.5.1. Evolution qualitative

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence d’urée (UREA-PAGE) est une

performante technique qui permet l’évaluation de la protéolyse des caséines (PAVIA et al.,

2000 ; VELOSO et al., 2002). En effet, la sensibilité de la technique permet de suivre le

comportement électrophorétique des principales protéines du lait à savoir les caséines, ce qui

permet de suivre leur dégradation enzymatique au cours de l’affinage est d’apprécier les

produits de dégradation qui migrent en fonction de leurs poids et de leurs charges.

Les références bibliographiques mentionnent que les agents coagulants sont les

premiers intervenants dans la protéolyse des fromages. Ils attaquent préférentiellement la

caséine αS1 en scindant la liaison (Phe23-Phe24), puis ils hydrolysent la caséine-β. Cette

dernière est néanmoins plus sensible à l’action de plasmides (BERTRAND, 1988,

GERMONVILLE, 2012).

En UREA-PAGE, les caséines majeures migrent suivant l’ordre croissant de leurs

mobilité comme suit : la caséine β (β-CN), les peptides issus de la dégradation de la caséine β,

la caséine αs1 (αs1-CN) et enfin, les peptides issus de la dégradation de la caséine αs1 : αs1-

CN(f102-199) et αs1-CN(f24-199) (MEYER et al., 1998 ; MEYER, 2001 ; FALLICO et al.,

2005 ; O’SULLIVAN et al., 2005). Les deux fragments issus de la dégradation de la caséine

αs1sont caractérisés par une vitesse de mobilité plus élevée que celle de la caséine αs1 native

(FALLICO et al., 2004). La présence de fragment de la caséine-αs1 (f24-199) dans les


62

premiers stades de l’affinage semble être liée au ramollissement de la pâte

fromagère (CREAMERE et OLSON, 1982).

Les différents électrophorégrammes obtenus pour les trois fromages sont présentés en

figures 21 pour la ficine, figure 22 pour la pepsine et figure 23 pour la présure.

Ils montrent la présence de trois bandes intenses au 1er

jour d’affinage ses bandes

présentent : la caséine β (β-CN), la caséine αs1 (αs1-CN) et le fragment αs1-CN (f24-199)

issu de la dégradation de la caséine αs1. Néanmoins à partir de 6ème

jour d’affinage nous

remarquons des différences au niveau de la protéolyse entre les trois fromages fabriqués.

Pour le fromage obtenu avec l’extrait de la ficine (figure 21) nous remarquons une

importante protéolyse de la caséine αs1 dès le 6ème

jour d’affinage avec disparition totale à

partir du 13ème

jour d’affinage. Cependant, la dégradation de la caséine-β reste lente jusqu’au

28ème

jour d’affinage où la protéolyse semble être importante. En plus du fragment peptidique

αs1-CN (f24-199), nous avons remarqué l’apparition d’un autre fragment peptidique issu de

la dégradation de la caséine αs1 qui est le fragment αs1-CN (f102-199). Ces deux fragments

sont dégradés au fur et à mesure que l’affinage des fromages avance.

L’activité protéolytique de la ficine a été signalée par plusieurs auteurs (WILLIAMS

et al., 1968 ; ONER et AKAR, 1993 ; FADYLOGLU, 2001 ; NOUANI et al., 2009). La

dégradation intensive de la caséine αs1 qui provoque le ramollissement des fromages

(CREAMERE et OLSON, 1982 ; SILVA et MALACATA., 2000), explique les résultats

obtenus pour la texture de fromage obtenu avec l’extrait de la ficine.


63

Figure n° 21 : profil électrophrètique sur UREA-PAGE des protéines du fromage issu

de la coagulation par l’extrait de ficine.

(β-CN : caséine β ; αs1-CN : caséine αs1 ; αs1-CN (f24-199): fragment issu de la dégradation de la caséine αs1 ;

- CN (f102-199) : fragments issus de la dégradation de la caséine αs1. J.1 : 1er


jour

d’affinage ; J.13 : 13ème



jour d’affinage et J.37 : 37ème

jour d’affinage).

Cependant pour le fromage issu de la coagulation avec l’extrait de la pepsine de

poulet le profil électrophorétique (figure 22) montre une hydrolyse totale de la caséine αs1 dès

le 6ème

jour d’affinage. En plus du fragment αs1-CN (f24-199) il y’a apparition d’un autre

fragment peptidique issu de la dégradation de la caséine αs1, il s’agit de αs1-CN (f102-199),

ces deux fragments sont dégradés à leur tour au fur et à mesure que l’affinage du fromage

avance.

Notons aussi une forte dégradation de la caséine-β ce qui montre l’importance de

l’action de la pepsine sur la caséine-β. L’activité protéolytique relativement excessive de la

pepsine de poulet pendant la maturation des fromages a été signalée par plusieurs auteurs

(GREEN, 1972 ; FINDLAY et al., 1984 ; RODNEY et EMSTROM, 1988 ZIKIOU, 2013).


64

Figure n° 22 : profil électrophrètique sur UREA-PAGE des protéines du fromage issu de la

coagulation par la pepsine du poulet.

(β-CN : caséine β ; αs1-CN : caséine αs1 ; αs1-CN(f24-199) et αs1- CN(f102-199) : fragments issus de la

dégradation de la caséine αs1. J.1 : 1er



jour d’affinage ;

J.20 : 20ème


jour d’affinage et J.37 : 37ème

jour d’affinage).

Cependant pour le fromage témoin (issu d’une coagulation par une présure d’origine

microbienne) (figure 23) nous remarquons une très faible protéolyse des caséines. En effet

l’électrophorèse à révélée une dégradation lente de la caséine αs1, et une stabilité de la

caséine β durant les 37 jours du suivi. Cette faible protéolyse explique la fermeté de la pâte et

la stabilité de la texture observée lors de l’affinage.


65

Figure 23 : profil électrophrètique sur UREA-PAGE des protéines du fromage témoin (issu

de la coagulation par une présure microbienne).

(β-CN : caséine β ; αs1-CN : caséine αs1 ; αs1- CN(f24-199) : fragment issu de la dégradation de la caséine αs1 .

J.1 : 1er

jour d’affinage ; J.6: 6ème



jour d’affinage ; J.28

: 28ème


jour d’affinage).

II.5.5.2. Evolution quantitative

La protéolyse est le principal phénomène biochimique qui se produit lors de l’affinage

des fromages, en plus du suivi électrophorétique des fractions protéiques insolubles à pH 4,6

la protéolyse, peut être estimée par le dosage des fractions protéiques solubles à pH 4,6.

Cette dernière permet de suivre l'évolution de la fraction protéique soluble à pH 4,6 par

rapport aux protéines totales. Cette mesure est souvent utilisée comme un indicateur du degré

de maturation des fromages (KUCHROO et FOX 1982 ; LABORDA et RUBIOLO, 1999 ;

SOSSA et al., 2001 ; SOUSA et McSWEENEY, 2001 ; VERDINI et al., 2003 ; O’REILLY et

al., 2003; GOROSTIZA et al., 2004).

L’évolution du taux des protéines solubles à pH 4,6 par rapport aux protéines totales

est présentée en figure 24.


66

Figure n° 24 : Evolution du taux de protéines solubles à pH = 4,6 par rapport aux protéines

totales des différents fromages au cours de l’affinage.

(F. ficine : fromage issu de la coagulation par l’extrait de la ficine ; F. pepsine : fromage issu de la coagulation

par la pepsine du poulet ; F. présure : fromage issu de la coagulation par la présure microbienne ; P.S./P.T. :

rapport protéine solubles à pH 4,6/protéines totales ; J.1 : 1er


jour d’affinage ; J.13 :

13ème




jour d’affinage).

Les résultats montrent une évolution progressive du taux des protéines solubles par

rapport aux protéines totales (P.S./P.T.) pendant l’affinage pour les trois fromages. En effet,

ce rapport passe de 9% lors du premier jour d’affinage pour atteindre 47% lors du 37ème

jour

d’affinage pour le fromage issu de la coagulation par l’extrait de la ficine. Alors que le rapport

entre les protéines solubles à pH 4,6 et les protéines totales obtenu dans les fromages issus de

la coagulation par l’extrait de la pepsine de poulet passe de 19% lors du premier jour

d’affinage à 55% lors du 37ème

jour d’affinage. Cependant dans les fromages témoins, obtenus

avec la présure microbienne, ce rapport passe de 8% au premier jour pour atteindre 34,5% au

37ème

jour d’affinage.

Les rapports P.S./P.T. obtenus dans notre étude sont élevés comparé aux rapports

motionnés par plusieurs auteurs. En effet, TSUDA et al., (1994) ont évalué ce rapport à

18,2% après 50 jour d’affinage du fromage Cheddar. Alors que SOSSA et McSWEENEY,

(2001) l’ont estimé à 18% à la fin d’affinage. Cependant MICHALSKI et al., (2003) ont

obtenus des rapports de 15% et 17% au bout de 30 jours d’affinage. Tandis que


67

O’SULLIVAN et al. (2005), ont obtenus une valeur de 18.2% et 20% pour les fromages

(camembert) issus de la coagulation par la présure de veau et les fromages obtenus par

l’extrait coagulant des gousses de la Grandine respectivement.

II.5.6. Evolution des caractéristiques organoleptiques

Le type de coagulation influe sur la qualité sensorielle finale du fromage

(GALLARDO-ESCAMELLA, 2005). Selon WALSTRA et al., (2006), l’agent coagulant

intervient dans la détermination des caractéristiques sensorielles finales des fromages.

Afin de déterminer les différences éventuelles qui peuvent exister entre les trois

fromages fabriqués par les agents coagulants étudiés, nous avons réalisé une série d’analyses

sensorielles pour suivre l’évolution des caractères sensoriels pendant l’affinage (du 1er

jour

jusqu’au 37ème

jour).

II.5.6.1. Le test de classement par rang

Le dégustateur est invité à classer les échantillons selon l'acceptabilité sans donner

d'égalité. Ce test à deux objectifs, le premier est de classer les fromages selon la préférence et

le second est de savoir si les dégustateurs peuvent discerner une différence entre les fromages.

L’analyse de la variance au seuil de signification de 5% montre que la différence est

non significative entre les trois fromages jusqu’au 13ème

jour d’affinage. Exception pour le

fromage issu de la coagulation par la pepsine et le fromage témoin. Cette différence devient

non significative au 37ème

jour d’affinage. Cependant la différence est non significative entre

le fromage issu de la coagulation par l’extrait de la ficine et le fromage témoin d’un coté et de

l’autre coté entre le fromage issu de la coagulation par l’extrait de la pepsine et le fromage

issu de la coagulation par l’extrait de la ficine. Ce résultat peut être expliqué par le fait que le

fromage issu de la coagulation par l’extrait de la ficine présente des caractéristiques

sensorielles intermédiaires.

Les dégustateurs ont classé les fromages par l’ordre d’appréciation suivant : le

fromage témoin (issu de la coagulation par la présure microbienne) suivi de fromage issu de la

coagulation par l’extrait de la ficine puis le fromage issu de coagulation par la pepsine du

poulet.

II.5.6.2. Le test d’intensité

Les résultats de l’analyse de la variance ANOVA pour le test d’intensité sont présentés

dans les tableaux de l’annexe.


68

L’analyse de la variance ANOVA au seuil de signification de 5%, n’a donnée aucune

différence significative entre les trois fromages fabriqués pour la plupart des attributs.

Cependant des différences de goût (amertume) sont perçues dès le 1er

jour pour les fromages

obtenus avec la pepsine de poulet et dès le 13ème

jour pour les fromages obtenu avec la ficine.

Pour la texture (texture lisse et moelleuse) les différences sont perçues dès le 6ème

jour

d’affinage pour les fromages obtenus avec la pepsine et dès le 13ème

jour pour les fromages

issus de la coagulation par la ficine.

Les figures suivantes représentent les profils sensoriels obtenus à différentes périodes

de d’affinage des fromages.

Figure n° 25 : Profil sensoriel des trois fromages au 1er

jour de fabrication.


69


jour d’affinage.


jour d’affinage.


70


jour d’affinage.


jour d’affinage.


71


jour d’affinage.

La texture

Pour la texture des fromages obtenus avec l’extrait de la ficine, nous avons remarqué

que les dégustateurs ont apprécié sa texture lisse qui est proche de celle du témoin, cette

texture lisse est due à la nature du caillé obtenu qui est caractérisé par de grains de taille

réduite. Dès le 13ème

jour d’affinage la pâte devient molle.

Pour la texture des fromages obtenus avec l’extrait de pepsine, les dégustateurs ont

constaté que la pâte été molle et qu’elle perd sa fermeté plus rapidement que les deux autres

fromages avec l’avancement du temps d’affinage. Ce résultat a été constaté par STANLEY et

al., (1980) et FINDLAY et al., (1984) dans leur travaux sur le fromage cheddar, ainsi que par

ZIKIOU, (2013) dans ses travaux sur le fromage à pâte molle type « Camembert » fabriqué

avec la pepsine.

Par contre, le fromage témoin est caractérisé par une pâte homogène et plus au moins

lisse et présente une texture plus ferme. En effet, le développement de la texture de ce

fromage pendant l’affinage est trop lent. Cette stabilité est due à la faible activité


72

protéolytique que possède la présure microbienne ainsi qu’à la spécificité de son action sur les

caséines.

Le gout

Les dégustateurs ont jugé que le goût des fromages obtenus par l’extrait de

ficine acceptable. Il est moyennement salé et acide avec un gout astringent relativement

toléré, cependant dés le 13ème

jour ils ont constaté un léger arrière goût d’amertume qui se

développe avec le temps d’affinage. Cette caractéristique a été constatée par plusieurs auteurs

dans les fromages fabriqués avec la ficine (FADYLOGLU, 2001 ; ONER et AKAR, 1993).

Concernent les fromages issus de la coagulation par l’extrait de la pepsine de poulet,

les dégustateurs l’ont jugé moyennement salé et acide mais avec une amertume très prononcée

dés le 6ème

jour d’affinage. Cette amertume peut être expliquée par l’activité protéolytique

élevée de la pepsine et la non spécificité de son action sur les caséines ainsi que la quantité de

la pepsine rajoutée au début de la fabrication. Cette amertume a été constatée par plusieurs

auteurs dans les fromages Cheddar fabriqués avec la pepsine de poulet (LEMIEUX et

SIMARD, 1991 ; FINDLAY et al., 1984; STANLEY et al., 1980).

La diminution de la quantité de l’enzyme utilisée et par conséquent, augmentation de

temps de coagulation pourrait probablement palier au problème d’amertume rencontré dans

les fromages fabriqués.

Le fromage témoin (issus de la coagulation par la présure microbienne), présente une

bonne stabilité de goût durant toutes les périodes d’affinage. En effet, il est considéré

moyennement salé et acide avec une absence totale d’amertume même après 37 jours

d’affinage.

La couleur et l’odeur

Du point de vu couleur et odeur, l’analyse de la variance à montrée qu’il n’existe

aucune différence entre les trois fromages obtenus avec différents agents coagulants (ficine,

pepsine et présure microbienne).

Au terme de cette étude sensorielle nous pouvons constater que les extraits étudiés

(ficine et pepsine), présentent des avantages qui leur permettent de remplacer la présure dans

la fabrication des fromages à pâte molle type « camembert ». En effet, les paramètres couleur

et l’odeur et à moindre degré goût et texture répandent aux exigences requises pour ce type de

fromage et sont poches de ceux du fromage témoin (présure microbienne).

Conclusion et

perspectives

Conclusion

73

Notre étude répond aux objectifs de l’équipe de recherche T.E.P.A. (L.N.T.A. de

l’I.N.A.T.A.A) par la contribution à la recherche des succédanés de présure utilisables

industriellement. Nous avons étudié la possibilité de substituer la présure par l’extrait brut de

ficine (d’origine végétale) et l’extrait clarifié de la pepsine de poulet (d’origine animale). Ces

deux extraits sont utilisés dans les pratiques traditionnelles pour la fabrication des fromages

(Agugli pour la ficine et Takammérit pour la pepsine).

Ce travail visait la caractérisation des deux agents coagulants proposés et tester la

possibilité de leur utilisation dans la fabrication de fromages. Notre démarche a comporté

deux étapes. Premièrement la récupération des matières premières renfermant les systèmes

enzymatiques recherchés, l’extraction des enzymes (ficine et pepsine de poulet) et la

caractérisation des extraits de point de vue activité et force coagulante et conditions optimales

d’activité (température, pH et [CaCl2]). En outre, l’étude de l’activité protéolytique et des

interactions impliquées dans la formation des gels issus de la coagulation par les extraits

étudiées par comparaison à la présure animale a été envisagée.

Deuxièmement, nous avons tenté une fabrication de fromage à pâte molle type

« Camembert » au niveau industriel en substituant l’agent utilisé par l’industrie (présure

microbienne) par l’extrait de ficine ou de pepsine en suivant le même diagramme de

fabrication. Pendant cette étape, nous avons étudié le rendement fromager, suivi l’évolution

de la protéolyse et situé les caractéristiques organoleptiques des fromages obtenus depuis la

fabrication jusqu’au 37ème

jour d’affinage par comparaison aux fromages témoins (fabriqué

avec l’agent coagulant microbien).

L’extraction nous a permis d’avoir des extraits enzymatiques de ficine et de pepsine de

poulet dont les caractéristiques sont respectivement les suivantes.

- une activité coagulante de 121,09 U.P., une force coagulante de 1/42059,76 et une

teneure en protéine de 89,31 mg/ml. Le rendement d’extraction est estimé à 71,42. Son

activité protéolytique est de 469,7 µg d’équivalant tyrosine/ml d’extrait enzymatique estimée

13 fois plus que celle de la présure évaluée à 35,75 µg/ml.

- une activité coagulante de 18,61 U.P, une force coagulante de 1/6041,64 avec un

rendement d’extraction de 84,43%. Son activité protéolytique est estimée à 117 µg/ml qui est

de 3 fois plus que celle de la présure animale.

Conclusion

74

- L’étude des conditions optimales d’activité a montré des différences de

comportement entre les trois extraits enzymatiques. Le pH optimal de coagulation pour

l’extrait de ficine et de pepsine est le même que celui de la présure évalué à 5. Pour la

température optimale de coagulation, les résultats obtenus révèlent une différence de

comportement entre les trois enzymes. En effet, l’optimum d’activité pour la ficine est obtenu

à une température de 75°C, la pepsine à 55°C et la présure à 50°C. Concernant la

concentration en chlorure de calcium, nous avons remarqué que l’optimum pour la ficine et la

présure est de 0,03 M, alors que pour la pepsine il est de 0,02 M.

- L’étude des interactions impliquées dans la formation et le maintien des gels par

utilisation d’agents dissociants a montré l’importance des liaisons hydrophobes, puis des

liaisons hydrogènes suivi des liaisons calciques. Les liaisons hydrophobes hydrogènes et

calciques sont plus abondantes dans les gels pepsine et présure comparées aux gels ficine.

- L’essai de fabrication d’un fromage à pâte molle type « Camembert » par utilisation

des extraits de ficine et de pepsine a donné un rendement plus faible pour les deux extraits

comparé à celui de la présure microbienne (33,25%, 37,82% et 38,41% pour les fromages

ficine, pepsine et présure microbienne°. Les fromages obtenus présentent des caractéristiques

organoleptiques assez proches de celles du fromage témoin, avec des distinctions quant à la

texture encore plus molle et le goût assez amer. L’ordre de préférence des fromages par les

dégustateurs est : le fromage témoin, le fromage à l’extrait de la ficine puis le fromage à la

pepsine. La protéolyse est plus avancée dans les fromages obtenus avec la pepsine et la ficine

que dans les fromages témoins.

Pour conclure, nous pouvons dire que les résultats obtenus semblent intéressants

d’autant qu’ils montrent la possibilité d’obtention des extraits enzymatiques capables de

remplacer la présure dans l’industrie fromagère en partant des pratiques traditionnelles. Ces

extraits sont obtenus à partir de matières assez disponibles et inexploitables.

Cependant il est intéressant de poursuivre ce travail par :

- L’étude des paramètres influençant l’extraction de ces deux enzymes afin

d’améliorer la qualité des extraits et le rendement d’extraction;

- La purification de ces enzymes afin d’envisager d’autres utilisation ;

- La possibilité d’utilisation des extraits de la ficine et de la pepsine dans la fabrication

pour d’autres types de fromages ;

Conclusion

75

- L’étude de leur effet sur la qualité des fromages obtenus par la caractérisation des

produits de dégradation obtenus lors de l’affinage.

Références

bibliographiques

Références bibliographiques

76

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Annexes

Annexes

Annexe 01 : extraction des enzymes

Extraction de la pepsine de poulet

Proventricule

Extraction de la ficine

Macération Broyage

Extrait de pepsine brut

Extrait de pepsine clarifié

Récupération de latex

Latex

Extrait brut de ficine

Annexes

Annexe 02 : étapes de la fabrication de Camembert

Salle de production de Camembert et

bassine de lait avant coagulation

Tranchage des coagulums obtenu

avec 1 : la ficine. 2 : la pepsine

de poulet.

de lait avant coagulation

Moulage Egouttage

Salage Egouttage

Les fromages obtenus après affinage

Annexes

Annexe 03 : Fiches de dégustation, résultats ANOVA et tableau statistique.

A. Fiches de dégustation

FICHE DU TEST DE CLASSEMENT PAR RANG

NOM :…………………………….

PRENOM :………………………..

DATE : ………………

Analysez et gouttez les trois échantillons, puis classez les par ordre croissant selon votre

préférence (attribuez 1 à l’échantillon que vous préfériez puis 2 et ensuite 3 pour le moins

apprécié).

Codes Classement

…………………. …………………..

…………………. ………………….

…………………. …………………..

Annexes

FICHE DU TEST D’INTENSITE

NOM :……………………………...

PRENOM :………………………… DATE : ………………...

Examinez et gouttez chaque un des trois échantillons, puis donnez une note

de 1 à 9 selon l’intensité de chaque caractère.

Si le caractère mentionné dans la fiche n’est pas détecté dans le produit,

vous mettez 0.

A B C

Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide

Gout d’astringence

Dispersion dans la bouche

Solubilité dans la bouche

Aspect crémeux

Annexes

B. Tableau statistique

Annexes

C. Résultats d‘analyse ANOVA

Tableau I : Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 1er

jour

Attributs F. Ficine F. Pepsine F. témoin

Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

4,20 a

4,90 a

4,80 a

3,50a

4,50 a

2,40 a

0,60 a

0,80 a

0,80 a

4,80 a

3,30b

2,40b

2,90 a

4,60 a

4,20 a

3,20 a

5,00a

4,00 a

5,60 a

4,60 a

5,30 a

3,70 a

1,00 a

0,50 a

1,90 a

4,80 a

6,00 a

5,00 a

2,90 a

4,90 a

5,50 a

4,30 a

4,30 a

5,60 a

4,40 a

3,80a

5,00 a

2,50 a

1,10 a

0,30 a

1,20 a

2,70b

2,80b

2,40b

3,10 a

4,00 a

4,50a

3,10 a

Tableau II: Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 6ème

jour


Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

3,70 a

3,40 a

6,50 a

3,40b

4,60 a

2,30 a

1,70 a

1,00 a

1,30 a

3,10 a

3,00b

2,60 a

2,70 a

4,10 a

4,70 a

3,10 a

5,30 a

4,90 a

3,90 b

7,00 a

6,10 a

3,20 a

0,90 a

1,10 a

2,50 a

3,40 a

7,40 a

4,00 a

4,60 a

5,90 a

6,00 a

4,70 a

5,10 a

3,20 a

6,30 a

3,90b

5,40 a

2,40 a

1,70 a

1,10 a

1,70 a

2,60 a

1,80b

2,10 a

2,60 a

4,10 a

4,70a

3,10 a

Annexes

Tableau III : Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 13ème

jour


Couleur

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

6,10 a

4,40 a

5,60 a

4,50 a,b

3,90 a

2,40 a

1,70 a

0,80 a

2,20 a

4,40 a

5,90 a, b

4,10 a

4,50 a

5,50 a

5,30 a

4,80 a

4,60 a

3,60 a

2,80 b

6,00 a

4,50 a

3,10 a

2,40 a

1,40 a

2,90 a

5,20 a

7,50 a

5,00 a

4,50 a

6,00 a

6,40 a

4,80 a

5,50 a

4,00 a

5,10 a

4,00 b

3,30 a

1,70 a

1,40 a

0,50 a

2,20 a

4,20 a

3,90 b

3,10 a

2,90 a

5,20 a

5,70 a

4,40 a

Tableau IV : Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 20ème

jour


Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

5,90a

5,30 a

5,80 a

5,33a

3,70 a

1,60 a

0,90 a

0,10 a

0,90 a

4,60 a

6,40 a

2,20 a

3,40 a

4,80 a

4,90 a

3,40 a

6,70 a

3,70 a

3,30 b

5,90 a

5,60 a

2,10 a

2,80 a

0,30 a

1,10 a

4,40 a

7,00 a

2,90 a

3,20 a

5,20 a

5,70 a

5,60 a

5,60a

4,50 a

5,90 a

3,20 b

4,20 a

1,30 a

1,10 a

0,20 a

1,20 a

3,80 a

2,10b

2,20 a

3,10 a

4,50 a

5,10 a

4,10 a

Annexes

Tableau V : Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 28ème

jour


Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

5,00 a

4,30 a

7,80 a

5,70a

3,20 a

2,40 a

1,40 a

1,00 a

1,40 a

4,20 a

6,70 a

3,70 a

4,20 a

4,50 a

4,00 b

2,30b

5,20 a

3,90 a

4,20 b

6,10 a

4,50 a

4,20 a

2,60 a

0,50 a

2,40 a

4,60 a

6,10 a

3,70 a

3,60 a

5,90 a

7,00 a

4,90 a

5,10 a

4,90 a

6,10b

3,90 b

4,10 a

3,50 a

2,00 a

0,90 a

1,50 a

3,80 a

2,50 b

3,30 a

2,40 a

4,50 a

4,50b

3,10 a, b

Tableau VI : Les notes des attributs sensoriels données aux différents fromages au 37ème

jour


Couleur jaune

Rugosité

Texture lisse

Texture moelleuse

Odeur lactique

Odeur de levure

Odeur animale

Odeur de l’herbe

Odeur de rance

Gout salé

Gout amer

Gout acide




Aspect crémeux

6,40 a

4,40 a

6,40 a

6,20 a

4,10 a

3,30 a

2,80 a

1,80 a

2,70 a

4,90 a

6,70 a

4,40 a

4,30 a

4,30 a

4,80 a

4,00 a

5,50 a

4,00 a

3,60 b

7,00 a

5,40 a

4,60 a

3,10 a

1,90 a

3,50 a

5,50 a

7,50 a

5,30 a

4,90 a

5,30 a

5,20 a

5,00 a

6,10 a

5,00 a

5,00 a

4,20 b

4,90 a

4,70 a

3,00 a

1,70 a

2,90 a

4,90 a

4,00 b

3,30 a

3,40 a

4,50 a

5,50 a

3,60 a

Annexes

Annexe 04 : production scientifique

Annexes

3ème

FORUM National Agro-Vétérinaire : Tiaret du 14 au 16 Mai 2014

Valorisation d’un sous produit de l’industrie avicole (proventicule de poulet) pour

l’extraction d’un agent coagulant (pepsine de poulet) en vue de son utilisation dans

l’industrie fromagère

SIAR E. H., DERRARDJA A., ZIKIOU A., FETOUHI A., ZIDOUNE M. N. - Contact : [email protected]

Laboratoire de Transformation et Elaboration des Produits Alimentaires (T.E.P.A.) de

l’I.N.A.T.A.A

Résumé

Les sous-produits de l’industrie avicoles peuvent constituer une source très importante en agents

coagulants utilisable en industrie fromagère comme succédané de la présure. La pénurie de présure et le coût très

élevé des importations ainsi que la dépendance de notre pays de fournisseurs étranger en matière

d’approvisionnement en présure et succédanés nous a poussé à chercher d’autres sources peu couteuse telle la

pepsine de poulet extraite à partir des proventricules et les enzymes connues dans nos pratiques traditionnelles.

Ces enzymes sont extraites sous forme de pepsinogènes, activés puis clarifiés par centrifugation. La protéase

obtenue est caractérisée par son poids moléculaire déterminé par une électrophorèse SDS-PAGE. La teneur en

protéine dans l’extrait clarifié, son activité coagulante, sa force de coagulation et son activité protéolytique sont

aussi évaluées pour permettre une comparaison à la présure. Le poids moléculaire de l’enzyme obtenue est

d’environ 35 KDa, avec une concentration en protéines de 20,10 mg/ml d’extrait, une activité coagulante de

18,61 UP/ml et une force de coagulation de 1/6041, l’extrait de pepsine clarifier de pepsine présente une activité

protéolytique 3 fois plus élevée que celle de la présure.

- Mots clés : proventricules ; agent coagulant ; pepsine ; présure.

mailto:[email protected]

Summary

The aim of the present work is the characterization of extracted ficin from fig latex

(Ficus carica) and the extracted pepsin from chicken proventriculus. This characterization

mainly targeted the determination of activity and coagulant force. Also, the proteolytic

activity and the types of interactions involved in the formation of gels in comparison with

animal rennet studied.

On the other hand, a test of the use of ficin and pepsin in the coagulation of the milk as

a substitute for rennet in the preparation of a soft cheese type "Camembert" was performed.

The main results obtained have shown that the extract of ficin exhibits coagulant

activity of 121,69 UP and a force coagulant 1/42059. For chicken pepsin coagulant activity is

18.61 UP and the force coagulant 1/6041. In addition, the proteolytic activity was estimated at

469.7 µg and 117 µg tyrosine equivalent per ml of enzyme for ficin and pepsin. The study of

the interactions involved in the formation of ficin and pepsin gels showed the preponderance

of hydrophobic bonds, followed by hydrogen bonds and the calcium bonds.

The soft cheeses type "Camembert" obtained with ficin, or pepsin presented large

similarities on the map color, smell and taste compared to control cheese (microbial

substitute). Nevertheless, some differences were found including the level of bitterness and

texture for both enzymes. We report on the other hand, that cheese yields are 33.25% and

37.82% in the case of ficin and pepsin respectively. These yields are relatively low compared

to the control cheese estimated at 38.41%.

These results reflect the ability to override the rennet by ficin and/or chicken pepsin in

the cheese manufacturing. However, this study deserves to be extended to other cheeses and

pursued for reason to improve yields and cheese quality.

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Key words: Ficin, pepsin of chicken, substitute for rennet, characterization, interactions, soft

cheese.

ملخص

Ficus)شجرة التين ل نسغ الكاملالمستخلص من الla ficine) ( فيسينال إنزيم الهدف من هذا العمل هو توصيف

carica )البيبسين إنزيمو(pepsine ) المستخلص من proventricules إلى تحديد أساسا يهدف هذا التوصيف . الدجاج

التي تشارك التفاعلات ومختلف (activité protéolytique)قوة إماهة البروتينات ت دراسة تمكما .تخثرنشاط و قوة ال

.(البريزور) نفحة الحيوانيةمقارنة مع الأ خثرة الحليب لفي تشك

في (présure)البريزور عنكبديل (ficine et pepsine )تم إستخدام الفيسين و البيبسين من ناحية أخرى ،

(. Camembert" ) كاممبير" انتاج جبن طري من نوع

و قوة UP 21..6. مستخلص الفيسين يمتلك نشاط تخثري يقدر بـ أن المحصل عليها أظهرت النتائج

بالإضافة .209/.تخثرو قوة U.P. 18.61 فقد سجلنا نشاط تخثري يقدر بـ بيبسين الدجاج فيما يخص . 96021/.تخثر

فيسين الببسين على التواليال منلكل مللتر من التيروزين µg 4..و µg 921.4 بـقوة إماهة البروتينات تإلى ذلك، قدر

.الحليب خثرة تكوين في الكالسيوم روابط و للماء الكارهة , الهيدروجين روابط أهمية التفاعلات دراسة أظهرت كما

تشابه كبير في اللون تأظهر و البيبسينفيسين ال نل عليها ممحصال" كاممبير " من نوعالأجبان الطرية

على بعض الاختلافات ت ملاحظة ومع ذلك تم . (بديل ذو أصل بكتيري)الشاهدة بالأجبان والرائحة والطعم مقارنة

٪ في حالة 24.76٪ و 22.62 يقدر بـ مردود سجلنا فقد من ناحية أخرى .ينالمرارة والملمس لكل من الانزيم مستوى

بقيمة الشاهد والذي هو الجبن التحكم هذا المردود يعتبر منخفض نسبيا مقارنة بمردود . على التوالي الفيسين و البيبسين

27.9. ٪.

ومع ذلك، .أو بيبسين الدجاج في صنع الجبن/ فيسين و ال البريزور بمستخلص هذه النتائج تعكس إمكانية استبدال

ل محصالجبن ال مردود ونوعية من أجل تحسينالسعي معلأجبان ا انواع أخرى من إلىينبغي أن تمتد الدراسة فإن هذه

. عليها

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.الطريالتفاعلات ، الجبن نفحة ، توصيف ، بيبسين الدجاج ، بدائل الأفيسين ، ال :دالةالالكلمات

Résumé

L’objectif du présent travail est la caractérisation de la ficine extraite du latex du

figuier (Ficus carica) et de la pepsine extraite des proventricules de poulet. Cette

caractérisation a visé principalement la détermination de l’activité et de la force coagulante.

Aussi, l’activité protéolytique et les types d’interactions impliqués dans la formation des gels

par comparaison à la présure animale ont été étudiés.

D’autre part, un essai de l’utilisation de la ficine et de la pepsine dans la coagulation

du lait en tant que succédané de présure pour la préparation d’un fromage à pâte molle type

« Camembert » a été réalisé.

Les principaux résultats obtenus ont montré que l’extrait de ficine présente une activité

coagulante de 121,69 U.P. et une force coagulante de 1/42059. Pour la pepsine de poulet

l’activité coagulante est de 18,61 U.P. et la force coagulante de 1/6041. En plus, l’activité

protéolytique a été estimée à 469,7 µg et à 117 µg d’équivalant tyrosine par ml d’enzyme

pour la ficine et la pepsine respectivement. L’étude des interactions impliquées dans la

formation des gels ficine et pepsine a montré la prépondérance des liaisons hydrophobes,

suivi des liaisons hydrogènes puis des liaisons calciques.

Les fromages à pâte molle type « Camembert » obtenus avec la ficine, ou la pepsine

ont présenté de grandes ressemblances sur le plan couleur, odeur et goût comparativement au

fromage témoin (succédané d’origine microbienne). Néanmoins, certaines différences ont été

constatées notamment au niveau amertume et texture pour les deux enzymes. Nous signalons

d’autre part, que les rendements fromagers sont de 33,25% et 37,82% dans le cas de la ficine

et de la pepsine respectivement. Ces rendements sont relativement faibles par rapport à celui

du fromage témoin évalué à 38,41%.

Ces résultats reflètent la possibilité de substituer la présure par l’extrait de la ficine

et/ou de la pepsine de poulet dans la fabrication des fromages. Cependant, cette étude mérite

d’être élargie à d’autres fromages et poursuivie en vue d’une amélioration des rendements

fromagers enregistrés et de la qualité des fromages obtenus.

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Mots clés : Ficine, pepsine de poulet, succédané de présure, caractérisation, interactions,

fromage à pâte molle.

Utilisation de la pepsine de poulet et de la ficine du figuier comme agents coagula

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Transcript of Utilisation de la pepsine de poulet et de la ficine du figuier comme agents coagula